Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

Miranda R. Lyons-Cohen; Seddon Y. Thomas; Donald N. Cook; Hideki Nakano

doi:10.3791/55465

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Artículo de método

Precisión de corte pulmón de ratón Rebanadas para visualizar las células en vivo pulmonar dendríticas

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DOI:

10.3791/55465

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5 de abril de 2017

Miranda R. Lyons-Cohen¹ , Seddon Y. Thomas¹ , Donald N. Cook¹ , Hideki Nakano¹

¹Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH

En este artículo

Resumen

Se describe un método para generar la precisión de corte de pulmón rebanadas (PCLS) y la inmunotinción ellos para visualizar la localización de diversos tipos de células inmunes en el pulmón. Nuestro protocolo se puede extender a visualizar la ubicación y la función de muchos tipos celulares diferentes bajo una variedad de condiciones.

Resumen

La inhalación de alérgenos y patógenos provoca múltiples cambios en una variedad de tipos de células inmunes en el pulmón. La citometría de flujo es una técnica poderosa para el análisis cuantitativo de proteínas de superficie celular sobre las células inmunes, pero no proporciona información sobre los patrones de localización y migración de estas células dentro del pulmón. Del mismo modo, los ensayos de quimiotaxis se pueden realizar para estudiar el potencial de las células para responder a factores quimiotácticos in vitro, pero estos ensayos no reproducen el complejo entorno del pulmón intacto. En contraste con estas técnicas antes mencionadas, la ubicación de distintos tipos de células dentro del pulmón puede ser visualizado fácilmente mediante la generación de corte de precisión de pulmón rebanadas (PCLS), la tinción con anticuerpos disponibles comercialmente, marcado con fluorescencia, y la visualización de las secciones por microscopía confocal. PCLS se pueden utilizar tanto para vivir y fijan el tejido pulmonar, y las rodajas pueden abarcar áreas tan grandes como una sección transversal de un lóbulo completo. Hemos utilizado este protocolo para visualizar correctamente la localización de una amplia variedad de tipos de células en el pulmón, incluyendo distintos tipos de células dendríticas, macrófagos, neutrófilos, células T y células B, así como células estructurales tales como linfático, endotelial, y células epiteliales. La capacidad de visualizar las interacciones celulares, tales como las que existen entre las células dendríticas y las células T, en el tejido pulmonar en vivo, tridimensional, puede revelar cómo las células se mueven dentro del pulmón e interactúan uno con el otro en el estado estacionario y durante la inflamación. Por lo tanto, cuando se utiliza en combinación con otros procedimientos, como la citometría de flujo y la PCR cuantitativa, PCLS puede contribuir a una comprensión global de eventos celulares que subyacen en las enfermedades alérgicas e inflamatorias del pulmón.

Introducción

Tras la inhalación de los estímulos pro-inflamatorias tales como lipopolisacárido (LPS), hay un movimiento coordinado de las células inmunes en, dentro de, y desde el pulmón. Por ejemplo, los neutrófilos se reclutan rápidamente en el parénquima pulmonar y de las vías respiratorias. Además, algunas células presentadoras de antígeno profesionales conocidas como células dendríticas convencionales (CDC) se someten a un patrón de migración relativamente complejo ^{^1,} ^2. CDC se pueden identificar utilizando la citometría de flujo, basadas en parte en su pantalla del marcador de la superficie, CD11c. Subconjuntos dist....