Artículo de método

Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus

DOI:

10.3791/55483

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15 de junio de 2017

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1Department of Frontier Health Sciences, Graduate School of Human Health Sciences, Tokyo Metropolitan University, 2Department of Anatomy, Tokyo Medical University, 3Area of Regulatory Biology, Division of Life Science, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University

En este artículo

Resumen

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Un enfoque inmunohistoquímico de montaje completo, para visualizar la expresión de la proteína neurofilamento en el tracto biliar extrahepático en Suncus murinus. Se presenta aquí. Este protocolo se puede utilizar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales en S. murinus u otras especies.

Resumen

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Este trabajo describe el método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo en detalle, usando anticuerpos de proteína de neurofilamento para marcar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus ( S. murinus   ). En primer lugar, se disecó el espécimen de S. murinus y se fijó en paraformaldehído al 4% (PFA). En segundo lugar, se realizó un tratamiento enzimático y la inactivación potencial de la peroxidasa endógena. La muestra se expuso entonces al anticuerpo primario, anticuerpo de proteína anti-neurofilamento, durante 3-6 días. A continuación se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción de color se reveló haciendo reaccionar la muestra con un sustrato de 3,3'-diaminobencidina (DAB). Este método se puede aplicar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales. Además, este protocolo también puede adaptarse para probar otros anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerposDebe hacerse primero. Este método fue introducido originalmente por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .

Introducción

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La musaraña almizcle, Suncus murinus , pertenece a la orden Insectivora y la familia Soricidae. Este diminuto mamífero se distribuye por todo el sudeste asiático y habita en casas y zonas de césped situadas cerca de viviendas humanas o corrales de ganado 4 . Esta especie presenta características morfológicas generales más similares a las humanas que otros animales de laboratorio, como el ratón, la rata y el conejo 5 . Anteriormente, se utilizó inmunotinción de montaje completo con un marcador de neurona periférica para la proteína del neurofilamento de S. murinus (NFP) para marcar los nervios periféric....

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Protocolo

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Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Metropolitana de Tokio (IACUC). Los animales fueron alojados y manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Utilizamos animales criados y mantenidos en el Laboratorio de Morfología Funcional, Departamento de Ciencias de la Salud Fronteriza, Universidad Metropolitana de Tokio, Japón.

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Resultados

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Las Figuras 1 - 4 muestran resultados típicos para fibras nerviosas NFP-positivas en el tracto biliar extrahepático en S. murinus . El anticuerpo contra la NFP identificó de forma reproducible la inervación en toda la imagen del tracto biliar extrahepático ( Figura 1 ), la vesícula biliar ( Figura 2 ), el conducto biliar superior ( Figura 3 ) y el área de l.......

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Discusión

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Este trabajo describe el procedimiento experimental para la visualización de la inervación del tracto biliar extrahepático utilizando un anticuerpo contra la proteína neurofilamento. Este protocolo fue adaptado a partir del protocolo descrito por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .

Para este experimento, planifique la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, ya que el enfoque de tinción de monta.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

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Los autores no tienen reconocimientos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
ácido ortoperiódicoWako162-00732
papaínaWako164-00172
albúmina sérica bovina (BSA)Wako010-15131
azida sódicaNacalai Tesque312-33
anticuerpo de proteína de neurofilamento (NFP)DakoM0762, lote 089, clon: 2F11
conjugado con peroxidasa purificado por afinidad ovejas anti-ratón IgG-HRPMBLCódigo 330
3,3'-diaminobenzidina tetraclorhidrato (DAB)Wako349-00903 imidazol
SigmaI-0125

Referencias

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  1. Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method. Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).
  2. Kuratani, S., Tanaka, S.

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Etiquetas

Whole mount ImmunohistochemistryBiliary Tract InnervationSuncus murinusNeurofilament Protein AntibodyEnzymatic TreatmentDAB Substrate ReactionNeoprene Latex LabelingPBS WashesTriton X 100 IncubationSucrose Freeze thaw

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