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Summary

Etiquetar el dominio extracelular de una proteína de membrana con un fluoróforo sensible al pH, superecliptic pHluorin (SEP), permite la localización subcelular, la expresión y el tráfico que se determinen. proteínas de imágenes SEP-etiquetado con total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (TIRFM) permite la cuantificación de los niveles de proteína en el ER y la membrana plasmática periférica.

Abstract

Entendiendo la trata de proteínas de membrana, reunión y expresión requiere un enfoque que distingue entre aquellos que residen en organelos intracelulares y aquellos localizados en la membrana plasmática. Las mediciones tradicionales basados ​​en fluorescencia carecen de la capacidad de distinguir las proteínas de membrana que residen en diferentes orgánulos. Metodologías de corte de borde trascienden los métodos tradicionales de acoplamiento fluoróforos sensibles al pH con microscopía de fluorescencia de reflexión total interna (TIRFM). TIRF iluminación excita la muestra hasta aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio-muestra, disminuyendo de este modo el fondo, el aumento de la relación señal a ruido, y la mejora de resolución. El volumen de excitación en TIRFM abarca la membrana plasmática y orgánulos cercanos, como la sala de emergencias periférica. Superecliptic pHluorin (SEP) es una versión sensible al pH de la GFP. Genéticamente que codifica septiembre en el dominio extracelular de una proteína de membrana de interés posiciona el fluoróforo enel lado luminal de la ER y en la región extracelular de la célula. SEP es fluorescente cuando el pH es mayor que 6, pero permanece en un estado apagado a valores de pH más bajos. Por lo tanto, los receptores de septiembre etiquetados con fluorescencia cuando residan en el retículo endoplásmico (ER) o después de la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando está confinado a una vesícula o el tráfico de otros orgánulos tales como el aparato de Golgi. El pH extracelular se puede ajustar para dictar la fluorescencia de los receptores en la membrana plasmática. La diferencia en la fluorescencia entre las imágenes TIRF a pH extracelular neutro y ácido para la misma célula corresponde a un número relativo de receptores en la membrana plasmática. Esto permite la medición simultánea de los receptores residentes intracelulares y de membrana plasmática. eventos de inserción individual de vesículas también pueden medirse cuando el pH extracelular es neutral, que corresponde a una vesícula de bajo tráfico de pH fusión con la membrana plasmática y la transición a un estado fluorescente. esta versatiltécnica e puede ser explotado para estudiar la localización, expresión, y el tráfico de proteínas de membrana.

Introduction

Los cambios en la expresión del receptor, la distribución, y el conjunto se han conectado a una amplia variedad de enfermedades, incluyendo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, fibrosis quística, y adicción a las drogas ^{1, 2, 3, 4, 5.} Por ejemplo, la nicotina y otros ligandos nicotínicos influyen en el tráfico de los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) que conducen a los cambios en el tráfico, la expresión y la regulación positiva ^{1, 2, 5, 6, 7, 8, 9, 10.} La nicotina aumenta el número total de nAChR ensamblados dentro de una célula, aumenta el tráfico hacia la membrana de plasma, unad altera el ensamblaje de las subunidades para favorecer una versión de alta sensibilidad de algunos subtipos. La resolución de distintos cambios en el tráfico, reunión y expresión de receptores en un modelo de enfermedad proporciona detalles mecanicistas cruciales que son esenciales para definir objetivos farmacológicos. Un enfoque ideal sería diferenciar rápidamente entre los receptores intracelulares y los localizada en la membrana plasmática. Esto es particularmente difícil en los casos en que una mayoría de una proteína particular reside intracelularmente, tal como con nAChR. Dado que la mayoría de nAChR se localiza en el retículo endoplásmico, las mediciones tradicionales tienen la resolución espacio-temporal necesaria para determinar los cambios de localización y de tráfico a lo largo de la vía secretora. Los estudios de tráfico de los receptores y la expresión de nAChR principalmente se han llevado a cabo mediante la unión de radioligando ^{11, 12} ensayos de biotinilación, Western Blot ^13, o TECHNIQ inmunoprecipitación UES ^12. Estos dependen de la especificidad de unión de una molécula indicadora o la fijación de las células y carecen de la capacidad de distinguir simultáneamente entre residente membrana plasmática y receptores intracelulares. Por lo tanto, los estudios de la dinámica de montaje de canales de iones y la vesícula se han basado en gran medida en las técnicas electrofisiológicas de bajo rendimiento ^14.

resolución espacial y temporal superior es posible con los avances en microscopía de fluorescencia. Las moléculas indicadoras genéticamente codificados, como la proteína verde fluorescente (GFP) y sus variantes, eliminar los problemas de unión no específica y aumentan la sensibilidad a ^15. Una variante sensible al pH de GFP, conocido como pHluorin superecliptic (SEP), se puede usar para explotar las diferencias de pH inherentes entre compartimentos dentro de una célula para determinar la localización ^{5, 7, 8,}ref "> ^{9, 16, 17, 18.} septiembre emite fluorescencia cuando el pH es superior a 6, pero permanece en un estado apagado a pH más bajo. Por lo tanto, los receptores etiquetados con septiembre de su lado luminal se detectan cuando está presente en el retículo endoplásmico ( ER) o tras la inserción en la membrana plasmática (PM), pero no cuando limita a una vesícula trata. la manipulación del pH extracelular en contacto con los receptores en la membrana plasmática en consecuencia, altera la fluorescencia y por lo tanto la detección de estos receptores. Si la misma célula se forma la imagen secuencialmente tanto a pH extracelular neutral y luego un pH inferior a 6, la diferencia entre las imágenes se atribuye a receptores situados en la membrana plasmática. Esto permite una medición simultánea de intracelular (ER periférica) y receptores de membrana residentes plasma ^{5, 7, 8} </sup> ^9. eventos de inserción individual de vesículas también se pueden resolver cuando el pH extracelular es neutral. Una vez que una vesícula de bajo tráfico de pH se fusiona con la membrana plasmática, el lado luminal de la vesícula se expone a la solución extracelular neutral, causando una transición detectada como una ráfaga de fluorescencia ^{7, 18, 19, 20.} Septiembre permite la medición de los receptores localizados en la membrana plasmática y retículo endoplasmático periférica, y proporciona un medio para medir el tráfico de los receptores entre estas regiones subcelulares ^{5, 7, 18.}

Para lograr una mayor resolución en la membrana plasmática, un receptor con la SEP codificados genéticamente se forma la imagen por microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM). Este método es particularmenteútil si la mayoría de los receptores están localizados en las regiones intracelulares, ya que TIRFM aumenta la visibilidad de la membrana plasmática. TIRFM también permite la resolución de la dinámica del tráfico de vesículas individuales que llevan receptores marcados SEP tras la inserción en el PM. La reflexión interna total se produce en la interfase de materiales con diferentes índices de refracción, como entre una célula y un cubre de vidrio ^{21, 22.} Septiembre emite fluorescencia cuando se irradia con 488 nm de excitación, que está orientada para alcanzar la reflexión interna total en la interfaz de la solución de vidrio y celular. Esto produce una onda evanescente que penetra aproximadamente 150 nm en la muestra, sólo fluoróforos emocionantes dentro de este volumen. Sólo septiembre que contiene los receptores en un entorno de pH neutro dentro de este rango de excitación son detectados, correspondientes a los que residen en la membrana plasmática o retículo endoplásmico periférica. Dado que la detección es t limitadoo la excitación por la onda evanescente, la fluorescencia de fondo de la región intracelular se reduce y la relación señal a ruido se aumenta ^{21, 22.} Además, ya que la radiación no penetra en la mayor parte de la célula, se minimiza el daño solar que permite imágenes de células vivas en el transcurso del tiempo. Como resultado, TIRFM acoplado con codificada genéticamente septiembre proporciona la requerida para la medición de localización subcelular y tráfico dinámica de los receptores de membrana a lo largo de la vía secretora de alta resolución y sensibilidad.

Protocol

1. Cultivo de células y transfección Mantener las células de neuroblastoma de ratón 2a (N2a) en medio de crecimiento. Hacer 500 ml de medio de crecimiento N2a de 200 ml de medio de Eagle de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucosa, 250 ml reducen medio de suero, 50 ml de suero fetal bovino (FBS), y 5 ml de penicilina / estreptomicina (100x). Mantener las células en un matraz T75 a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%. Dividir celdas 1:15 cuando sea necesario, o aproximadamente el 80-90% de confluencia. Esto es típicamente 2-3 veces a la semana. Escudo 35 milímetros de vidrio plato de fondo con poli-D-lisina. En una cabina de bioseguridad de flujo laminar, añadir 200 l de 0,1 mg / ml de poli-D-lisina sobre vidrio región inferior de plato estéril 35 mm. Introducir la cápsula en una incubadora a 37ºC durante 1 hora. Enjuagar cuidadosamente plato con ddH2O 3-4 veces. Deje secar la vajilla completamente seco durante más de 1 hora. Sterilize platos usando luz UV en la cabina de bioseguridad si es necesario. Placa células N2a para formación de imágenes TIRFM. Retirar el medio de crecimiento de células adherentes. Separar las células del matraz mediante incubación con 1 ml de 1x tripsina (+ EDTA) durante 5 min a 37 ° C en un incubador de CO2 5%. Inactivar la tripsina mediante la adición de 9 ml de medio de crecimiento. Mezcla de medios, tripsina, y células separadas utilizando una pipeta. contar visualmente células utilizando un hemocitómetro y calcular el volumen correcto de añadir 90.000 células a cada placa inferior de vidrio revestido con poli-D-lisina. Se requiere esta densidad para la transfección eficiente y sencillo de imágenes TIRF celular. Añadir 2 ml de medio de crecimiento para cada plato con fondo de vidrio que contiene 90.000 células. Incubar la placa a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 16-24 horas. transfección n2a Obtener una construcción de plásmido que contiene un fluoróforo septiembre incorporadoen la región extracelular de la proteína de interés. Técnicas de clonación estándar tales como la amplificación PCR 5 se pueden utilizar para generar la construcción. NOTA: septiembre debe ser incorporado en la región extracelular de la proteína de membrana de manera que reside en el lumen del retículo endoplasmático o el tráfico de vesículas y se expone a la solución extracelular cuando en la membrana plasmática. SEP es similar en tamaño a las estrategias de clonación similar GFP y se pueden utilizar. Reemplazar el medio de crecimiento en células cultivadas en placas con 1,5 ml de medio de suero reducido (por ejemplo, Opti-MEM), aproximadamente 30 min antes de la adición del reactivo de transfección. NOTA: Para el estudio de los cambios inducidos por fármacos en los receptores, una concentración apropiada de fármaco se puede añadir en el momento de la transfección. Añadir 500 ng de cada plásmido deseado construir a 250 l reducido medio de suero (tubo 1). Añadir 2 l de reactivo de transfección a un tubo separado containing 250 l de medio de suero reducido. Incubar el tubo 2 a temperatura ambiente durante 5 min. La proporción de reactivo de transfección con el plásmido de ADN debe ser optimizado para expresar cada proteína de interés. Combinar los tubos 1 y 2 para hacer una solución que contiene 500 l de reactivo de transfección y la mezcla de plásmido. Incubar a temperatura ambiente durante 25 min. Añadir los 500 l de mezcla de transfección las células pre-plateado para un volumen total de 2 ml por placa. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 horas. Después de 24 horas, retire la mezcla de transfección y aclarar las células con medio de cultivo y se añaden 2 ml de medio de crecimiento para cada plato. NOTA: Si un fármaco se añadió en el momento de la transfección, lo que se regenera de nuevo en este paso. Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5% durante 24 horas. celdas de imagen 48 horas después de la transfección. 2. Imágenes de células vivas por Total EnLa reflexión interna microscopía de fluorescencia (TIRFM) Imaging creó Realizar formación de imágenes con un microscopio de fluorescencia configuración invertida con una etapa de exploración, como se muestra en la Figura 1. Esto requiere la alineación de una fuente de láser DPSS 488 nm, un motor paso a paso para ajustar la posición del haz 488 nm, y una alta apertura numérica (NA 1,49) 60X o 100X objetivo de inmersión en aceite. Pasar el haz de láser a través del filtro de excitación apropiada (paso de banda de 488/10 nm). Alinear el haz láser polarizado a través de una fibra de modo único conectado a un lanzador montado en un motor paso a paso. En el modo de epifluorescencia, el haz de excitación está centrada en el centro de la abertura posterior de la objetivo. Para alcanzar TIRF, utilice el motor paso a paso para traducir el haz láser enfocado a través de la abertura posterior de la lente objetivo hasta que se alcanza el ángulo crítico y haz ya no se transmite a través de la muestra y es en lugar totalmente reflejada en el cristal-cell interfaz. Capturar imágenes utilizando un EMCCD (512 x 512 píxeles) controlado con software de imágenes (por ejemplo Metamorph) con el filtro de emisión apropiado montados en la trayectoria de las emisiones (525/50 nm). Preparar la solución de imagen Preparar 200 ml solución extracelular (ECS) mezclando NaCl 150 mM, KCl 4 mM, 2 mM MgCl2, 2 mM CaCl 2, HEPES 10 mM y glucosa 10 mM en ddH 2 O. soluciones madre de NaCl, KCl, MgCl 2, y CaCl 2 se puede preparar de antemano y se combina con HEPES frescas y de glucosa en el día de obtención de imágenes. Ajustar el pH de una solución que contiene 100 ml ECS a pH 7,4. Ajuste los restantes 100 ml de ECS a un pH de 5,4. Enjuagar las células transfectadas con 2 ml de ECS (pH 7,4). Añadir 2 ml de ECS (pH 7,4) a las células transfectadas antes de formación de imágenes. Imágenes de células vivas en TIRF Encienda todo el sistema, including 488 nm láser, cámara, etapa de traducción, y un programa de formación de imágenes. Enfocar el haz de epifluorescencia y ajustar la potencia de aproximadamente 1 mW en el objetivo 60X. Añadir el aceite con el objetivo y colocar una placa de células transfectadas en la etapa de traducción. Asegurar el plato en su lugar usando montajes etapa para asegurar que no se mueva con respecto a la etapa de lo que las células se pueden obtener imágenes múltiples veces. En el modo de epifluorescencia, enfocar el microscopio y localizar las células fluorescentes, transfectadas. Las células se mantendrán centrado la mayoría de planos de enfoque. Localizar las células individuales, aislados para continuar con TIRF. En el programa de imagen, ajustar el tiempo de exposición a 200 ms y optimizar la intensidad de fluorescencia mediante el establecimiento de la ganancia EM. Transición, el rayo láser en TIRF mediante la traducción del haz a través del objetivo de una manera por etapas usando el motor paso a paso. Cuando se acerca el ángulo crítico, el haz se traducirá visiblemente a través del borde del plato hasta que converge en el thletra e de la reflexión interna total en el plano de la muestra. Compruebe que los elementos están en modo TIRF ajustando el botón de enfoque. En TIRF, un solo plano de las células puede ser enfocada (es decir, aproximadamente 150 nm desde la interfaz vidrio), produciendo una imagen muy definida con alta resolución de la membrana plasmática. Imaging SEP para determinar la localización subcelular Localiza transfectadas, las células sanas, solo en el plano de la imagen. Adquirir una imagen enfocada de la célula a un pH de 7,4. Septiembre etiquetado receptores en la membrana plasmática y retículo endoplasmático debe ser visible. bloquear rápidamente el haz láser llegue a la muestra para evitar photobleaching. Memorizar las posiciones de platina correspondientes a cada celda utilizando el software de imágenes de microscopio capaz de grabar varias ubicaciones xy. Repita los pasos 2.4.1-2.4.4 de 20-30 células por placa, mientras que utilizando el software para grabar la posición de cada célula. after se recogen todas las imágenes de células a pH 7,4, quite manualmente la solución ECS pH 7,4 usando una pipeta. No toque el plato ya que esto podría mover las posiciones de platina memorizados. Añadir cuidadosamente 2 ml de pH 5,4 ECS al plato y esperar 10 minutos. Durante este tiempo, guardar las imágenes adquiridas previamente. Bajo el conjunto idéntico de condiciones utilizadas para recoger imágenes a pH 7,4, mueva el escenario para cada posición guardada y adquirir una imagen de la misma célula a un pH de 5,4. Las células deben verse menos definidas ya que todos fluorescencia detectada se origina a partir del retículo endoplásmico confinado septiembre receptores marcados. Guardar las imágenes de células pH 5.4. Eventos de inserción de imágenes de vesículas individuales en células vivas Reemplazar medio de crecimiento de las células transfectadas con 2 ml pH 7,4 ECS, o con L-15 de Leibovitz medios de comunicación. El pH de los medios de comunicación L-15 de Leibovitz es CO 2 independiente, lo que permite formación de imágenes se lleve a cabo durante un largo período de tiempo si es necesario. Place la placa de células transfectadas en la platina del microscopio. Asegurar y centrarse en una sola célula TIRF siguiente paso 2.3 anterior. Si lo tiene, ajustar el enfoque automático por lo que el foco no se mueve durante el período de formación de imágenes. Grabar una serie de 1.000 imágenes, capturando imágenes de forma continua a una velocidad de 200 ms. Ráfagas de fluorescencia serán visibles durante este tiempo, que corresponde a vesículas bajos de tráfico de pH de fusión con la membrana plasmática, la exposición de la SEP en el pH extracelular 7,4. Localiza otra celda individual y repita el paso anterior. Restablecer el enfoque automático si es necesario. Análisis 3. Imagen y Procesamiento de Datos El análisis de fluorescencia SEP para determinar la localización subcelular Abrir las imágenes de células usando un software de análisis de imágenes, tales como Metamorph o ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). Restar el fondo tanto de pH 5,4 y pH 7,4 imágenes usando el ajuste de balanceo de la bola. Utilice un umbral basado intensidad para cuantificar la fluorescencia de una sola célula. seleccionar manualmente una región de interés alrededor de la celda en la imagen de pH 7,4. Medir la superficie celular, intensidad media, y la densidad integrada usando un plugin de ImageJ o el uso de la función integrada "Medida" en la ficha Analizar. Repetir los pasos 3.1.1-3.1.3 para la misma célula a un pH de 5,4, ajustando cuidadosamente el umbral basado intensidad y región de interés de la misma manera. Después se obtiene la densidad integrada para imágenes de células tanto a pH 7,4 y 5,4, calcular la densidad integrada de membrana plasmática restando el valor de pH 5,4 a partir de la 7,4 valor de pH. La diferencia corresponde a los receptores número relativo sobre la membrana de plasma dentro de la región TIRF de excitación. Como una medida de tráfico, calcular el porcentaje relativo de la SEP receptores situados en la membrana plasmática marcada en comparación con los receptores restantes visibles en las excitati TIRFen el volumen dividiendo la membrana plasmática densidad integrada por la densidad total integrada a pH 7,4, multiplicado por 100. El análisis de los eventos de inserción sola vesícula Abrir la serie de 1.000 imágenes TIFF utilizando el software de análisis de imágenes. Restar el fondo de todas las tramas utilizando el ajuste de balanceo de la bola. Ajustar el balance de color de la grabación para maximizar regiones intensos correspondientes a los eventos de inserción de la vesícula. contar manualmente las ráfagas de fluorescencia que duran más de 3 cuadros (> 600 ms).

Representative Results

Septiembre incorporación en un receptor permite la detección directa de que el receptor en una célula viva. Junto con TIRFM, esto permite la evaluación de los niveles relativos de expresión en la membrana plasmática y la distribución de los receptores dentro de las ubicaciones subcelulares en la región de TIRF de excitación. eventos individuales tráfico de vesículas también pueden ser resueltos. Los niveles relativos …

Discussion

La sensibilidad al pH de la SEP permite receptores que residen en la membrana plasmática a distinguirse de los receptores intracelulares en el retículo endoplásmico, y se puede utilizar para resolver los eventos de inserción de receptor de transporte de vesículas ^{5, 7, 8, 9, 18, 19, 20}…

Materials

Reagent/Material
Cell Culture Flasks with Filter Cap, Sterile, Greiner Bio One, 75 cm^2	VWR	82050-856
35 mm glass bottom petri dishes, sterile	Cell E&G	GBD00002-200
Poly-D-lysine	vwr	215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium‎ (DMEM), High Glucose	Fisher Scientific	11-965-084
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	Gibco / Fisher Scientific	31-985-088
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin, Standard (Sterile-Filtered)	Gibco / Fisher Scientific	16-000-044
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Fisher Scientific	12604-021
Penicillin-Streptomycin Solution	VWR	45000-652
Leibovitz's L-15 Medium, no phenol red	Gibco / Fisher Scientific	21083027	Optional
Lipofectamine	Fisher Scientific	11668030	Gently mix; Do not vortex
Sodium chloride	Fisher Scientific	BP358-1
Potassium chloride	Fisher Scientific	P217-10
Magnesium chloride	Fisher Scientific	BP214-500
Calcium chloride	Fisher Scientific	C79-500
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500
D-Glucose	Fisher Scientific	D16-1
Objective immersion oil	Olympus	Type F
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Microscope	Olympus	IX81
Camera	Andor	iXon Ultra 897
60x, 1.49 NA oil immersion objective	Olympus	APON 60XOTIRF
Motorized stage	Prior	IXPROXY
Motorized actuator (stepper motor)	Thorlabs	ZST213
MetaMorph (or other imaging program)	Metamorph
488 nm laser	Market Tech
Single mode fiber	Thorlabs	SM450
Mirrors	Thorlabs	BB1-E01
Dichroic 488 nm LP	Semrock	Di02-R488-25×36
Bandpass filter, 488 nm	Semrock	LL01-488-12.5
Bandpass filter, 525/50	Semrock	FF03-525/50-25