Artículo de método

Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

DOI:

10.3791/55501

⸱

24 de mayo de 2017

 ,  , 
1Rudolf Virchow Center for Experimental Biomedicine, University of Würzburg

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Aquí, se demuestra el estudio de diferentes enfoques de reconocimiento de lesiones de ADN a través de imágenes AFM de una sola molécula con el sistema de reparación de escisión de nucleótidos como ejemplo. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas, así como los detalles experimentales y analíticos de los experimentos de AFM.

Resumen

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La imagen AFM es una poderosa técnica para el estudio de las interacciones proteína-ADN. Este método de molécula única permite la resolución simultánea de diferentes moléculas y ensamblajes moleculares en una muestra heterogénea. En el contexto particular de los sistemas de proteínas que interactúan con el ADN, se pueden distinguir diferentes formas de complejos proteicos y sus correspondientes posiciones de unión en los sitios objetivo que contienen fragmentos de ADN. En este trabajo se presenta una aplicación de la AFM al estudio del reconocimiento de lesiones de ADN en los sistemas de reparación del ADN (NER) por escisión de nucleótidos procariotas y eucariotas. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas y se proporcionan detalles experimentales y analíticos de los experimentos. Los datos permiten sacar conclusiones importantes sobre las estrategias mediante las cuales las proteínas NER pueden lograr la verificación del sitio diana. Curiosamente, indican diferentes enfoques de reconocimiento e identificación de lesiones para el sistema NER eucariota, dependiendo del tipo de lesión. Además, las distintas propiedades estructurales de las dos helicasas diferentes implicadas en la NER procariota y eucariota dan lugar a las diferentes estrategias observadas para estos dos sistemas. Es importante destacar que estos enfoques experimentales y analíticos se pueden aplicar no solo al estudio de la reparación del ADN, sino también de manera muy similar a otros sistemas de proteínas que interactúan con el ADN, como los involucrados en los procesos de replicación o transcripción.

Introducción

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La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una poderosa técnica para el análisis de las interacciones proteína-ADN 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . Requiere sólo cantidades bajas de material de muestra para visualizar directamente muestras heterogéneas con una resolución a nivel de molécula única. La heterogeneidad puede resultar de diferentes estados conformacionale....

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Protocolo

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1. Preparación de la muestra

  1. Preparación de sustratos de ADN 11
    1. Generación de una brecha ssDNA en el plásmido
      1. Se completa la digestión de una muestra del plásmido (en este caso: pUC19 modificado, pUC19N) en un tubo de reacción con una apropiada nickasa (aquí: Nt.BstNBI) seguido de inactivación por calor enzimático, usando las condiciones según el protocolo del fabricante (véase la figura 1 para un esquema presentación). Comience con ~ 50 μL y ~ 500 nM de plásmido para un rendimiento suficiente.
      2. Verificar el plasmid nicking mediante electroforesis en gel de agarosa en muestras diluidas (~ ....

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Resultados

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Distinguir entre diferentes tipos complejos basados ​​en volúmenes complejos de proteínas

La actividad helicasa de la NER helicasa UvrB procariótico es estimulada por la unión del ADN 22 , 23 . UvrB requiere una región no apareada en el ADN (una burbuja de ADN) con el fin de cargar correctamente en una de las dos hebras individuales ssDNA. In vivo , esta estructu.......

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Discusión

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Los análisis estadísticos AFM de posiciones de unión de proteínas en fragmentos de ADN largos que contienen sitios diana específicos pueden revelar detalles interesantes sobre las estrategias particulares empleadas por la proteína para reconocer estos sitios 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Para interpretar las distribuciones de posición resultantes, es necesario conocer .......

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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PUC19N, oligonucleótidos que contienen CPD y p44 fueron amablemente proporcionados por Samuel Wilson, Korbinian Heil y Thomas Carell, y Gudrun Michels y Caroline Kisker, respectivamente. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) FZ82 y TE-671/4 a IT.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Sonda de fuerza molecular (MFP) 3DAsylum ResearchN/Amicroscopio de fuerza atómica (AFM)
Precision 390DELLN/A
ordenador ThermoMixer y bloque de 1,5 mLEppendorf5382000015bloque de calor para la preparación
de ADN Rotilabo Block-Heater H 250 & bloques para tubos de 0,5 mLCarl Roth GmbHY264.1 & Bloque de calor Y267.1para incubaciones de proteínas-ADN
Mini-Sub Cell GTBio-Rad Laboratories GmbH1704467 cámara de electroforesis con fundición de gel y fuente de alimentación
Power Pac BasicBio-Rad Laboratories GmbH1645050 fuente de alimentación para electroforesis
Centifuge 5415 D con rotorEppendorf2262120-3centrífuga
de mesa Ultra-Lum electrónica UV transillumonador MEB-15Ultralum900-1322-02mesa de irradiación UV
NanoDrop ND-1000VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbHN/AEspectrofotómetro UV
TKAX-CAD con 0,2 μ m filtro de cápsulaUnity Lab ServicesN/Adesionización y filtro de agua
NameCompanyNúmero de catálogoComments
Software
MFP software en Igor ProAsylum ResearchN/AAFM software
ImageJ (procesamiento de imágenes Java de código abierto)NIH ImageN/ASoftware de análisis de imágenes
Excel (Microsoft Office)Microsoft CorporationN/Asoftware de análisis de datos
Origin9 / Origin2016OriginLab CorporationN/Asoftware de análisis y gráficos de datos estadísticos
NameCompanyNúmero de catálogo>Comentarios
Material
OMCL-AC240TSOlympusOMCL-AC240TSAFM voladizos
grado V-5 moscovitaSPI Suministros1805hojas de mica
Amicon Ultra 0.5 mL 50k UltracellMillipore Ireland Ltd.UFC505096filtros centrífugos
NucleoSpin Extract II   Macherey-Nagel GmbH740 609.250Kit de extracción de gel de agarosa
Rotilabo papel de celulosa tipo 111ACarl Roth GmbHAP59.1AFM papel secante para deposición
Anatop 25 (0,02 μ m)Whatman GmbH6809-2102filtro de jeringa
SSpI, BspQINew England Biolabs (NEB)R0132, R0712enzimas de restricción para la preparación del sustrato de ADN
XhoI, BglIIR0146, R0144enzimas de restricción para la preparación de ADN controla
la enzima de restricción de corte Nt.BstNBINew England Biolabs (NEB)R0607nickase
T4 ADN ligasaNew England Biolabs (NEB)M0202SLigasa
Tris, HEPESCarl Roth GmbH4855, 9105productos químicos tampón
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetatoCarl Roth GmbH3957, HN03, HN02, P026productos químicos de sal
NaAcSigma-Aldrich Chemie GmbH32318productos químicos de sal
DTT, TCEP, EDTA6908, HN95, 8040productos químicos/ reactivos
agarosa, ácido acético, HClCarl Roth GmbH2267, 3738, K025reactivos
ATPCarl Roth GmbHK054nucleótidos
oligonucleótido #1 en la Tabla 1BiomersOligonucleótidos de ADN complementarios personalizados oligonucleótidos
#2, #3 y #6 en la Tabla 1Integrated DNA Technologies (IDT)fluoresceína personalizada que contiene oligonucleótidos
oligonucleótidos #4  y #5 en la Tabla 1privado (disponible en, por ejemplo, TriLink o GlenResearch)CPD que contiene oligonucleótidos
SafeSeal tubo de reacción 0,5 mL y 1,5 mLSarstedt72.704 y 72.706tubos de incubación
GeneRuler 1 kbThermo ScientificSM0311DNA ladder
6x concentrado gel de carga colorante púrpuraNuevo England Biolabs (NEB)51406Tinte de carga de ADN
Midori Green Nippon Genetics Europe GmbH999MG28055Tinción de ADN
unidad de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Janicijevic, A., Ristic, D., Wyman, C. The molecular machines of DNA repair: scanning force microscopy analysis of their architecture. J. Microsc. 212 (3), 264-272 (2003).
  2. Wang, H., et al. DNA bending and unbending by MutS ....

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Etiquetas

Interacciones prote na ADNim genes de AFMpreparaci n del sustrato de ADNcomplejo p44 de XPDactivaci n de la helicasaposici n de uni n a la lesi nan lisis de datos de AFM

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