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Artículo de método

Un enfoque ADN afinidad G-cuádruplex para la purificación de enzimáticamente activa G4 Resolvase1

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DOI:

10.3791/55496

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18 de marzo de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cancer Biology, Wake Forest School of Medicine, 2YX Genomics, 3Department of Biology, Ball State University, 4Department of Hematology and Oncology, Roper St. Francis Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

G4 Resolvase1 se une a estructuras de G-quadruplex (G4) con la afinidad reportado más apretado para una proteína de unión-G4 y representa la mayoría de la G4-ADN anulación actividad en las células HeLa. Se describe un nuevo protocolo que aprovecha la afinidad y anulación actividad dependiente de ATP de G4-Resolvase1 para purificar específicamente G4R1 recombinante catalíticamente activo.

Resumen

estructuras de ácidos nucleicos de orden superior llamado G-quadruplex (G4s, estructuras G4) se pueden formar en las regiones ricas en guanina del ADN y ARN y de alta estabilidad térmica. Hay> 375.000 secuencias de formación de G4-putativo en el genoma humano, y que se enriquecen en regiones promotoras, regiones no traducidas (UTRs), y dentro de la repetición telomérica. Debido a la posibilidad de que estas estructuras afectan a los procesos celulares, tales como la replicación y transcripción, la célula ha evolucionado enzimas para su gestión. Una de estas enzimas es G4 resolvasa 1 (G4R1), que bioquímicamente fue co-caracteriza por nuestro laboratorio y Nagamine et al. y encontrado que se unen muy fuertemente a ambos G4-DNA y RNA-G4 (K d en el intervalo de bajo pM). G4R1 es la fuente de la mayoría de la actividad G4-resolver en lisados ​​de células HeLa y desde entonces ha sido implicado a desempeñar un papel en el metabolismo de los telómeros, el desarrollo de la linfa, la transcripción de genes, la hematopoyesis, y la vigilancia inmune. La capacidad a EFcientemente expresar y purificar catalíticamente activa G4R1 es de importancia para los laboratorios interesados ​​en adquirir una mayor comprensión de la interacción cinética de las estructuras y las enzimas G4 G4-resolver. A continuación, describimos un método detallado para la purificación de G4R1 recombinante (rG4R1). El procedimiento descrito incorpora la tradicional de purificación basados ​​en la afinidad de una enzima marcada con histidina C-terminal expresada en bacterias con codones optimizados humanos con la utilización de la capacidad de rG4R1 de unirse y descansar G4-ADN para purificar la enzima altamente activo en un ATP- etapa de elución dependiente. El protocolo también incluye una etapa de control de calidad, donde la actividad enzimática de rG4R1 se mide mediante el examen de la capacidad de la enzima purificada para relajarse G4-ADN. Un método se describe también que permite la cuantificación de rG4R1 purificado. Se discuten las adaptaciones alternativas de este protocolo.

Introducción

estructuras G4 son estructuras secundarias de ácidos nucleicos altamente estables que se forman dentro de las regiones ricas en guanina del ADN y ARN. Estructuras G4 se estabilizan a través de interacciones Hoogsteen enlazantes y coordinan unión dentro de la cavidad central con cationes monovalentes (es decir. K + y Na +) que contribuyen significativamente a la notable estabilidad térmica de las estructuras G4 1, 2. Los primeros estudios sugirieron que la bioinformática el genoma humano contiene> 375.000 "potenciales formar G4-motivos" 3, 4. Estimaciones del estudio más recientes sugieren que el número de motivos G4 es mayor en un factor de 2 a 5 mayo, mientras que otro estudio predice 716,310 potenciales secuencias de formación de G4-distintas en el genoma humano 6. G4 formador de secuencias están evolutivamente conservada y no dispersa aleatoriamente enel genoma. Motivos G4 se enriquecen en regiones codificantes de genes, y más del 40% de todos los promotores de genes contienen motivos G4 7. Curiosamente, el grado de enriquecimiento de motivos G4 en un gen se ha demostrado para sugerir la función del gen. Por ejemplo, los proto-oncogenes y genes implicados en el desarrollo tienen significativamente mayor enriquecimiento de las estructuras G4 que los genes supresores de tumores 8, 9.

Con altas estabilidades térmicas, una presencia casi omnipresente en todo el genoma, y ​​el potencial de afectar significativamente los procesos celulares, no es sorprendente encontrar que la célula ha evolucionado enzimas para gestionar estas estructuras. Una de estas enzimas es G4 Resolvase1 (G4R1; también llamado Rhau y DHX36), que se caracterizó como la fuente de la mayoría de tetramolecular G4-ADN actividad resolver en las células humanas (HeLa) 10. Desde entonces, se ha demostrado that G4R1 fuertemente se une y catalíticamente desenrolla tetramolecular y unimolecular G4-DNA y RNA-G4 con los KDs reportados más ajustados para una proteína de unión G4-11, 12, 13. Además, la actividad G4-resolución de G4R1 se ha implicado en una amplia gama de procesos bioquímicos y celulares, incluyendo la biología de los telómeros / telomerasa 11, 14, 15, 16, transcripción y corte y empalme 17, 18, 19, 20, el desarrollo 21, la hematopoyesis 21, y la regulación inmune 22, 23. Con una preponderancia de las secuencias G4 específicamente situado a lo largo del genoma y la diversa p celularrocesos que G4R1 recientemente se ha implicado de estar involucrado con, la capacidad de expresar y purificar eficientemente altamente activa rG4R1 será de suma importancia para dilucidar los mecanismos bioquímicos y comportamientos de esta proteína.

Aquí, demostramos una novela expresión y esquema de purificación (Figura 1) que se aprovecha de la dependiente de ATP, la actividad G4-resolución de rG4R1 para aislar eficientemente enzima activa. Este sistema podría ser adaptado para purificar otras enzimas de ácido nucleico dependientes de ATP para el cual el producto de la reacción enzimática ya no es un sustrato para la unión, como es el caso de G4R1.

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Protocolo

1. Preparación de Estructuras G4-ADN que se utilizará para la Purificación de rG4R1 (Formación de biotinilado G4-ADN G-quadruplex)

  1. Ordenar el siguiente oligómero de ADN, llamado Z33-Bio, en una escala de 1 mol-: 5 'AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA TTC GGA GGA CCT-biotina 3'. Asegúrese de que el resto de biotina está en el extremo 3 'del oligómero.
  2. Preparar tampón 10X G4: mM Tris-HCl 450 pH 8, EDTA 25 mM, y NaCl 2,500 mM.
  3. Resuspender el oligómero Z33 en 250 l de agua (de manera que la concentración de oligómero es ~ 2,5 mM). Añadir 25 l de tampón 10X G4 y mezclar. Incubar el oligómero a 50 ° C durante ~ 48 h.
  4. Brevemente de girar el tubo para recoger la condensación (~ 1.000 xg, 10 s). Añadir ~ 50 l de una gran masa, polisacárido hidrófilo (30% de Ficoll en H 2 O) y mezclar. Verter a / 10% de gel de acrilamida al 10% / 1x TBE glicerol (dimensiones de gel: 16 cm x 16 cm x 1 mm). Una vez que el gel se polimeriza, lavar los pocillos con TBE 1x y la cargael oligómero Z33-Bio formada uniformemente a través de la mayor parte del gel (carril carga de la muestra puede ser visualizado con líneas Schlieren).
    1. En un carril en el extremo del gel, cargar una pequeña fracción del oligómero que ha sido calentado a 98 ° C durante 10 min (esto servirá como un control no estructurados), así como una pequeña cantidad de colorante de carga de gel en otro carril para controlar hasta qué punto el gel se ha ejecutado.
  5. Utilice 1x TBE como tampón de gel de correr y correr el gel a 120 V hasta que el frente de colorante ha atravesado al menos un tercio de la gel.
  6. Colocar una placa de cromatografía en capa fina con su cara lateral bruto hasta en un protector de hojas (o cubrir con plástico). Eliminar una de las placas de vidrio y transferir el gel a la superficie del protector de hoja. Apagar las luces y sombras del gel UV (longitud de onda larga: 365 nm). Utilice una hoja de afeitar fresco y cortar la banda G-quadruplex-Z33-Bio, que será visto como correr más arriba en el gel (que tiene la movilidad más lenta) con relación a la masa fundidaControl ed.
  7. Coloque la rebanada de gel que contiene el G4-ADN formado en un tubo de 50 ml y añadir suficiente tampón de remojo para cubrir la porción de gel (tampón remojo consiste en 1/3 volumen 10x TBE, 1/3 volumen de acetato de sodio saturado, y tercera en volumen de H 2 O). Se coloca el tubo en una incubadora a 37ºC (nonhumidified) e incubar S / N.
  8. Transferir la solución a un tubo de 15 ml y añadir 1/10 glucógeno volumen (glucógeno acciones en 20 mg / ml en Tris-HCl 10 pH 8, EDTA 2,5 mM pH 8, y azida sódica al 0,05%) y ~ volumen isopropanol 1.2x .
    NOTA: La azida sódica es muy tóxico, a fin de utilizar con precaución!
    1. Mezclar y colocar el tubo a -20 ° C durante al menos 2 h. Girar el tubo a 2700 xg en una centrífuga de mesa se enfrió a 4 ° C durante 12 min. decantar suavemente la solución de la G4-ADN se sedimentaron. Lavar el sedimento 3 veces con 70% + NaCl EtOH 50 mM (la sal en el lavado es crítico para la estabilidad G4). Wick líquido el exceso con papel de seda y sin pelusa.
  9. Lugarel sedimento se lavó en el refrigerador durante al menos 2 h para hidratar el sedimento y permitir la resuspensión más fácil. Resuspender el precipitado en 50 l de tampón TNE (10 mM Tris-HCl pH 8, NaCl 50 mM, y 0,05 mM EDTA pH 8).
  10. Colocar 5 l de este ADN G-quadruplex formado en 495 l de H 2 O y cuantificar utilizando un espectrofotómetro que permite que el coeficiente de extinción que se determinará mediante la introducción de la composición de nucleótidos del oligómero (el coeficiente de extinción del oligómero de ADN Z33 con una composición de base de A = 8, C = 3, G = 15 y T = 7 es 341.946 L / mol / cm). Introduzca el factor de dilución hasta 25 (no 100), como el G-cuádruplex formada consta de 4 hebras de ADN.
  11. Alícuota el volumen equivalente a 3 diámetros exteriores (OD 260 unidades) por tubo y se almacena a -20 ° C; por ejemplo, si los 5 l que se añadió a la 495 l de H2O da una DO 260 de lectura de 3, a continuación, preparar alícuotas de 5 mL.

2. Preparación de Estructuras G4-ADN para ser utilizado en un ensayo de la actividad enzimática de rG4R1 (formación de TAMRA-etiquetado G4-DNA)

  1. Ordenar el siguiente oligómero de ADN, llamado Z33-TAM, en una escala de 1 mol-: 5 'TAMRA-AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA TTC GGA GGA CCT 3'. Asegúrese de que el resto TAMRA está en el extremo 5 'del oligómero.
  2. Seguir el mismo procedimiento como se describe en la Sección 1 para la formación de la G-quadruplex, excepto que ultravioleta sombreado (UV) no es necesario porque el tetrametilrodamina (TAMRA) marcado con G-quadruplex será fácilmente visible a simple vista. Una vez más, asegúrese de incluir un control de fundido en el gel.
  3. Después de tomar una lectura espectrofotómetro del ADN G-quadruplex marcado con TAMRA, como en el paso 1, se diluye la G-cuádruplex formada a 0,2 pmol / l con tampón TNE. Por último, añadir glicerol a una concentración final del 10% y se almacena a -20 ° C.

3. Transformar (DE3) pLysS células competentes con pTriEx4-DHX36 (plásmido que codifica G4R1 humano) y crecen / Inducir grandes cultivos bacterianos

  1. Obtener el plásmido TriEx4-DHX36.
  2. Alícuota de las bacterias en 20 alícuotas y almacenar a -80 ° C. Alícuota el medio SOC (2% de triptona, 0,5% de extracto de levadura, NaCl 10 mM, KCl 2,5 mM, MgCl2 10 mM, MgSO4 10 mM y glucosa 20 mM) en 80 alícuotas y se almacena a -80 ° C.
  3. Preparar carbenicilina (CARB) / cloranfenicol (CAM) placas de agar LB. Concentraciones de archivo de CARB y CAM son 50 mg / ml en H 2 O y 35 mg / ml en EtOH al 70%, respectivamente, y estos son 1,000x concentrada; Por lo tanto, las concentraciones finales en las placas de selección agar LB son 50 mg / ml y 35 mg / ml, respectivamente.
  4. Coloca 1 alícuota de bacterias en hielo y colocar 1 alícuota de medio SOC a TA. Añadir 1 g de pTriEx4-DHX36 plásmido de las bacterias y agitar suavemente con la punta de la pipeta para mezclar. Incubar en hielo durante un choque de calor 5 min y luego más a fondo en 42 & #176; C durante 30 s. Colocar en hielo durante 2 minutos y añadir el medio SOC.
  5. Placa de las bacterias transformadas en placas de selección precalentadas (típicamente, la placa de un volumen pequeño, tal como 5 a 10 l, para asegurar una baja densidad de las colonias de modo que las colonias individuales se pueden inocular fácilmente en grandes cultivos) y se incuba a 37 ° CO / N.
  6. Preparar Terrific Broth de acuerdo con las instrucciones del fabricante 24. Hacer 500 ml por frasco grande (asegúrese de añadir glicerol) y el autoclave en un ciclo corto de líquido.
  7. Añadir CARB / CAM (50 mg / ml / 35 g / ml) al caldo y después inocular los cultivos mediante la adopción de tapones de agar (usando una pipeta P1000) que contiene una sola colonia bacteriana y pipeteado en el caldo. Agitar vigorosamente los cultivos para airear y luego se incuban los cultivos a 37 ° CO / N sin agitación.
  8. Al día siguiente, coloque los cultivos en un agitador C 37 ° y agitar a ~ 225 rpm. Crecer los cultivos hasta que la DO 600 es aproximadamente 0,4 -0.6, que normalmente tardará cerca de 4-6 h, dependiendo de la densidad celular inicial.
    NOTA: Esto requiere la supervisión periódica de densidad a través de lecturas espectrofotométricas, y es fundamental que no crecen los cultivos a gran parte por encima de 0,5 OD. Como en blanco para lecturas espectrofotométricas, centrifugar 1 ml de bacterias y utilizar el caldo clarificado como la solución de borrado.
  9. Una vez obtenido el apropiado DO 600, coloque inmediatamente las culturas en hielo y rápidamente enfriar a 10 ° C. Controlar la temperatura con un termómetro de limpiar con EtOH al 70%. Acelerar la refrigeración por rotación rápida mientras que los frascos en el hielo, ya que esto reducirá aún más el crecimiento de bacterias antes de la inducción de la proteína recombinante.
  10. Añadir IPTG a una concentración 1 mM final (~ 120 mg / 500 cultura ml) y después agitar a 80 rpm a 14 ° C durante ~ 17 - 18 h. La temperatura ideal para la inducción de proteína se ha encontrado que 14 ° C; para lograr mejor esto, utilizar un agitador loc-baño de agua enfriadaated en un cuarto frío convencional y comprobar manualmente la temperatura del baño de agua con un termómetro.
    NOTA: Como alternativa, utilizar un agitador / incubador refrigerado por aire, aunque es necesario poner a prueba lo que el ajuste de temperatura de ajuste digital-producirá la temperatura del líquido deseado (prueba de esta incubando una botella de agua con un termómetro en él y agitación a 80 rpm durante unas pocas horas, el ajuste de la configuración en consecuencia hasta 14 ° C de temperatura digital se alcanza).
  11. Coloque las culturas en hielo y enfriarlos rápidamente, como en el paso 3.9. Tomar una pequeña alícuota de bacterias y tomar una DO 600 de lectura; Lo ideal sería que las culturas se han duplicado durante la inducción a aproximadamente 0,8 - 1.2 OD 600.
  12. La transferencia de las bacterias a 500 ml tubos de centrífuga y equilibrar de forma manual mediante cultivo bacteriano para equilibrar el peso entre los tubos. Una vez equilibrado, centrifugar ellos en 3840 xg durante 20 min a 4 ° C. Vierta el caldo clarificado y congelar la pel bacterianavamos a -80 ° C hasta el momento de la purificación de proteínas.

4. Purificación de rG4R1 humana

  1. Descongelar y lisar sedimentos bacterianos.
    1. Descongelar el pellet bacteriano en 3 ml de tampón de TN a temperatura ambiente (tampón TN consiste en 100 mM Tris pH 7,5 y NaCl 50 mM). Mantenga las botellas en la mano y agitar para descongelar / resuspender el sedimento bacteriano. Una vez descongelado y de manera relativamente uniforme suspendido, llevar el volumen hasta 5 ml con tampón TN (sistema de suspensión que se puede lograr a través de la pipeta hacia arriba y abajo con una pipeta de 5 ml).
      NOTA: Es típico para descongelar / prep 2 o 4 botellas en el día de la preparación, dependiendo del nivel del usuario de comodidad con el procedimiento de purificación.
    2. Disolver 20 mg de lisozima en 250 l de H 2 O (por cultivo) y añadir a las bacterias resuspendidas. Deje que la lisozima para digerir las bacterias para ~ de 5 - 10 minutos mientras se agita las botellas en la mano.
      NOTA: El color del SUSpensión comenzará a aligerar ligeramente a medida que el producto de digestión, y la suspensión será relativamente no viscoso. Si los cultivos son demasiado cubierto (es decir, mucho mayor que 1,2 OD 600), a continuación, ADN cromosómico bacteriano puede causar la viscosidad no deseado en esta etapa.
    3. Añadir 250 l de cóctel inhibidor de la proteasa (PIC) y una alícuota de 10 l de leupeptina. Mezclar bien.
    4. Colocar en hielo y añadir 10 ml de tampón TN frío y 22 l de BME. Transferir a un tubo de 50 ml.
    5. Sonicar las bacterias en hielo con un aparato de ultrasonidos digital programada a 30% de la amplitud. Pulso a los 2 s ON y OFF 2 s durante 1 min. Repetir el tratamiento con ultrasonidos 3 veces, dejar que las muestras se enfríen en hielo durante al menos 2 minutos entre las etapas de sonicación.
      NOTA: Con múltiples culturas, sonicar cada uno a su vez antes de repetir las iteraciones de sonicación. Durante la sonicación, tenga cuidado de mantener la punta sonicación suficientemente sumergida en el lisado bacteriano, pero sin tocar ºe lados del tubo, ya que esto generará un exceso de calor.
    6. Añadir un volumen igual (15 ml) de SSC 4x frío + 20 l de BME + 50 l de PIC + 1 alícuota de leupeptina y mezclar.
    7. En una centrífuga de mesa de pre-enfriado a 4 ° C, centrifugar los lisados ​​en 2300 xg durante 20 min. Transferir el sobrenadante a tubos de 50 frescas, pre-enfriado ml (1 tubo por cultivo a gran siendo preparado).
  2. Preparar los granos G4-magnética.
    1. Tomar 1 ml de grano estreptavidina paramagnéticas (SPB) de suspensión (por 1 L de cultivo) y transferirlo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Sedimentar las SPB con un imán y se lava 2 veces con 2 x SSC + 5 mM EDTA pH 8. Resuspender el SPB lavados en 200 l de la misma solución utilizada para el lavado de las perlas.
    2. Añadir una alícuota de 3 OD G4-ADN (G4 Z33-Bio preparado en la Sección 1) a la suspensión SPB y mezclar rápidamente pipeteando arriba y abajo varias veces. Colocar los tubos en un rotador y rotar a temperatura ambiente durante al menos 30 min (y hasta 60 min).
    3. En popaer este período de rotación, bloquear el SPB-G4 obligado por la adición de 1 ml de 0,4% lactoalbúmina, y mantener en hielo hasta que se necesite. Se diluye la lactoalbúmina al 0,4% de la lactoalbúmina la acción 4% usando 1x Tris-glicina.
      NOTA: El% de la lactoalbúmina 4 (w / v) se prepara inicialmente por disolución en 2 M de glicina pH 7,5, con la adición adicional de 1x PIC y azida sódica al 0,05%.
  3. Enlazar con colas de histidina rG4R1 a perlas de cobalto (CB) (viene de la etapa 4.1).
    1. Añadir 1 ml de la suspensión de CB (equivalente a un volumen de grano 0,5 ml) a cada tubo de 50 ml que contenía lisado bacteriano aclarado. Incubar durante 20 min a TA en un rotador.
      NOTA: volumen del grano 0,5 ml se utiliza por 1 L de lisado clarificado; por ejemplo, si se preparan dos 500 cultivos bacterianos ml, sólo se suman CB al tubo de 50 ml que contenía lisado clarificado de una de las culturas en este punto, como lisado de la segunda cultura será atado en serie con la misma 0,5 ml de CB en step 4.3.3).
    2. Centrifugar CB a 110 xg durante 5 min en una centrífuga de 4 ° C tablero de la mesa. Aspirar el líquido con cuidado, y dejar un par ml de líquido a fin de no perturbar el CB peletizado. Lavar con 10 - 15 ml de frío 4x SSC + BME (0,5 l de BME / ml de 4x SSC).
      NOTA: Para los lavados, se vierte el 10-15 ml directamente sobre las perlas sedimentadas cobalto en lugar de pipeteo, como pipeteo provocará que las perlas se quedan atascados en el interior de la pipeta y la proteína se perderán.
    3. Sedimentar las CB de nuevo a través de centrifugación y luego verter la siguiente lisado clarificado (30 ml, que representa el cultivo bacteriano inducido 2 nd grande) en el CB granulado. Incubar durante 20 minutos más a temperatura ambiente en el rotador y lavar dos veces con 10-15 ml de 4x SSC + BME. Pellet a 110 xg durante 5 min a 4 ° C.
    4. Después del segundo lavado, aspirar el líquido y dejar alrededor de 2 ml de perlas / líquido en la parte inferior del tubo. La transferencia de la CB-proteína unida a un tubo de pre-enfriado de 2 ml porusando una punta de pipeta de 1 ml "de gran calibre".
      NOTA: Utilice una cuchilla de afeitar nueva para cortar el extremo de la punta antes de la transferencia, ya que el uso de esta punta de pipeta "de gran calibre" reducirá la pérdida de granos de cobalto unidas a proteínas.
    5. Centrifugar brevemente las perlas en el tubo de 2 ml a alta velocidad (~ 18.000 xg) en una microcentrífuga a 4 ° C (~ 5 - 10 s es todo lo que es necesario para la granulación rápida). Retire con cuidado y desechar el sobrenadante con la pipeta, teniendo cuidado de no perder el CB unido a proteínas.
  4. Eluir rG4R1 de CB.
    1. Incubar la CB en 0,5 ml de tampón de elución histidina (HEB) en un aparato rotatorio durante 5 minutos en una habitación fría. De nuevo, cuando la adición de HEB, justo pipetear los 0,5 ml sobre las perlas (para eliminar la pérdida CB) y resuspender las perlas invirtiendo el tubo. HEB es 0.7 M L-histidina pH 6 (se ajusta el pH usando ácido acético).
    2. Centrifugar a 18.000 xg en una microcentrífuga 4 ° C durante 1 min. Transferir el sobrenadantea un pre-enfriado 15 ml tubo. Retire con cuidado y transferir el sobrenadante que contiene la proteína con la pipeta cuidado, dejando una pequeña cantidad de líquido en la parte superior de la CB.
    3. Repita los pasos 4.4.1 y 4.4.2 para un total de 3 eluciones HEB.
    4. Eluir una vez con 0,2 M EDTA pH 6,0; el color de la CB cambiará de color rosa a blanco como el EDTA quela el cobalto.
    5. Después de esta cuarta y última elución se ha transferido al tubo de 15 ml, pipetear el tampón de elución residual de la CB mediante el uso de una punta de carga de gel en el extremo de una punta de pipeta 1 ml; hundiendo la punta a la parte inferior del tubo, tampón de elución que contiene proteína residual puede ser recogido.
  5. RG4R1 unirse a SPB G4-atado y eluir la enzima recombinante de una manera dependiente de ATP.
    1. Preparar 5x Res Buffer: 250 mM Tris-acetato pH 7,8, NaCl 250 mM, 2,5 mM MgCl 2, y 50% de glicerol. Preparar 3x Res Buffer: 0.915 ml de H 2 O, 2 ml de 5x Res Buffer, 0,33 ml de 0,4% de lactoalbúmina (diluted del 4% lactoalbúmina con 1x Tris-glicina), 0,010 ml de BME, 0,015 ml de 1 M de MgCl2, 0.050 ml de PIC, y 0,010 ml de leupeptina. Mantener en hielo.
      NOTA: El% de la lactoalbúmina 4 (w / v) se prepara inicialmente por disolución en 2 M de glicina pH 7,5, con la adición adicional de 1x PIC y azida sódica al 0,05%.
    2. Pellet G4-SPB a un lado del tubo con un imán y descartar el sobrenadante (G4-SPB, como el preparado en el paso 4.2). Añadir 1 ml de tampón de 3x Res a la G4-SPB y la pipeta para mezclar.
    3. Pipetear 1 ml de G4-SPB se suspendieron en tampón 3x Res en el tubo de 15 ml que contenía ~ 2 ml de HEB / EDTA que contiene proteína (eluato de la etapa 4.4). Incubar durante 15 minutos en un baño de agua a 37 ° con agitación ocasional así que los granos no se conforman.
    4. En el hielo, sedimentar la proteína unida a G4-SPB a un lado del tubo con un imán. Para lavar, añadir 1 ml de 4x SSC + 0,4% lactoalbúmina (+ 0,5 l / ml BME) y la pipeta para volver a suspender las perlas. perlas de pellets con tél imán sobre hielo. Repita este lavado para un total de 2 lavados.
      Se requiere paciencia durante el procedimiento de lavado para asegurarse de que todas las perlas magnéticas se han sedimentado entre lavados: NOTA. Esto es especialmente cierto dado el aumento de la viscosidad de la solución debido a la glicerina contenida en las memorias intermedias Res.
    5. Lavar el G4-SPB 1x con 1 ml de tampón de 3x Res.
    6. Preparar tampón de elución (EB): 0,5 ml de 3x Res Buffer, 0,1 ml de 0,1 M ATP, y 0,4 ml de H 2 O.
    7. Pre-caliente 1 ml de EB a 37 ° C en tubos de PCR distribuidas por todo el bloque de calentamiento de un termociclador ajustado a 37 ° C.
    8. Pellet G4-SPB con el imán en el hielo y volver a suspender las perlas en 100 L de EB pre-calentado. Inmediatamente transferir las cuentas a un tubo de pre-calentado por PCR y se incuba durante 30 s a 37 ° C.
    9. Sin demora, añadir 12 l de NaCl 5 M y la pipeta hacia arriba y abajo vigorosamente 20 - 30 veces. La combinación de la alta concentración de sal y ATP contenida en la EBsirve para eluir rG4R1 de los G4-cuentas.
      NOTA: Es muy importante reducir al mínimo el número de burbujas que se forman durante el proceso de pipeteado, como burbujas pueden desnaturalizar la proteína.
    10. Inmediatamente sedimentar los G4-SPB con un imán y transferir el eluato que contiene la proteína a un tubo de PCR fresco en hielo (etiquetado con la fecha).
    11. Repetir la elución y transferencia descrito en los pasos 4.5.8-4.5.10; el producto final de este proceso es de esta manera aproximadamente 200 l de EB purificados contienen rG4R1. Aparte dos alícuotas 7 (en tubos de PCR marcados con la fecha apropiada) para uso en el ensayo de actividad enzimática de control de calidad que va a probar si altamente activo rG4R1 de hecho ha sido purificada.
    12. Almacenar el rG4R1 purificada a -80 ° C hasta el momento del ensayo de actividad.

5. Ensayo de la actividad enzimática de Control de Calidad Purificada rG4R1

  1. Para cada preparación de rG4R1 a ensayar, preparar 300 lde tampón de ensayo resolvasa (RAB), en donde cada 30 l contiene 0,2 pmol de ADN G4-Z33 marcado con TAMRA (preparado en el paso 2); la composición de la RAB es la siguiente: 0,1 ml de 3x Res Buffer, 0,01 ml de 0,2 pmol / l G4-Z33-TAM, 0,03 ml de 0,1 M de ATP y 0,16 ml de H 2 O. En una tira de 6 PCR tubos, pipetas 40 l de RAB en el primer tubo y 30 l de RAB en los tubos restantes (mantener los tubos en hielo en este punto).
  2. Recuperar una de las 7 alícuotas rG4R1 (del paso 4.5.11) y colocarlo sobre hielo. Con una pipeta de p20 se establece en 5 l, con cuidado la pipeta hacia arriba y abajo varias veces para mezclar el rG4R1 en la alícuota y la transferencia de 5 l al primer tubo de la tira de 6 tubos de PCR (la que contiene 40 l de RAB). A continuación, establezca la pipeta de 10 ly 10 l transferir en serie a los tubos de PCR restantes contienen RAB.
  3. Inmediatamente después, incubar esta franja de tubos de PCR a 37 ° C durante 30 min en un ciclador térmico, seguido de un mantenimiento de 4 ° C.Abrir los tubos mientras se mantienen a 4 ° C y añadir 2 l de EDTA 0,5 M pH 8 a cada tubo (para detener la reacción enzimática).
  4. Verter un gel de TBE / 10% de glicerol 10% de acrilamida / 1x. Después de retirar el peine, lavar los pocillos con TBE 1x. Añadir 5 l de una gran masa, polisacárido hidrófilo (30% de Ficoll en H 2 O) a cada tubo y la carga de 15 l de cada tubo (la carga de los pozos de nuevo se puede observar el uso de líneas de Schlieren).
    1. Como control para la movilidad G4-ADN, añadir 4 l de una alta masa, polisacárido hidrófilo para 20 RAB l, y la carga de 15 l; como control para desenrollado Z33 monomérico, el calor 20 l de RAB a 98 ° C durante 10 min, añadir 4 l de una masa alta, polisacárido hidrófilo, y la carga de 15 l.
  5. Correr el gel a 120 V durante 2 h con TBE 1x como tampón de ejecución. La imagen de gel en un generador de imágenes multimodal con capacidad de fluorescencia de imágenes utilizando filtros TAMRA-específica (excita con un láser verde nm 532 y utilizar un 580 nm banda de paso del filtro 30 (580 BP 30)).
    NOTA: Una preparación altamente activa de rG4R1 producirá la resolución completa de Z33 marcado con TAMRA en los 3 primeros carriles que se cargaron en el gel, como se muestra en la Figura 2.

6. El agrupamiento de Gran Actividad rG4R1 Preps, la división en alícuotas y almacenamiento

NOTA: Este paso requiere de 2 personas. El número y las necesidades de los ensayos enzimáticos aguas abajo que el rG4R1 purificado se utiliza en determinará cuántos preparativos necesarios antes de la división en alícuotas. Una preparación típica grande consiste en la puesta en común de 8 preparaciones altamente activa (utilizando así un total de 16 500 ml de cultivos bacterianos inducidos), pero esto es un número arbitrario y es específicos para su laboratorio.

  1. Calcular el volumen total de rG4R1 altamente activos, purificados que se va a alícuotas. Típicamente, 7 alícuotas se utilizan en ensayos de aguas abajo. Llenar el bloque de un cicl térmicaer ajustado a 4 ° C con tubos de PCR tira (estos se dividen en partes alícuotas en, como la naturaleza sólida del bloque acelerará el cierre rápido de las tiras de PCR).
  2. Recuperar los tubos de PCR que contienen rG4R1 altamente activo a partir de -80 ° C y rápidamente descongelar los tubos en la mano; cuando una pequeña cantidad de hielo se deja en el tubo, colocar los tubos en hielo. Combinar todas las preparaciones descongeladas rápidamente, en un tubo de 15 ml previamente enfriada y mezclar bien, asegurándose de minimizar las burbujas.
  3. Usando una pipeta de repetición automática, dispensar el volumen de la alícuota deseada en las tiras de tubos PCR pre-refrigerados en el termociclador. Tan pronto como 1 - 2 tiras se han completado, tiene la segunda persona cerrar los párpados y transferirlos a obleas de 96 pocillos que están flotando en nitrógeno líquido (congelación flash es necesario para preservar la actividad enzimática).
    NOTA: No tome más de alrededor de 200 l de rG4R1 en la punta de la pipeta automática a la vez para reducir el tiempo que la enzima no es a las 4DO.
  4. Una vez que los previamente enfriado tiras de tubos de PCR en el termociclador se han llenado de alícuotas y congelado adecuadamente, transferir rápidamente tiras de tubos PCR más pre-refrigerados de hielo en el termociclador y continuar alícuotas. Continuar de esta manera hasta el resto de la enzima se ha alícuotas, flash congelado en nitrógeno líquido, y se transfiere a hielo seco. Finalmente, la transferencia de las alícuotas a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo.

7. La cuantificación de Purified rG4R1 Concentración

  1. Verter un estándar de 5% de apilamiento / 12% solución de acrilamida / SDS gel para la separación de proteínas.
  2. Descongelar aproximadamente 50 l de rG4R1 alícuotas, se combinan en un solo tubo y mezclar bien. Medir el volumen exacto con una pipeta y añadir una cantidad igual de tampón de muestra 2x Laemmli (65,8 mM Tris-HCl pH 6,8, 26,3% (v) de glicerol / w, 2,1% SDS, y 0,02% de azul de bromofenol) + BME (50 l / 950 l de tampón Laemmli 2x). Desnaturalizar la proteína a 98 ° C durante 10 min.
  3. Preparar diluciones de marcadores de PM de amplio intervalo en tampón de muestra 1x + BME tal que las siguientes cantidades de proteínas pueden ser cargados en el gel como estándares: 31,3, 62,5, 125, 250, y 500 ng.
    NOTA: Cada estándar de la proteína contenida en los marcadores de PM de amplio intervalo está presente a 0,1 mg / l, a excepción de la proteína de 50 kDa, que está presente en 0,3 g / l. Estos marcadores no necesitan ser desnaturalizado calor.
  4. Retire el peine del gel y lavar los pocillos con tampón de ejecución / glicina 1x SDS estándar. Cargar el equivalente de 25 y 12,5 l de rG4R1 (que es 50 y 25 l de proteína desnaturalizada), aunque el volumen óptimo de la enzima para cargar debe ser determinado por el usuario, como la concentración de las preparaciones enzimáticas variará (por ejemplo, 35 l se cargó en el gel en la Figura 3). Cargar los patrones de proteínas preparadas en el paso 7.3. Asegúrese de que las pipetas estén debidamente calibrados, y se aseguran de ser lo más preciso possibLE con técnica de pipeteado para asegurar la cuantificación exacta.
  5. Correr el gel a 120 V hasta que el frente del colorante ha recorrido aproximadamente 2/3 del gel (para asegurar la adecuada separación de las proteínas que componen los marcadores de amplio rango MW).
  6. Quitar el gel y disponer de la porción del gel que no contienen proteínas mediante la reducción de la basura con una hoja de afeitar. Colocar el gel en una cazuela de vidrio o un recipiente equivalente. Teñir el gel con colorante Coomassie (50 mg de Coomassie R-250 por 100 ml de metanol 50:10:40 v v /: ácido acético: H2O que ha sido filtrada a través de un embudo de papel de filtro) O / N a RT en un conjunto agitador orbital para asegurar la agitación adecuada del gel.
  7. De-mancha el gel con 30:10:60 v / v de metanol: ácido acético: H2O utilizando en ovillo, un pañuelo de papel sin pelusa para acelerar la decoloración. Cambie la solución decolorante según sea necesario. Continuar decoloración hasta que el fondo es suficientemente bajo para visualizar normas rG4R1 y proteínas; un gel típico en esteetapa se muestra en la Figura 3.
  8. Colocar el gel en destained entre un protector de hojas y escanear el gel a ≥300 dpi de resolución. Abra la imagen escaneada en un programa de software de análisis de imágenes (como Fuji Multiguage o equivalente) y preparar las curvas de calibración a partir de los estándares de proteína que corresponden a 75, 100, y 150 kDa (las curvas representan cantidades de gramos frente a las lecturas densitométricas). Asegúrese de restar el fondo de cada carril se cuantificó durante el proceso de obtención de los valores densitométricos.
  9. Suponiendo que la cantidad de volumen de rG4R1 que se cargó en el gel contiene una cantidad de proteína que está dentro del rango lineal de estas curvas de calibración, la cantidad gramo de proteína por microlitro de rG4R1 cargado puede ser extrapolado.
  10. Convertir la cantidad gramo extrapolada de rG4R1 en una cantidad molar utilizando el peso molecular de G4R1, que es 120.000 g / mol.
    NOTA: Para cada gel, tres valores extrapolados serángenerado (uno para cada uno de los tres marcadores de proteínas que se utilizan para generar las curvas estándar: 75, 100, y 150 kDa). Ejecutar otros dos geles y las manchas y cuantificarlos repitiendo los pasos 07/01 a 07/10. Con los resultados de la cuantificación de la primera gel, el usuario será capaz de medir la cantidad necesita rG4R1 para ser cargados en geles adicionales para producir una cantidad que está dentro del intervalo lineal de los patrones de proteína. En total, nueve extrapolar los valores que representan la concentración de gran actividad, rG4R1 purificada. Promedio, estos valores para dar la concentración rG4R1-lote específico final, que es típicamente en el intervalo de 20-100 nM. Se calcula la desviación estándar de estos valores (n = 9).

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Resultados

Este protocolo (Figura 1) se obtiene rutinariamente casi puro, rG4R1 catalíticamente activo. Como medida de la actividad enzimática, se observa típicamente que el 50% de 0,2 pmol de G4-ADN tetramolecular marcado con TAMRA se convierte en monómeros dentro de la 0,2 - gama l 0.013 de rG4R1, como se ensayó mediante el ensayo de actividad G4 descrito anteriormente (Figura 2). Tinción de Coomassie de rG4R1 purificado indica una única banda en el 120 tamaño esperado kDa, con una banda contami...

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Discusión

Este protocolo representa una expresión, purificación, y el esquema de cuantificación altamente eficiente para el aislamiento del producto génico DHX36, G4-Resolvase1 (G4R1, también llamado Rhau y DHX36) (Figura 1). Este protocolo utiliza dos etapas de purificación: Su-etiqueta de purificación de afinidad en perlas de afinidad de cobalto y purificación enzimática sobre perlas G4-ADN-conjugado. El último paso es único, ya que se aprovecha de la afinidad apretado, alta especificidad, y anulación actividad...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Nos gustaría dar las gracias a nuestras fuentes de financiación, incluyendo una generosa donación de la Fundación Ware (a JPV), los Institutos Nacionales de HealthGrant T32-CA079448 (para PJS), y los fondos de inicio de la Ball State University (a PJS). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Plásmido TriEx4-DHX36Addgene68368
Rosetta2(DE3)células competentes de plysSNovagen71403-4
S.O.Cmedio Thermo Fisher Scientific15544034 
Difco Caldo ExcelenteBecton Dickinson243820
GlicerolSigma-AldrichG5516
CloranfenicolSigma-AldrichC191935 µ g/mL en placas bacterianas/cultivos grandes
Carbenicillina (cultivo de células vegetales probado)Sigma-AldrichC341650 µ g/mL en placas bacterianas/cultivos grandes
Isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)Sigma-AldrichI6758
Lisozima (de clara de huevo de gallina)Sigma-AldrichL6876
1 M Tris-HCl, pH 8Universal Scientific Supply Co. 1963-Bo de fuente estándar
1 M Tris-HCl, pH 7Universal Scientific Supply Co. 1966o de fuente estándar
1,5 M Tris-HCl, pH 8,8Para fundición de gel resolutivo (para gel de cuantificación de proteínas); De fuente estándar
1 M Tris-HCl, pH 6.8Para fundición de gel de apilamiento (para gel de cuantificación de proteínas); De fuente estándar
1 M Tris-Acetate, pH 7.8Universal Scientific Supply Co. 1981o de fuente estándar
70% EtanolDe fuente estándar
Cloruro de magnesio (1  Solución M)Life TechnologiesAM9530G
Cloruro de sodioSigma-AldrichS7653
Acetato de sodioSigma-AldrichS8750
20x SSCUniversal Scientific Supply Co. 1665o de fuente estándar
β-mercaptoetanol (2-BME)Sigma-Aldrich63689
Cóctel de inhibidores de la proteasaSigma-AldrichP8849
Hemisulfato de leupeptinaSigma-AldrichL8511
Perlas paramagnéticas de estreptavidinaPromegaZ5482
0,5 M EDTA, pH 8 Suministro Científico Universal Co. 0718o de fuente estándar
0.2 M EDTA, pH 6Universal Scientific Supply Co. De la fuente estándar; inicialmente ajuste el pH con NaOH, luego ajuste el pH nuevamente con HCl.  
A-lactoalbúmina (Tipo 1 de la leche bovina)Sigma-AldrichL5385
Perlas de afinidad metálica de cobaltoClonetech 635502
L-HistidinaSigma-AldrichH8000
Ácido acético, glacialFisher ScientificA38-500
Adenosina 5'-Trifosfato (de origen bacteriano)SigmaA7699
Solución de acrilamida al 40%/Bis (37,5:1)Biorad161-0148
GlycineSigma-Aldrich50046para fabricar tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM de Tris Base, 0,1% SDS)
10% de dodecil sulfato de sodio (SDS)Universal Scientific Supply Co. 1667para hacer tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM de Tris Base, 0,1% SDS); o de fuente estándar
10x TBE Sigma-Aldrich11666703001o de la fuente estándar
Tris baseFisher ScientificBP152-1para hacer tampón de funcionamiento en gel de proteínas (192 mM de glicina, 25 mM Tris Base, 0,1% SDS); De fuente estándar
TEMEDSigma-Aldrich411019
Persulfato de amonio (APS)Sigma-AldrichA3678
proteína de amplio rangoPromegaV8491
Oligón Z33 biotinilado ("Z33-Bio")Oligonucleótidos Etc5' AAA GTG ATG GTG GTG GGG GAA GGA TTC GGA CCT-biotina 3'
TAMRA-Z33 oligonucleótidos ("Z33-TAM")oligonucleótidos etc5' TAMRA-AAA GTG ATG GTG GGG GGG GAA GGA TTC GGA CCT 3'
Placa TLC con recubrimiento de flúorLife Technologies AM10110
FicollSigma-AldrichF263730% en H2O
Coomassie R-250Sigma-Aldrich27816
MetanolFisher ScientificA412
LámparaCapaz de emitir luz UV a 365 nm
Centrífuga de mesa (con rotor de cubeta oscilante)Capaz de enfriarse a 4 & grados;
C MicrocentrífugaCapaz de ser enfriada a 4 &° C
Digital SonfierBransonO equivalente capaz de emitir impulsos de sonicación (30% de amplitud, 2 s ON/2 s OFF)
50 ° C bañode agua Para la formación de Z33 en cuádruple
37 ° C incubadora de bacteriasPara transformaciones bacterianas y crecimiento inicial durante la noche de grandes cultivos de Rosetta2 E. coli transformados con TriEx4-DHX36
37 ° C/14  ° Incubadora de agitación C para bacteriasPara el crecimiento y la inducción de proteínas de grandes cultivos de Rosetta2 E. coli transformado con TriEx4-DHX36
Espectrofotómetrocapaz de leer OD600; capaz de leer concentraciones de oligómeros basadas en la secuencia de bases (como Biorad SmartSpec 3000)
TermómetroDe fuente estándar
tiras de PCRDe fuente estándar Tubos de
centrífuga de 15 y 50 mL (polipropileno)De fuente estándar
Tubos de microcentrífuga (2,0 mL)De fuente estándar
Frascos de centrífuga de 500 mL (polipropileno)Thermo Scientific3141-0500
Matriz estándar de puntas de pipeta y pipetas serológicasDe fuente estándar
de carga de gelDe fuente estándar
PipetaPara la alícuota rápida de rG4R1; De fuente estándar
TermocicladorDe fuente estándar
NitrógenoDe fuente estándar
HieloDe fuente estándar
Tampón de muestras Laemlli Biorad161-0737
Aparato para el funcionamiento de geles de gran tamañoBioradHemos utilizado el aparato celular Protean II xi de Biorad
MagnetLife Technologies12301DUtilizamos un imán de One Lambda (ahora una marca de Thermo Fisher Scientific); y Life también es una subsidiaria de Thermo, por lo que el imán enumerado aquí debería ser un reemplazo adecuado
Hojasde afeitarDe fuente estándar Papel de
filtro y embudoDe fuente estándar
Cazuelade vidrio De fuente estándar
AgitadorDe fuente estándar
KimwipesDe fuente estándar
hojas transparentesDe fuente estándar
Escáner y asociados SoftwareDe fuente estándar
SoftwareComo Fuji Multiguage, o
equivalente Microsoft ExcelO equivalente 
Marcadores MW de UV multibanda Tubos dePuntas de repetición automática líquido seco orbital Protectores de TWAIN de análisis de imágenes

Referencias

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