Aplicación de la codificados genéticamente fluorescente óxido nítrico (NO •) Probes, los geNOps, para imágenes en tiempo real de NO • Las señales en las células individuales

Resumen

Este manuscrito presenta protocolos para la aplicación de nuevas sondas de óxido nítrico (NOps) codificadas genéticamente para monitorear las fluctuaciones de NO• de una sola célula en tiempo real utilizando microscopía de fluorescencia. La formación de NO• desencadenada por Ca²⁺ a nivel de células endoteliales individuales se visualizó combinando geNOps con un sensor químico de Ca²⁺.

Resumen

El óxido nítrico (NO •) es un pequeño radical, que media varias funciones celulares importantes en mamíferos, bacterias y plantas. A pesar de la existencia de un gran número de métodos para la detección de NO • in vivo e in vitro, la monitorización en tiempo real de NO • a nivel de células individuales es muy difícil. Los efectos fisiológicos o patológicos de NO • están determinadas por la concentración real y tiempo de permanencia de este radical. En consecuencia, los métodos que permiten la detección de una sola célula de NO • son altamente deseables. Recientemente, hemos ampliado la paleta de NO • indicadores mediante la introducción de óxido de un solo fluorescente basada en la proteína codificada genéticamente sondas nítrico (NO •) (geNOps) que responden directamente a las fluctuaciones celulares NO • y, por lo tanto, se dirige a esta necesidad. Aquí se demuestra el uso de geNOps para evaluar intracelulares NO • señales en respuesta a dos química diferente NO • moléculas -liberating. Nuestros resultados del also confirman que recién preparada 3- (2-hidroxi-1-metil-2-nitrosohydrazino) -N-metil-1-propanamina (NOC-7) tiene un potencial mucho más alto para evocar el cambio en intracelulares NO • niveles en comparación con el inorgánica • NO nitroprusiato de sodio donante (SNP). Por otra parte, de dos colores imágenes de células vivas utilizando los geNOps verdes (G-GENOP) y el indicador químico ^de Ca2 ⁺ fura-2 se realizó para visualizar la regulación estricta de Ca ^{2 +} dependientes ^de NO • formación en las células endoteliales individuales. Estos experimentos demuestran que geNOps representativos son herramientas adecuadas para investigar la generación en tiempo real y la degradación de una sola célula de NO • señales en diversos montajes experimentales.

Introducción

Recientemente, hemos desarrollado una nueva clase de fluorescentes • NO sondas codificados genéticamente, llamado los geNOps ^1. Estos sensores consisten en una simple construcción, derivados de bacterias, NO • dominio de unión ^2, que está conjugado a una proteína fluorescente diferente (FP) variante ³ (cian, verde o naranja FP). • NO se une al núcleo de hierro no hemo (II) ⁴ dentro de los geNOps reduce instantáneamente la intensidad de fluorescencia ^1. Es importante destacar que la fluorescencia geNOps recupera rápida y completamente cuando intracelulares NO • ¹ niveles disminuyen. En consecuencia, geNOps permiten imágenes en tiempo real de los (sub) celulares NO • fluctuaciones. Aunque el mecanismo de NO • detección de geNOps siguen sin estar claros hasta ahora, han demostrado ser excelentes NO • reporteros, y por lo tanto tienen la potencia para abrir una nueva era de policromática, cuantitativa NO • bioimaging con una alta resolución espacial y temporal ^{1, 5.} Otros disponible fluorescentes NO • sondas se basan en compuestos químicos pequeños, que necesitan ser cargados en las células, y están irreversiblemente modificados por NO • ^6. Otras desventajas de NO • pequeñas fluoróforos sensibles son su potencial citotoxicidad y especificidad relativamente baja, que hacen que sea difícil de usar de una manera fiable, de análisis y concluyente ^{7, 8, 9.} Aunque el uso eficaz de sondas fluorescentes codificadas genéticamente requiere técnicas de transferencia génica eficaz, sensores codificados genéticamente basados en FP se han convertido en herramientas indispensables que han revolucionado nuestra comprensión del funcionamiento interno de las células ^{10, 11.} Antes del desarrollo de los geNOps individuales basados ​​en FP, un Förster transferencia de energía de resonancia (FRET) a base de NO • sensor, referido como NOA-1 ^12, se construyó. Sato et al. diseñó esta sonda sofisticado que consiste en dos subunidades de la NO • -sensible guanilato ciclasa soluble (sGC), ambos conjugados sensores basados en FRET a informes de guanosina monofosfato cíclico (GMPc) ¹² niveles. Como esta sonda responde a GMPc, que sólo indirectamente detecta intracelulares NO • fluctuaciones ^12. Aunque NOA-1 responde a NO • elevaciones en el rango nano-molar, esta herramienta no se ha utilizado con frecuencia hasta ahora, probablemente debido a las limitaciones en cuanto a la disponibilidad y viabilidad de este sensor bipartita voluminosos.

Funciones versátiles de NO •, que impacto fundamental procesos biológicos se han caracterizado bien ^{13, 14.} Muchos estudios han demostrado que el NO • concentration dentro de las células y subdominios determina el destino celular en la salud y enfermedades ^{14, 15, 16.} En los mamíferos, NO • es principalmente generado enzimáticamente en varios tipos de células de la familia bien caracterizado óxido nítrico sintasa (NOS) ^17. Hasta el momento, tres isoformas de NOS se han descrito ^{18, 19, 20;} estos son el Ca ^{2 +} endotelial / calmodulina dependiente de la NOS (eNOS o NOS-3) ¹⁸ y la NOS neuronal (nNOS o NOS-1) ^19, y el Ca ^{2 +} / calmodulina independiente constitutivamente activa NOS inducible (iNOS o NOS- 2) ^20. Por otra parte, la existencia de mitocondrial NOS (mtNOS) También se ha sugerido ^21. Sin embargo, mtNOS se considera como una variante de empalme de nNOS, y por lo tanto no está clasificado por separado como una isoforma ^21. Otra isoforma, aparte de los de las células de mamífero, es el llamado NOS bacteriana (bNOS), que se encuentra principalmente en bacterias gram-positivas ^22. La producción enzimática de NO • es altamente controlada y depende de la disponibilidad de varios cofactores tales como nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH), flavina adenina dinucleótido (FAD), tetrahidrobiopterina (BH4), oxígeno molecular y L-arginina ^17. La catiónico aminoácido L-arginina es el sustrato que se convierte en L-citrulina en NO • producción ^17. Además de la generación enzimática altamente regulado de NO •, se ha postulado que el radical se puede reducir no enzimáticamente a partir de mezclas de nitrito por las mitocondrias en condiciones de hipoxia ^23. Una vez NO • se produce dentro de una célula, se puede difundir libremente a través de las biomembranas ^14,ref "> 15. Sin embargo, la media muy corta vida de este radical está determinada principalmente por las condiciones ambientales, y las diversas vías y reacciones químicas se degradan de manera eficiente NO • Los niveles de ^24. Con el tiempo, la formación, la difusión y la degradación de NO • depende en diversos parámetros ambientales que determinar la concentración efectiva de la molécula altamente biológicamente activo ^24.

La tecnología geNOps permite la detección directa de (sub) celular NO • fluctuación ¹ y por lo tanto es adecuado para volver a investigar, y recientemente descubrir los mecanismos responsables de la acumulación y descomposición de celulares NO • señales. A continuación, ofrecemos protocolos sencillos y resultados representativos para el uso de geNOps de visualizar de forma exógena evocado y perfiles • NO generados de forma endógena, en el nivel de células individuales. Además, la tecnología geNOps puede ser adaptado para applicatura en otros sistemas modelo celular para el estudio de los complejos patrones de NO • formación, difusión y degradación en respuesta a diversos estímulos celulares y tensiones.

Protocolo

1. Preparación de tampones y soluciones químicas

1. Preparar un tampón de almacenamiento que contiene NaCl 135 mM, KCl 5 mM, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 2,6 mM _{de NaHCO3,} 0,44 mM KH ₂ PO _4, 0,34 mM Na ₂ HPO _4, mM D- 10 glucosa, 2 mM L-glutamina, vitaminas MEM 1x, 1x MEM ácidos aminados, 1% strep pluma, y ​​1% de anfotericina B. Disolver todos los componentes en agua destilada y agitar el tampón durante 20 minutos usando un agitador magnético a temperatura ambiente. Ajustar el pH a 7,44 con NaOH 1 M. Después de la adición gota a gota de NaOH, medir el pH con un medidor de pH mientras se agita continuamente.
2. Preparar un tampón de Ca ^{2 + que} contienen fisiológico que consiste en NaCl 140 mM, KCl 5 mM, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM D-glucosa, y HEPES 10 mM. Ajustar el pH a 7,4 usando NaOH como se describe en el paso 1.1.
3. Preparar un tampón libre de Ca ^{2 +} que consiste en los mismos ingredientescomo se indica en el paso 1.2. Utilice EGTA 1 mM en vez de 2 mM.
4. Solubilizar Fura-2AM en DMSO para obtener una solución madre de 1 mM. Alícuota de la solución madre en frascos herméticamente cerrados y se almacena a -20 ° C durante un máximo de un mes. Si se congela, deje que la solución madre se equilibre a temperatura ambiente durante al menos 1 hora protegido de la luz. Diluir la solución madre de Fura-2AM en 1 ml tampón de almacenamiento (paso 1.1) para obtener una concentración final de 3,3 mM.
5. Preparar 1 ml de una solución de histamina de stock 100 mM en agua destilada (pH 7,0). Diluir la solución de histamina de stock 100 mM en 100 ml Ca ^{2 + que} contienen tampón fisiológico a una concentración final de 100 mM de histamina.
6. Solubilizar Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) en 100 ml de tampón fisiológico que contiene calcio para obtener una concentración final de 300 mM. Almacenar las soluciones a 37 ° C baño de agua durante al menos 1 hora hasta que la L-NNA se disuelva por completo.
7. Solubilizar 10 mg NOC-7 en wa destiladater (pH 7,0) para obtener una solución madre 10 mM. Alícuota de la solución madre en pequeñas alícuotas en viales herméticamente cerrado y de inmediato a -70 ° C. Diluir la solución madre NOC-7 en un tampón fisiológico para obtener una concentración final de 10 mM NOC-7.
   NOTA: NOC-7 es un compuesto químico pequeño que libera espontáneamente NO con una vida media corta. Siempre preparar los tampones de trabajo que consiste NOC-7 justo antes de cada experimento.
8. Hacer una solución 1 mM nitroprusiato de sodio (SNP) en un tampón de calcio fisiológico y preparar una dilución de 10 mM.
   NOTA: Siempre preparar pequeñas cantidades (~ 10 ml) de soluciones de donador de NO, debido a la tasa de degradación rápida.
9. Preparar una solución de fosfato tamponada (PBS) que consiste en NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 9,2 mM Na ₂ HPO _4, y 1,5 mM KH ₂ PO _4. Ajustar el valor del pH a 7,44 con NaOH / HCl.

2. Preparación de la célula

NOTA: En Order para lograr uniformidad en el rendimiento de la medición de óxido nítrico (NO •) en células individuales utilizando geNOps, las células tienen que ser pre-incubadas con un hierro (II) / vitamina C que contiene tampón antes de los experimentos de formación de imágenes con el fin de restaurar Fe ²⁺ dentro del NO • unión a dominio del NO • -probes. En el caso de las células HEK293 y EA.hy926, la incubación durante 20 minutos con la solución de refuerzo de hierro (II) conduce a la plena activación de los sensores • NO.

1. Sembrar 5,5 x 10 ⁵ células HEK293 EA.hy926 o para el día siguiente o 3,5 x 10 ⁵ células para el día después del día siguiente, el cubreobjetos de microscopio de 30 mm en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Se incuban las células a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO _2.
   NOTA: La información detallada con respecto a la infección viral de las células de mamíferos y construcción virus ha sido descrito por Zhang et al. ^25. Este paso no se aplica para las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP.
2. Tome suero fetal de ternera (FCS) y Medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) libre de antibióticos y añadir adeno-asociado virus de tipo 5 vector (AAV5) que lleva el gen que codifica para G-GENOP (MOI: 500 para las células EA.hy926 rendimiento casi 100 % de células positivas; MOI: 1 es eficiente para las células HEK293).
   NOTA: El uso de vectores virales adeno-asociado se le asigna al grupo de riesgo en general, se requiere 2. Bioseguridad Nivel 2 de contención para el trabajo con este vector. Si es necesario, la infección por virus también se puede realizar en FCS que contienen medio. Alternativamente, las células pueden ser transfectadas transitoriamente utilizando portadores basados en lípidos ^1.
3. Retire el medio de cultivo y lavar las células con pre-calentado (37 ° C) de PBS. Añadir 1 ml de medio DMEM / AAV5 en cada pocillo durante 1 hr. Este paso no se aplica para las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP.
4. Añadir 1 ml de 20% de FCS que contiene DMEM en cada pocillo a una concentración final de 10% de FCS. No retire los medios de AAV5 que contiene de las células. CaballeroLy sube y baja la placa de homogeneizar el medio dentro de los pozos. Se incuban las células durante 48 horas a 37 ° C en un ambiente humidificado con 5% de CO _2. Este paso no se aplica a las células HEK 293 que expresan de forma estable G-GENOP.
5. Después de 48 horas, lavar las células con PBS precalentado. Posteriormente se añaden 2 ml de pre-calentado tampón de almacenamiento (punto 1.1) a cada pocillo e incubar las células en el sitio de la temperatura ambiente durante al menos 1 hora protegido de la radiación de luz.
6. Reemplazar el tampón de almacenamiento con 1 ml / pocillo de la solución de refuerzo de hierro (II) a temperatura ambiente (RT). Se incuban las células durante exactamente 20 min en la oscuridad.
   NOTA: No superar o reducir el tiempo óptimo de incubación ya que esto podría afectar a la capacidad de respuesta de las sondas • NO.
7. Lavar las células una vez con tampón de almacenamiento y se incuba cada pocillo con tampón de almacenamiento de 2 ml durante al menos 2 horas a RT con el fin de permitir que las células se equilibren.
8. Reemplazar el tampón de almacenamiento con 3,3 M Fura-2AM en tampón de almacenamiento 1 ml durante 45 minutos a RT, protegidode la luz.
9. Lavar las células dos veces con tampón de almacenamiento y se incuba, una vez más durante al menos 30 min con el fin de permitir que las células se equilibren.

3. Imágenes de células vivas de NO • y Ca ^{2 +} señales en las células individuales

1. Fijar una hoja de cubierta 30 mm revestido con células HEK293 o EAhy.926 (desde el paso 2.1) en una cámara de perfusión de metal y colocarlo en el microscopio. Conectar el tubo de afluencia a los depósitos tampón y el flujo de salida a una bomba de vacío. Asegurar un flujo constante y evitar que se descargue de la hoja de la cubierta.
2. Iniciar la perfusión por gravedad con tampón de calcio fisiológico (de la etapa 1.2), utilizando un sistema de perfusión semi-automática.
   NOTA: Tal sistema consiste en depósitos de tampón, la tubería respectiva, válvulas magnéticas que se controlan electrónicamente y una bomba de vacío (véase la Figura 1B). La velocidad de flujo puede variar de 1 a 3 ml / min, dependiendo de la altura de los depósitos de perfusión. Para apli droga locales consistentescatiónico, la velocidad de flujo de todos los depósitos utilizados debe ser aproximadamente igual. Esto debe ser probado antes de los experimentos de imagen. Considere que las células endoteliales responden a un aumento de la tensión de cizallamiento que puede ser inducida por perfusión riguroso.
3. Encienda el sistema de imagen y dejar que se caliente de todos los dispositivos durante 30 minutos.
4. Definir la configuración de imagen utilizando el software respectivo. Seleccionar de excitación de longitud de onda 340 nm y 380 nm para fura-2 de formación de imágenes y 480 nm para la excitación de G-GENOP. Para minimizar la decoloración de fluorescencia aumentar el binning cámara a 4 y reducir las intensidades de excitación y tiempos de exposición. Ver también los pasos 3.6 a 3.8.
   NOTA: Los ajustes de imagen y parámetros dependen de los dispositivos utilizados, fura-2 eficiencia de carga y los niveles de expresión de G-GENOP.
5. Seleccione la región de imagen moviendo el xyz-mesa del microscopio hasta varias células fluorescentes están en el foco. A continuación, definir regiones de interés (ROI) a través de la herramienta de software respectivo. Dibujar regiones que abarcan varios cabeza del c enterae células fluorescentes por campo de la imagen manualmente. Además, definir una región de fondo de tamaño similar.
   NOTA: una vez que las imágenes han sido adquiridos y almacenados ROIs también se puede definir nuevamente después del proceso de formación de imágenes para su posterior análisis usando software de análisis de imágenes respectiva (ver Lista de Materiales).
6. Comience a recoger datos en un microscopio de fluorescencia invertido y avanzada con una etapa de la muestra motorizada, y una fuente de luz monocromática. Alternativamente excitar a 340 nm y 380 nm para Fura-2AM y 480 nm para G-GENOP, respectivamente. Establecer tiempos de exposición respectivos de modo que para todos los canales, una señal de fluorescencia clara es detectable en el tiempo. Véase también el paso 3.4.
   NOTA: Esto depende de la intensidad de la luz de excitación y el binning cámara. Por ejemplo, utilizar el 15% de intensidad de la luz de excitación, una cámara de intervalos de 4 y 150 ms para 340 nm, 50 ms para 380 nm y 300 ms para 480 nm. Véase también el paso 3.4.
7. Recoge la luz emitida a 510 nm para fura-2 / AM, 520 nm para el G-genop usando un dispositivo de cámara de carga acoplada (CCD) con el correspondiente juego de filtros que consiste en el excitador 500 nm, un dicroico de 495 nm y 510-520 nm emisor. Grabar un total de cuadros de cada 3 s.
8. Registrar los primeros minutos (si es necesario hasta 3 min) en tampón fisiológico ^de Ca2 ⁺ (1,2) para obtener la línea de base de las señales de fluorescencia en el tiempo respectivos.
9. Una vez que se observa una fluorescencia de línea de base estable, cambiar a 100 histamina M o ATP (1 mM o 100 mM) que contiene tampón fisiológico Ca ²⁺ para estimular las células para 3 min.
   NOTA: Las células EA.hy926 que responden a los agonistas muestran un fuerte aumento de la proporción de fura-2 (fluorescencia excitada a 340 nm dividida por la fluorescencia excitada a 380 nm) y una clara disminución de la señal de fluorescencia G-GENOP.
10. Cambie de nuevo a la fisiológica tampón ^de Ca2 ⁺ y sin histamina o ATP y L-NNA durante 5 minutos para eliminar los compuestos de las células. Este paso podría prolongarse hasta los FLUORESCENTECence cambios se recuperan por completo.
11. Administrar 10 M NOC-7 en tampón fisiológico Ca ²⁺ durante 2 minutos usando el sistema de perfusión. El donante de NO afecta fuertemente G-GENOP fluorescencia que generalmente disminuye en> 20% en respuesta a 10 mM NOC-7. En las células EA.hy926 el efecto NOC-7 es aproximadamente 3 veces más fuerte en comparación con el agonista inducida G-GENOP fluorescencia de enfriamiento.
12. Lavar el compuesto liberador de NO • durante aproximadamente 10 minutos con Ca ²⁺ fisiológica tampón y detener la grabación una vez que se recupera la fluorescencia basal.

Análisis 4. Datos

1. Exportación adquirió datos de intensidad media de fluorescencia de las células individuales en el tiempo, para el software de análisis de datos.
2. Restar respectivos valores de fondo y calcular la relación de 340 nm por 380 nm de los respectivos Fura-2 señales de cada célula individual con el tiempo.
3. Restar los valores de fondo del canal G-GENOP para obtener la corriente realfluorescencia intensidad de la sonda NO (F) con el tiempo el uso de cualquier software de cálculo.
4. Tomar los valores de fluorescencia de línea de base como F ₀ (F ₀ es la fluorescencia de la sonda de NO en el tiempo sin estimulación). Ver también la etapa 4.5 y la Figura 1C.
5. Calcula una función en el tiempo para los efectos de blanqueo de fluorescencia utilizando la siguiente ecuación: F = F _{0 inital} • exp (-K • Tiempo) + F _meseta. F _inital: se inicia la señal de fluorescencia máxima de imagen una vez; K: constante de velocidad de la decoloración de fluorescencia con el tiempo; F _meseta: un mínimo de fluorescencia alcanzado por la decoloración con el tiempo; Ver también los pasos 4.3- 4.4 y la Figura 1C.
   NOTA: Para la aproximación, todos los valores de fluorescencia con el tiempo antes y después de la estimulación de células pueden ser utilizadas. Más detalles son especificados por Bentley et al. ^27.
6. Para normalizar la señal del G-GENOP con el tiempo, calcule 1-F / F₀ (pasos 4.3-4.5). Ver la Figura 1C y 1D.

Resultados

La visualización de una sola célula NO • Perfiles en respuesta a Transitoriamente Aplicada donadores de NO

Se utilizó un clon de células HEK que expresa de forma estable G-GENOP (Figura 1A), con el fin de visualizar NO • señales en el único nivel celular en respuesta a dos compuestos químicos pequeños NO-liberar diferentes, NOC-7 y SNP. Los donantes • NO se aplicaron de forma consecutiva o eliminarse de las células durante la obtención de imágenes mediante un sistema de perfusión por gravedad que aseguró flujo continuo (Figura 1B). Todas las células que expresan G-GENOP con diferentes intensidades mostraron una clara reducción de la fluorescencia en respuesta a NOC-7 y SNP (Figura 1C), lo que indica rápida acumulación de NO • dentro de las células tras la adición de los NO • donantes. Señales de fluorescencia normalizada (1-F / F ₀₎ demostraron que el NO • donantes evocados cellula homogénear • NO elevaciones que se recuperó por completo al lavado de los compuestos NO • liberador (Figura 1D). Sin embargo, SNP 10 M indujo sólo el 50% de la señal celular • NO (9,63 ± 1,05%, n = 3/38) que fue alcanzado por 10 M NOC-7 (18.10 ± 1.20%, n = 3/38, p < 0,0001). Con el fin de lograr la igualdad intracelulares NO • niveles con el NO • donantes, se requiere una concentración de 1 mM de SNP (figuras 1C, 1D).

A continuación, probamos la capacidad de los recién preparada frente expirado NOC-7 para elevar los niveles intracelulares NO • en las células HEK. Con este fin, hemos preparado cuatro tampones experimentales que contienen 5 mM NOC-7. El NO • donantes se añadió ya sea recién justo antes de la medición, o se mantiene dentro de los depósitos para 1 hr, 2 hr y 3 hr a temperatura ambiente antes de la medición. Los diferentes tampones se aplicaron consecutivamente a y f eliminanesde las células que expresan G-GENOP utilizando un sistema de perfusión (Figura 2B). Este enfoque dio a conocer la estabilidad del acuosas NOC-7 soluciones que, como se esperaba, mostraron una disminución de la capacidad con el tiempo para elevar los niveles intracelulares NO • (Figuras 2A, 2C). Curiosamente, NO • señales recuperaron significativamente más rápido en la eliminación de los buffers caducados, en comparación con el intracelular NO • respuesta que fue evocado por fresco NOC-7 (Figura 2C), indicando quizás adhesión de las moléculas intactas NO • -liberating en componentes celulares .

La visualización simultánea de Ca2 ⁺ y NO • Las señales en las células endoteliales individuales

Con el fin de estudiar Ca ²⁺ -Accionados NO • formación en las células endoteliales, la endotelial inmortalizada de células-sustituto de uso común, línea celular EA.hy926, era transiently transfectadas con G-GENOP y cargado con Fura-2 / AM (véase el Protocolo 2.8). La transfección produjo aproximadamente 10% de las células endoteliales positivas G-GENOP (n = 6, la Figura 3A), que es suficiente para grabar Ca ²⁺ -evoked NO • producción en el nivel de las células endoteliales individuales. Sin embargo, se logró casi el 100% de células positivas EA.hy926 G-GENOP utilizando un vector viral adeno-asociado (n = 6; véase el Protocolo 2.2). Antes de las mediciones de múltiples canales, se incubaron las células durante 20 min a temperatura ambiente en tampón de almacenamiento que consiste en L-NNA, un potente inhibidor irreversible ^NOS-26. Las células de control se mantuvieron en el mismo tampón de almacenamiento sin L-NNA (véase el Protocolo 1.1) (Figura 3B). El tratamiento de células de control con la histamina, un potente inositol 1,4,5-trifosfato (IP ₃₎ Generando agonista, al instante elevado citosólica ^de Ca ^{2 +} niveles seguido de un aumento gradual de intracelular NO • hasta que el agonista fue removed (Figuras 3C, 3D). Las células pre-tratadas con el inhibidor de NOS-mostraron señales citosólicas similares ^{de Ca2 +,} mientras que el nivel intracelular • NO se mantuvo prácticamente sin verse afectados en respuesta a la histamina (Figura 3E). EA.hy926 células que expresan G-GENOP también fueron tratados con 1 M y 100 M del _IP3 Generando ATP agonista con el fin de probar si o no geNOps son apropiados para vigilar NO • señales en respuesta a la baja tanto fisiológica y supra-fisiológica concentraciones de un agonista (Figura 3F). En la línea celular endotelial 1 mM ATP evocado una clara citosólica NO • señal, que era aproximadamente la mitad de la señal obtenida por 100 ATP mu M (Figura 3F).

Figura 1: Perfiles NO intracelular en respuesta a diferentes NO-liberati ng de moléculas. (A) Imágenes de gran campo de células HEK que expresan establemente citosólica G-GENOP. Barra de escala = 20 micras. (B) Ilustración esquemática de un sistema de perfusión gravedad basado media-automática para la aplicación controlada y eliminación de NOC-7 y SNP. La intensidad de fluorescencia de una sola célula (C) Representante (de un total de 3 experimentos independientes) no normalizada traza en unidades arbitrarias en función del tiempo de las células HEK que expresan establemente citosólica G-GENOP en respuesta a 10 mM SNP NOC-7, 10 mM y 1 mM SNP. Negro curva en negrita representa la curva promedio de 26 huellas de una sola célula (ligeras curvas grises). Punteado curva negro representa F _0, que se utilizó para la normalización. (D) las huellas individuales normalizados y invertidas (1-F / F _0, curvas de color gris claro), y la media de la curva (negro curva en negrita) con el tiempo en respuesta a 10 mM NOC-7, 10 mM SNP y SNP 1 mM extrae de el panel C.en / ftp_upload / 55486 / 55486fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Ensayo de estabilidad del NOC-7 utilizando células HEK estable G-GENOP expresan. (A) Representante NO • curva de respuesta a la concentración con el tiempo de manera estable G-GeNOps que expresan las células HEK tras la aplicación de NOC-7 soluciones tampón nuevo y antiguo. Todos los tampones contienen NOC-7 se prepararon inicialmente con una concentración final de 5 mM utilizando la misma solución madre (50 mM). El tiempo transcurrido de las soluciones respectivas después de la preparación hasta cantidades de formación de imágenes a 1 hr, 2 hr y 3 hr, como se indica. (B) Representación esquemática de un sistema de perfusión de medio automático basado gravedad para añadir y eliminar consecutivamente soluciones que contienen NOC-7 durante la exploración. (C) correlaciones temporales de• NO celular en respuesta a las señales viejas NOC-7 tampones recién preparados y. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: imágenes multicanal simultánea de NO • y Ca ^{2 +} señales en las células individuales EA.hy926. (A) las imágenes de fluorescencia de campo amplio representativos de células que expresan EAhy.926 G-GENOP (panel izquierdo) que se cargan con fura-2 / AM (central y paneles de la derecha). Barra de escala = 20 micras. (B) Ilustración esquemática del tratamiento de las células con 500 EAhy.926 M Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) durante 20 minutos dentro de una placa de seis pocillos antes de la medición. (C) curso temporal Representante de un registro simultáneo de fura-2 (excitación: 340 nm / 380 nm emission: 510 nm) y las señales de G-GENOP (excitación: 480 nm; emisión: 520 nm) en respuesta a la histamina 100 mM. Como se eliminó la histamina se indica después de 3 min usando un sistema de perfusión. (Línea de Fura-2 señales de formato, F ₃₄₀ / F ₃₈₀ es de color gris sólido) (D) Las curvas representan grabaciones simultáneas de citosólica ^de Ca2 ⁺ y NO • (curva normalizada e invertida, 1-F / F ₀ es verde línea continua) señales con el tiempo de un único fura-2 / aM cargado de células endoteliales que expresan transitoriamente G-GENOP. Las células se estimularon con la histamina 100 M durante 3 min en una Ca ^{2 +} (2 mM CaCl ₂₎ que contiene tampón (n = 8/3). (E) Representante de forma simultánea registró Ca ²⁺ (línea gris) y NO • (línea continua verde) las señales a través del tiempo de una célula EA.hy926 que se trató previamente con 500 mM Nω-nitro-L-arginina (L-NNA) antes a medida (n = 12/3). Las células fueron tratadas con 100 mM de histamina en presencia de 2 mMCa ^2+. (F) curvas que representan Promedio citosólicas NO • señales en respuesta a ATP 1 mM, seguido de una segunda estimulación de células con 100 ATP M. Las barras representan valores medios ± SD de señales máximas G-GENOP en respuesta a ATP 1 mM (barra blanca) y ATP 100 mM (barra verde) de 4 experimentos independientes; p <0,001 frente a 1 mM ATP. P-valor se calculó utilizando una prueba t no pareada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Desde el descubrimiento de NO • como una molécula de señalización importante en la biología ^28, la medición en tiempo real específica del radical en las células individuales, tejidos y animales enteros con alta resolución de una manera factible y fiable ha sido aspirado. Aquí se presenta la aplicación del recientemente desarrollados fluorescentes • NO sondas codificados genéticamente (geNOps) que permiten exacta imágenes de células vivas de NO • señales usando en todo el campo de la microscopía de fluorescencia ^1.

Para eludir los procedimientos de transfección elaborados e invasivos clon de células HEK que expresa de forma estable fluorescente verde G-GENOP se utilizó para cuantificar unicelulares generados exógenamente NO • perfiles. Como las células HEK normalmente no producen NO • endógenamente ^29, este tipo de células es adecuado para la generación de una línea celular de sensor basado en GENOP, lo que podría ser útil para muchas otras aplicaciones en las condiciones de co-cultivocon el NO • producción de células primarias o incluso en los animales que viven ^30. Sin embargo, en este estudio hemos demostrado la capacidad de varios compuestos NO • -liberating, de diferentes concentraciones y estabilidades, para evocar intracelulares NO • señales utilizando el modelo de células HEK-G GENOP expresar. Nuestros datos revelaron que el NO • -donor concentración, la calidad y el método de aplicación, finalmente determinan los patrones de NO intracelulares • perfiles. Dicha información es indispensable para la caracterización farmacocinética in situ de los diferentes NO • donantes, que son indicativos de varias enfermedades. Notablemente, geNOps han demostrado responder de forma estable a múltiples aplicaciones repetitivas de NO • -donor impulsos durante un tiempo muy largo ^1. En consecuencia, los experimentos que usan NO • -liberating compuestos presentados en este documento, permiten extraer conclusiones semi-cuantitativos con respecto a las diferentes amplitudes y cinética de la respectiva NO celular226; señales (Figuras 1 y 2).

Aunque el clon de células HEK que expresan establemente probablemente se origina a partir de una sola célula, una amplia heterogeneidad de G-geNOps niveles de expresión se observó (Figura 1). Esta es una característica común de clones celulares estables como la transcripción del gen (genoma integrado) de interés está bajo el control de muchos factores, tales como diversas tensiones ambientales ³¹ que influyen en las tasas de crecimiento de células ^32, y el estado del ciclo celular ^33. Los geNOps individuales basados en FP son sondas no radiométricos y, por lo tanto, el NO • pérdida de intensidad de fluorescencia aumenta con el nivel de expresión GENOP ¹ inducida. En consecuencia, la normalización de las señales geNOps es esencial para cuantificar celulares NO • Señales particularmente en el caso de un análisis comparativo. Como se muestra en nuestro estudio reciente, una correlación lineal estricta bntre la intensidad de fluorescencia basal de geNOps y la fuerza de la extinción de la fluorescencia inducida por NO • en un amplio intervalo de intensidades de fluorescencia se ha encontrado ^1. Esta es una característica importante de geNOps para la cuantificación absoluta de celulares NO • señales. Como se muestra en la Figura 1, la normalización de las señales G-geNOps en respuesta a NOC-7 y SNP reveló homogéneos NO • señales en diferentes células HEK del mismo plato, lo que indica que las células HEK no son diversos en cuanto a su capacidad para asumir y degradar el radical NO • que se origina desde el NO • donantes. Por el contrario, utilizando geNOps en células HeLa demostraron heterogeneidades claras de celulares NO • señales entre las diferentes células en respuesta a NOC-7. Estas diferencias apuntar a tipos específicos de NO • metabolismo y descomposición velocidades de células, lo que podría tener varias implicaciones en la fisiología celular y patología, y puede ser descubierto mediante el GENOPLa tecnología s.

Sin embargo, dos características importantes de geNOps tienen que ser considerados cuidadosamente para el uso correcto de los sensores y de la interpretación de datos: i) geNOps requieren adecuada de hierro (II) para responder plenamente a NO • ¹ y ii) dependiendo de la variante de FP, geNOps puede ser sensible al pH ^1. Aquí se describe un protocolo que se ha encontrado que es adecuado para la administración de suplementos de hierro no tóxico (II) de geNOps, que se expresan en cualquiera de HEK, HeLa o células EA.hy926 (véase el Protocolo 2.6). Si bien se ha demostrado que el tratamiento de células con hierro (II) / vitamina C no afectó la morfología celular, la viabilidad celular y la actividad metabólica de las células ^1, podría ser esencial para optimizar este paso importante para otros tipos de células y tejidos. Sin embargo, en algunas condiciones experimentales, el requisito de hierro de carga (II) puede limitar la aplicabilidad de geNOps. En particular, se ha demostrado que el ascorbato puede reducir NO • ³⁵ y ascorbato de hierro (II) son capaces de limpiar • NO ^{36, 37.} Por otra parte, el exceso de hierro (II) y el ascorbato pueden inducir respuestas inflamatorias ³⁹ y eNOS desacoplar ^41. Tales efectos deben tenerse en cuenta cuando se utiliza la tecnología de geNOps. Se ha demostrado que bajo ciertas condiciones experimentales, el pH intracelular se ve afectada significativamente ^34, que tiene el potencial de influir en el geNOps fluorescencia ^1. En particular, las variantes de cian y geNOps verdes son relativamente sensibles al pH que muestra una disminución de la fluorescencia tras la acidificación ^1. Por lo tanto, los cambios agudos de la (sub) pH celular pueden simular NO • señales falsas cuando se utilizan los geNOps sensibles al pH. Como se sugiere en nuestro trabajo anterior, el uso paralelo de NO • geNOps insensibles (geNOps ^mut) como contro negativoSe recomienda ls para diseccionar verdadera celular NO • señal del pH cambia ^1. Además los cambios de pH celular pueden ser inspeccionados usando sondas de pH, tales como sypher ^34.

Además, visualizamos la enzimática NO • formación endógena en respuesta a una fisiológica Ca ^2+, movilizando a agonista en la célula endotelial EA.hy926 sustituto. La línea celular EA.hy926 es un sistema modelo utilizado con frecuencia expresan consistentemente eNOS ^38. El uso de geNOps transitoriamente expresados en células EA.hy926, confirmó que _IP3 mediada por señales de Ca ²⁺ evocan profunda NO • formación en este tipo de células, que fue casi completamente bloqueado por la L-NNA. Con el fin de correlacionar temporalmente Ca ²⁺ con NO • señales, las células G-GENOP que expresan fueron cargados con la UV-excitables química Ca2 ⁺ -indicador fura-2 / AM. La separación espectral del Ca ²⁺ consolidadas y no consolidadas fura-2 fluo cencia de la señal de G-GENOP se puede conseguir fácilmente con filtro comercialmente disponible fija ^40. Imaging ambas sondas revelaron que el Ca ²⁺ enzimática -Accionados NO • formación se produce mucho más lento en comparación con el aumento del ^{Ca2 +} citosólico en este tipo de células endoteliales. Cinética similar de una sola célula de NO • Las señales en las células endoteliales de arteria pulmonar bovina por tratamiento de células con el agonista de la bradiquinina _IP3 Generando, así como los esfuerzos de corte se han reportado el uso de NOA-1, un sensor altamente NO • -sensible indirecta ¹² . En consecuencia, estos datos ponen de relieve que el Ca ^{2 +} -evoked NO • formación de derivados de eNOS requiere un cierto tiempo de arranque hasta que se alcanza la actividad enzimática completa. Aunque la cinética de celular NO • formación, difusión y degradación pueden ser extraídos de otros datos, por ejemplo, las mediciones basadas en la tensión de NO • inducida por relajación de los vasosss = "xref"> 26, el gran beneficio de NO fluorescentes • sondas es que convierten directamente celulares NO • fluctuaciones en señales visibles en tiempo real. Por lo tanto, imágenes celulares NO • señales con geNOps proporcionan una alta resolución espacial y temporal, y ofrece posibilidades únicas de (re) investigar la (sub) celular NO • homeostasis. Por ejemplo, eNOS de imagen shuttling ⁴² en combinación con la tecnología geNOps en las células endoteliales individuales podría ser adecuado para correlacionar NO • formación con la localización subcelular y la translocación de la enzima NO • -producir u otras proteínas relevantes, tales como la calmodulina y la caveolina ^43.

A continuación se describe la aplicación posible del G-GENOP que expresan las células HEK y EA.hy926 para visualizar de forma exógena y endógena generada celulares NO • Las señales en el nivel de una sola célula y en tiempo real en un campo de fluorescencia convencional de ancho microscope. Nuestros datos implican que geNOps son adecuados para realizar un seguimiento específico (sub) celulares NO • Dinámica en diversas condiciones experimentales utilizando todo tipo de tipos de células interesantes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
NaCl	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	3957.20	cloruro de sodio
KCl	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6781.1	cloruro de potasio
CaCl2· 2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	T885.1	cloruro de calcio dihidratado
MgCl2· 6H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	2189.2	cloruro de magnesio hexahidratado
HEPES	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	9105.3	4-(2-hidroxietil)-1-piperazinaetanoácido ácido
NaHCO3	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	8551.1	hidrogenocarbonato de sodio
KH2PO4	Merck, Darmstadt, Alemania	104873	fosfato de dihidrógeno de potasio
Na2HPO4· 2H2O	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	4984.1	hidrogenofosfato de sodio dihidratado
D(+)-glucosa monohidratado	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6780.1	>99.5%; para cultivo celular, libre de endotoxinas
EGTA	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	3054.2	etilenglicol-bis(2-aminoetiléter)-N⁠,⁠ N⁠,⁠ N⁠ ′ ⁠,⁠ N⁠ ′ ⁠ ácido -tetraacético; agente quelante de calcio
NaOH	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	6771.1	hidróxido de sodio
HCl	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	4625.1	ácido clorhídrico, humeante, 37% (~10 N)
DMSO	Carl Roth, Karlsruhe, Alemania	4720.1	dimetilsulfóxido;
clorhidrato de ácido L-glutámico con disolvente	Sigma Aldrich, Viena, Austria	G2128	(S)-2-Ácido aminoglutárico
DMEM, baja glucosa	Sigma Aldrich, Viena, Austria	D5523	Dulbecco' s Águila Modificada' s Glucosa media - baja; con 1.000 mg/L de glucosa y L-glutamina, sin bicarbonato de sodio, en polvo, apto para cultivo celular
Solución vitamínica MEM (100x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.	11120037	100 veces las vitaminas que se encuentran en el medio esencial mínimo (MEM) estándar
Solución de aminoácidos MEM (50x)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	11130036	50 veces los aminoácidos esenciales (excepto la L-glutamina) que se encuentran en el medio esencial mínimo estándar (MEM)
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/ml)	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	. 15140122.00	antibióticos para prevenir la contaminación bacteriana de cultivos celulares
Anfotericina B	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	15290026.00	Gibco Anfotericina B contiene 250 µ g de anfotericina B (Fungizone) y 205 µ g de desoxicolato de sodio; Previene la contaminación de cultivos celulares por levaduras y hongos multicelulares
FCS	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	. 10270106	Suero fetal bovino, calificado, aprobado por la UE, origen de América del Sur
PBS, pH 7.4	Gibco/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	. 10010031.00	solución salina tamponada con fosfato
Fura-2 (AM)	Teflaabs, Austin, TX, EE. UU	. 102	indicadores fluorescentes de calcio citosólico
diclorhidrato de histamina	Sigma Aldrich, Viena, Austria	H7250	diclorhidrato de 2-(4-imidazolil)etilamina; Agonista generador de IP3
Nω-Nitro-L-arginina	Sigma Aldrich, Viena, Austria	N5501	Ácido N5-(Nitroamidino)-L-2,5-diaminopentanoico; L-NNA;   inhibidor de la óxido nítrico sintasa
NOC-7	Calbiochem/Merck, Darmstadt, Alemania	487952	3-(2-hidroxi-1-metil-2-nitrosohidrazino)-N-metil-1-propanamina; donante de óxido nítrico (NO) Corta vida media de liberación de NO
Nitroprusiato de sodio dihidratado	Cruz Biotechnology, Texas, EE. UU	sc-203395A	nitroferricianuro de sodio (III) dihidratado; compuesto liberador de óxido nítrico
30 mm Cubreobjetos	Karl Hecht, Sondheim v. d. Rhö n, Alemania	41001130	cubrevasos de vidrio, HECHT "Assistent", tamaño 1, redondo, 30 mm, (VE: 100 uds.)
Solución de refuerzo de hierro (II)	Imagen fluorescente de próxima generación (NGFI), Graz, Austria	n.a.Tampón	fisiológico que contiene hierro (II) para la carga no tóxica de hierro (II) de las células;   http://www.ngfi.eu/product/ironii-booster-solution/
G-geNOp plásmido	Imágenes fluorescentes de próxima generación (NGFI), Graz, Austria	n.a.plásmido	Sonda sensible al ADN verde NO (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product/g-genop/
G-geNOp AAV5	Imágenes fluorescentes de próxima generación (NGFI), Graz, Austria	n.a.s.sonda	sensible a NO verde que codifica adenovirus (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product-category/genops/viral-genops-vectors/g-genop-aav5/
Línea celular del sensor G-geNOp	Imagen fluorescente de próxima generación (NGFI), Graz, Austria	n.a.línea	celular de riñón embrionario humano (HEK293) que expresa de manera estable la sonda sensible al NO verde (G-geNOp);   http://www.ngfi.eu/product-category/genops/g-genop-sensor-cell-line/
HEK293A línea celular	Invitrogen/Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU	R70507	subclon de la línea celular de riñón embrionario humano (HEK293)
Línea celular EA.hy926	American Type Culture Collection (ATCC), Wesel, Alemania	CRL-2922	clon híbrido de célula somática de línea celular de vena umbilical humana con un clon resistente a tioguanina de A549
TILL iMIC	Till Photonics, Graefling, Alemania	n.a.microscopio	digital
Monocromador policromático V	Till Photonics, Graefling, Alemania	n.a.conmutación	ultrarrápida
AVT Stingray F145B	Allied Vision Technologies, Stadtroda, Alemania	n.a.Cámara	CCD versátil con sensor Sony ICX285 EXview HAD, IEEE 1394b
alpha Plan Fluar 40	Zeiss, Gö ttingen, Alemania	n.a.40X
Filtros dicroicos	Chroma Technology Corp, Rockingham, Vermont, EE. UU.	N.A.Emisor	GFP 514/3 nm (515dcxr)
ValveBank8 Controller	AutoMate Scientific, Inc., Berkeley, California, USA	01-08 unidad de	control de sistema de perfusión programable
BVC control	Vacuubrand, Wertheim, Alemania	727200	Bomba de membrana química ME 1C; bomba de vacío para sistema de perfusión
ImageJ software	Imagen de los NIH		Programa de procesamiento de imágenes Java inspirado en NIH Image. http://imagej.net/Welcome