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Batería de comportamiento pruebas evaluación General locomoción, fuerza Muscular y la coordinación en ratones

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DOI:

10.3791/55491

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23 de enero de 2018

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1Centre for Neuroscience Studies, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3Medical Genetics/ Department of Pediatrics, Kingston General Hospital, Centre for Neuroscience Studies, and Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University

En este artículo

Resumen

Pruebas de comportamiento se utilizan en ensayos pre-clínicos para evaluar los efectos fenotípicos de una enfermedad o tratamiento sobre el bienestar de los animales. Para evaluar globalmente el funcionamiento motor, seleccionamos pruebas de locomoción general, fuerza muscular y coordinación: prueba de campo abierto, la malla y la prueba del rotarod, respectivamente.

Resumen

Pruebas de comportamiento se utilizan en ensayos pre-clínicos para evaluar los efectos fenotípicos y los resultados que tiene una determinada enfermedad o tratamiento sobre la salud y el bienestar del animal. Hay numerosas pruebas de comportamiento que pueden ser aplicadas. Hemos seleccionado una prueba para la locomoción general, prueba de campo abierto (OFT); una prueba de fuerza muscular, prueba de la malla (MT); y una prueba de coordinación, la prueba del rotarod (RR). La prueba puede realizarse sobre una base semanal o mensual. Como prueba de locomoción general, las obras OFT objetivamente monitoreo de parámetros de movimiento mientras el ratón está en un aparato de campo abierto. El campo es generalmente una caja de 2' x 2', y los movimientos se registran a través de la detección de láser o a través de captura de vídeo. El ratón se coloca en el centro del campo abierto y permitido moverse libremente para la prueba. El MT utiliza la latencia para un ratón para caer una pantalla invertida como una medida de fuerza muscular. Un ratón se coloca en una pantalla, que se invierte en una caja clara y se mide el tiempo de su latencia a caer. Se realizan tres ensayos, con el mejor de los tres ensayos anotados para ese día. Una puntuación de 60 s es el tiempo máximo que un ratón quedo invertido. Ratones se dan un descanso de 5 minutos entre ensayos de prueba de acoplamiento. Por último, un protocolo acelerado en el RR evalúa coordinación motora y la resistencia. Durante un ensayo, un ratón camina sobre una varilla giratoria aumenta en velocidad de 4 rpm a 40 rpm durante 5 minutos. La prueba termina cuando el ratón toca el sensor de presión imantada al caer. Cada ratón somete a tres ensayos, y la mejor prueba es anotó para ese día. Este combinados datos conductuales permiten la evaluación global de la movilidad, coordinación, fuerza y movimiento de los animales. Al menos dos de las tres medidas de prueba de comportamiento debe mostrar mejora para un animal calificar como teniendo la función motora mejora general.

Introducción

El objetivo de la prueba comportamental es medir la caracterización fenotípica, ya sea en estudios para un nuevo modelo de ratón de enfermedades que afectan el sistema nervioso central o de un ensayo de un nuevo tratamiento. Hay una variedad de pruebas de comportamiento para elegir. La justificación para el uso de una combinación de pruebas de comportamiento es a menudo evaluar completamente los resultados del tratamiento clínico previo. La batería de pruebas de comportamiento en el presente documento incluye la prueba de campo abierto (OFT), prueba de la prueba de acoplamiento (MT) y el rotarod (RR).

La OFT se utiliza como una medida de actividad locomotora general1,2,3,4,5,6,7. Esta evaluación permite que el ratón para moverse libremente en un campo abierto, y las medidas tomadas son los movimientos del ratón en el transcurso de la prueba de comportamiento. Los análisis cuantitativos hizo utilizando un OFT incluyen cría, movido de distancia, tiempo pasado móviles (por ejemplo, caminar y correr) y los cambios en la actividad con el tiempo (por ejemplo, movimientos de salto y más lento/hiperactivo), razón por la cual es una útil y Análisis exhaustivo del comportamiento de roedor.

La MT se utiliza para evaluar la solidez de los ratones1,2,8,9,10,11. El uso de las cuatro extremidades para colgar de una malla de cuadrícula permite la medición no invasiva de la habilidad de los ratones para mostrar tensión sostenida del miembro mientras que oponerse a los efectos de la gravedad. Esta evaluación se realiza colocando un ratón en una malla invertida y su latencia a la sincronización. Esta prueba evalúa la fuerza muscular del ratón midiendo cuánto puede sostenerse en la pantalla invertida antes de caerse.

El RR evalúa la coordinación de un ratón mientras está usando la aceleración protocolo1,2,7,8,9,12,13. El aparato de rotarod consiste en un haz cilíndrico que gira en el aire a partir de las 4 rpm. El ratón puede aprender esta habilidad de coordinación motora y está cuestionado luego por lento, incremental aumenta hasta 40 rpm. Clásicamente, el protocolo de velocidad constante es una medida de la fuerza muscular, mientras que el protocolo de aceleración para el RR evalúa coordinación, resistencia y fuerza muscular1,2,7, 14.

Las ventajas de estas tres pruebas conductuales son son ampliamente aceptadas en los roedores comportamiento prueba comunidad2,7,8,9y cuando toma no sólo como la suma de los pruebas individuales, pero colectivamente, puede utilizarse como una evaluación global del comportamiento fenotípico de la investigación de los diferentes resultados de los tratamientos experimentales. La OFT es una de las pruebas sólo para general aparato locomotor de la actividad2. La RR también es una de las únicas maneras de evaluar coordinación2, que para utilizar el software de análisis de marcha, que no se discutirán aquí. Hay algunas maneras en las que se puede evaluar la fuerza muscular de un ratón; sin embargo, utilizando la MT o una prueba de caída de cable, se ha utilizado fundamentalmente en la literatura y es aceptado como un método confiable para las pruebas de fuerza muscular2,8,9,10, 11. muchas otras técnicas para medir la coordinación y locomoción general son muy lentos y no pueden producir datos fiables (por ejemplo, sincronización manualmente el movimiento del ratón o pintura manualmente las patas para el análisis de la marcha). Los sistemas automatizados de la OFT y el RR aumentan la fiabilidad y validez de los datos y ahorrar tiempo y esfuerzo.

Por ejemplo, dada la neurodegeneración de la modelo de ratón de la enfermedad de Sandhoff, al realizar esta batería de pruebas, la OFT sería la primera de estas pruebas para evaluar las anormalidades del motor que generalmente se ven en este modelo de ratón a partir de 3 meses de edad. Déficit en coordinación motora también debe ser evidente a partir de las 12 semanas de edad. Déficits en la fuerza muscular deben comenzar alrededor de las 14 semanas de edad, pero al final llegan a ser mucho más significativos por 16 semanas.

Estas pruebas son útiles en el estudio de las enfermedades que causan deficiencias motoras importantes, incluyendo enfermedades de neurodegenerative9 como Sandhoff enfermedad1,8,13, la enfermedad de Parkinson7, Enfermedad de Huntington, esclerosis múltiple. Las pruebas también pueden utilizarse para el estudio de envejecimiento y hacer comparativa evaluación geriátrica o medidas de salud. Disturbios de la marcha y los cambios en la locomoción y el equilibrio se ven en muchos de estos Estados de enfermedad. Sin embargo, la utilidad de estas pruebas no se limita a enfermedades con prevalencia síntomas neuromusculares.

Tenga en cuenta que no ha habido ninguna variables confusoras señaló con respecto a la motivación o la novedad de ninguna de las medidas de prueba comportamiento descritas. Es imprescindible para ciertos Estados de enfermedad y patologías que los investigadores adquieran datos conductuales preliminares antes de que el ratón muestra síntomas fenotípicos; el investigador debe entonces periódicamente (semanal) asegurar que se contabilizan todas las deficiencias motoras. Muchas enfermedades tienen un inicio rápido de síntomas fenotípicos, y sin pruebas semanales, estos síntomas no ser contablemente.

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Protocolo

Todos los protocolos descritos fueron realizados de acuerdo con y fueron aprobados por cuidado Comité del Animal de la Universidad de la reina. La frecuencia de pruebas de comportamiento puede ser semanal o mensual o una combinación de los dos (es decir, semanal cuando uno espera a ver la gran diferencia y mensual en otro lugar).

Nota: Estudios Murine de comportamiento dependen en gran medida sexo/edad/cepa, y por lo tanto es esencial para recoger los puntos de tiempo y seguir siendo constante a través de grupos experimentales. Factores ambientales (por ejemplo, olores, ruido, temperatura, humedad iluminación, etc.) afectan mucho comportamiento y ansiedad en ratones. Tratar de reducir estos factores ambientales tanto como sea posibles.

1. campo prueba

Nota: Antes de la prueba de comportamiento, los animales deben ser habituados a la habitación donde la prueba se tendrá lugar para 10-15 minutos antes del comienzo de la prueba. Asegúrese de equipo de protección personal adecuado y todo centro local se siguieron las guías de los protocolos de pruebas conductuales.

Nota: Ningún entrenamiento antes de la prueba.

  1. Garantizar que el ordenador y el programa OFT, funcionando y conectados correctamente a la cámara o caja de campo abierto. Haga clic en el programa smartware, el icono de campo abierto y "Aceptar". Eligió la fuente de "convertidor analógico digital" de las opciones de cámara. Haga clic en "detección" y asegúrese de que el espacio de campo abierto todo es visualizado y que las dimensiones son 30 x 30 cm.
    Nota: Diseño de equipo puede variar dependiendo de las limitaciones de espacio, pero asegúrese de que la computadora y campo abierto aparato está cerca entre sí en una habitación bien iluminada para captura de vídeo adecuado
  2. Haga clic en "calibración", "instantánea," y luego "OK" para asegurarse de que el ratón se está detectando dentro de los límites del campo abierto. Haga clic en "tiempo" establecer previamente una cantidad de tiempo para probar los ratones; en este caso, establece 5 min.
  3. Introduzca a los temas haciendo clic en el icono "temas". Haga clic en "programador" y resalte toda prueba temas y haga clic en las flechas verdes doble y "fase uno, sesión;" esto traerá en todos los temas para comenzar la recogida de datos.
  4. Coloque un ratón en el centro del campo abierto y haga clic en el icono de "Inicio" para pedir el programa para comenzar a grabar. Prueba sólo un ratón a la vez.
  5. Una vez que 5 min, el programa se moverá automáticamente al siguiente tema. En este caso, quite el ratón que ha completado la prueba y coloque al siguiente tema en el campo abierto. Haga clic en "Inicio".
  6. Limpie el equipo. Repita los pasos 1.3-1.4 para los restantes temas de prueba.
  7. Para analizar los datos una vez que todos los sujetos han pasado por pruebas, haga clic en el icono de "analizar" en la parte superior derecha de la pantalla. Haga clic en "analizar" otra vez y luego "informe Resumen". Opcionalmente, exportar los datos a un USB.

2. prueba de acoplamiento

Nota: El área superficial y tamaño de la malla en la MT pueden influir en rendimiento. En el MT, si un ratón se cae dentro de los primeros 10 s durante el tiempo de 2 primeros colección puntos, volverá a colocarse en la malla inmediatamente para un segundo intento. La malla utilizada aquí fue una malla de alambre, con los orificios de la malla de aproximadamente 1,5 mm de diámetro.

Nota: Ejecutar estas pruebas en la misma hora del día se recomienda, ya que los parámetros fisiológicos y bioquímicos fluctúan durante el día. Peso corporal puede influir en el rendimiento en esta prueba y por lo tanto, debe tenerse en cuenta.

  1. Coloque el ratón en el centro de una malla e invierta la malla por lo menos 20 cm por encima de un contenedor transparente. Una vez invertida, iniciar el temporizador.
  2. Tiempo y registrar el tiempo de latencia para caer. Si el ratón no cae dentro de 60 s, le dan una puntuación de 60 s y conducta no más ensayos. Permitir que el ratón para descansar durante al menos 5 minutos. Este es el final de la prueba 1.
  3. Limpie el equipo y durante el intervalo entre ensayo de 5 minutos, prueba un segundo ratón, si es necesario. Repita los pasos 2.1-2.2 para los ensayos 2 y 3, si es necesario (como el ratón no puntuación de 60 s, deben experimentar tres ensayos).

3. prueba del Rotarod

Nota: La superficie y el diámetro de la varilla en la RT pueden influir en rendimiento. En el RT, si un ratón se cae dentro de los primeros 10 s durante los primeros puntos de 2 colección tiempo, ponerlo en la barra inmediatamente para un segundo intento.

Nota: Ejecutar estas pruebas en la misma hora del día se recomienda, ya que los parámetros fisiológicos y bioquímicos fluctúan durante el día. Peso corporal puede influir en el rendimiento en esta prueba y por lo tanto, debe tenerse en cuenta.

  1. Encienda la computadora y del Citi rotarod. Asegúrese de que están correctamente conectados para grabación de datos.
  2. Asegúrese de que el programa está ejecutando el protocolo acelerado. Configurar la duración deseada de la prueba del rotarod a xxx (el intervalo válido es de 000 a 999); en este caso, pulsar 300 *. Establecer el número de carriles que se utilizarán para xxx (el intervalo válido es de 001 a 005); en este caso, pulse 005 *. Establecer la velocidad inicial a xxx RPM (Introduzca 3005 5 rpms el rango válido es de 001 a 045); en este caso, pulse 004 *.
  3. Establece la velocidad máxima en RPM xxx (entrar en 4.030 para 30 rpms el rango válido es de 001 a 045); en este caso, pulse 040 *. Ajustar la velocidad de rampa a xxx en s (Introduzca 5.030 para una rampa de 30 s a máxima velocidad el rango válido es de 000 a 999); en este caso pulsar 300 *. Coloque la unidad a modo de ratón (entre 6001 para ratón adelante y 6002 para ratón inverso); en este caso, pulse 6001 *.
  4. Asegúrese de que todos los carriles magnetizados son equilibrados antes de comenzar el juicio. Coloque un ratón en cada carril del rotarod.
  5. Pulse start para iniciar el programa. Como los ratones caen, quitarlos de sus carriles con prontitud para garantizar que ellos no "tropiece" los otros carriles.
  6. Permitir que los ratones a descansar para un intervalo de 10 minutos entre prueba. Este es el final de la prueba 1. Durante el intervalo entre ensayo, limpie el equipo y comenzar el juicio por el siguiente conjunto de ratones.
  7. Repita los pasos 4 a 6 según sea necesario. Si un ratón permanece en el rotarod para el ensayo completo de 5 minutos, no más ensayos son necesarios para ese ratón.

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Resultados

Los animales de estudio pueden sufrir el paradigma conductual prueba semanal o mensualmente para dar cabida a los puntos de tiempo requeridos para el análisis. Vea la figura 1 para ejemplos de tiempo prueba conductual. En los datos representativos a continuación, tomado de Osmon et al. (2016), los ratones experimentaron la batería de pruebas de comportamiento mensual, comenzando a las 12 semanas de edad, hasta su extremo humano alrededor de las 40 semanas de edad...

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Discusión

Para todas las pruebas, limpiar y desinfectar la superficie para minimizar los contagios y elementos interactivos de los ratones. También, asegúrese de que los ratones están probando dado suficientes períodos de descanso entre ensayos y comportamiento al usar el OFT, RR y Mt.

La OFT, es crítico que cada ratón se coloca en medio del campo abierto y que el programa se inicia con el lanzamiento del ratón en el centro. Asegúrese de que no hay ningunos movimientos de la mano que los sensores pueden...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría agradecer a la Fundación de investigación de nueva esperanza por su continuo apoyo y financiación de la investigación. También nos gustaría agradecer a Citi por apoyo financiero parcial para este trabajo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
IITC Ciencias de la Vida Rotarod con software de computación Serie 8 IITC Ciencias de la Vida755
Cuadrado Campo Abierto 45 x 45 x 40 cm (color gris). Otro color de piso disponible: blanco, negro.Harvard Aparatus (PanLab)760190
  Módulo preconfigurado de campo abiertoHarvard Aparatus (PanLab)760688
plataforma de software Smart V3.0 Harvard Aparatus (PanLab)760681
Convertidor de vídeo (analógico/digital)Harvard Aparatus (PanLab)760262
Sistema de fijación de tejado para cámaraHarvard Aparatus (PanLab)760277
Cámara y lente analógica SonyNTSCHarvard Aparatus (PanLab)760505

Referencias

  1. Osmon, K. J., et al. Systemic Gene Transfer of a Hexosaminidase Variant Using an scAAV9.47 Vector Corrects GM2 Gangliosidosis in Sandhoff Mice. Human Gene Therapy. 27 (7), 497-508 (2016).
  2. Brooks, S. P., Dunnett, S. B. Tests to assess motor phenotype in mice: a user's guide. Nature Reviews, Neuroscience. 10, 519-529 (2009).
  3. Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Moser, P. Behavioural and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Exp. Neurol. 169, 239-254 (2001).
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