Investigaciones de Microscopía de Fuerza Atómica de Reconocimiento de Lesión de ADN en Reparación de Excisión de Nucleótidos

Resumen

Aquí, se demuestra el estudio de diferentes enfoques de reconocimiento de lesiones de ADN a través de imágenes AFM de una sola molécula con el sistema de reparación de escisión de nucleótidos como ejemplo. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas, así como los detalles experimentales y analíticos de los experimentos de AFM.

Resumen

La imagen AFM es una poderosa técnica para el estudio de las interacciones proteína-ADN. Este método de molécula única permite la resolución simultánea de diferentes moléculas y ensamblajes moleculares en una muestra heterogénea. En el contexto particular de los sistemas de proteínas que interactúan con el ADN, se pueden distinguir diferentes formas de complejos proteicos y sus correspondientes posiciones de unión en los sitios objetivo que contienen fragmentos de ADN. En este trabajo se presenta una aplicación de la AFM al estudio del reconocimiento de lesiones de ADN en los sistemas de reparación del ADN (NER) por escisión de nucleótidos procariotas y eucariotas. Se describen los procedimientos de preparación de muestras de ADN y proteínas y se proporcionan detalles experimentales y analíticos de los experimentos. Los datos permiten sacar conclusiones importantes sobre las estrategias mediante las cuales las proteínas NER pueden lograr la verificación del sitio diana. Curiosamente, indican diferentes enfoques de reconocimiento e identificación de lesiones para el sistema NER eucariota, dependiendo del tipo de lesión. Además, las distintas propiedades estructurales de las dos helicasas diferentes implicadas en la NER procariota y eucariota dan lugar a las diferentes estrategias observadas para estos dos sistemas. Es importante destacar que estos enfoques experimentales y analíticos se pueden aplicar no solo al estudio de la reparación del ADN, sino también de manera muy similar a otros sistemas de proteínas que interactúan con el ADN, como los involucrados en los procesos de replicación o transcripción.

Introducción

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una poderosa técnica para el análisis de las interacciones proteína-ADN ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} . Requiere sólo cantidades bajas de material de muestra para visualizar directamente muestras heterogéneas con una resolución a nivel de molécula única. La heterogeneidad puede resultar de diferentes estados conformacionales u oligoméricos de una proteína. En particular, en el contexto de muestras de proteína-ADN, los complejos de proteínas pueden mostrar diferentes estequiometrías y / o conformaciones inducidas por unión al ADN en general o unión a un sitio diana específico dentro del ADN. Las muestras heterogéneas también pueden contener dos (o más) tipos diferentes de proteínas, y diferentes complejos de proteínas( Por ejemplo , que consisten en un solo tipo de proteína frente a complejos heteroméricos) pueden interactuar de manera diferente con el ADN. Los estudios analizados aquí explotan imágenes AFM en aire en muestras estáticas y secas de proteínas de reparación de ADN unidas a fragmentos de ADN largos (~ 900 pares de bases, bp) que contienen una lesión, lo que representa un objetivo de estas proteínas. La alta resolución molecular del AFM permite distinguir entre diferentes tipos de complejos de proteínas y determinar las posiciones de unión de las proteínas en los fragmentos de ADN. Es importante destacar que las lesiones se introducen en los sustratos de ADN en posiciones bien definidas. Debido a que la posición del sitio de la lesión en el ADN es conocida, las distribuciones de proteínas unidas al ADN proporcionan una visión de las diferentes propiedades de reconocimiento de lesiones de los diferentes complejos de proteínas, por ejemplo , cuán bien reconocen un tipo particular de lesión A ADN no dañado) ^{2 , 3 ,} 4 ^{, 5 , 6} . Sus posiciones sobre el ADN también permiten la distinción entre los complejos de proteínas unidos específicamente a las lesiones y los complejos unidos no específicamente en otras partes del ADN. La caracterización separada de estos diferentes tipos complejos (complejos unidos específicamente a la lesión frente a complejos no específicos) puede revelar cambios conformacionales potenciales en los complejos inducidos en la identificación del sitio de destino.

Las proteínas de reparación del ADN que se enfocan aquí son helicases que son responsables del reconocimiento de la lesión en la ruta de reparación de escisión de nucleótidos (NER). En las bacterias, NER se logra por las proteínas UvrA, UvrB y UvrC. UvrA es responsable de la detección inicial de lesiones en un complejo de exploración de ADN UvaA ₂ / UvrB ₂ . Tras la verificación de la lesión por UvrB, este complejo se convierte en UvrB monomérico unido en el sitio de la lesión y este complejo específico puede entonces reclutar el pEndonucleasa NER de rokaryotic UvrC. UvrC excisa un tramo corto (12-13 nt) de ADN monocatenario (ssDNA) que contiene la lesión. El estiramiento que falta es entonces rellenado por ADN polimerasa. Finalmente, la ADN ligasa sella el estiramiento recién sintetizado con el ADN original ^{9 , 10} . En los eucariotas, la mayoría de las proteínas de la cascada de NER son parte del complejo de factor de transcripción II H (TFIIH) grande y multimérico. Después de la detección de la lesión inicial a través del complejo trimérico CEN2-XPC-HR23B, TFIIH se recluta al sitio diana de ADN. Cuando XPD dentro del complejo verifica la presencia de una lesión NER objetivo, el eucariota NER endonucleasas XPG y XPF son contratados para excise un corto (24-32 nt) tramo de ssDNA que contiene la lesión [ ^{9 , 10]} . Aquí, específicamente, las helicases UvrB y XPD procedentes de NER procariótico y eucariótico, respectivamente, se estudiaron. Estas helicases requieren una región noADN (una burbuja de ADN) para roscar sobre una de las dos cadenas simples de ADN y posteriormente trasladarse a lo largo de esta cadena alimentada por hidrólisis de ATP. Además de las lesiones de ADN, se introdujo una burbuja de ADN en los sustratos que funciona como sitio de carga para las proteínas.

El procedimiento para la preparación de sustratos específicos de ADN de lesión ha sido descrito previamente ¹¹ . Requiere una construcción de ADN circular (plásmido) con dos sitios de restricción estrechamente espaciados para una nickasa. En el contexto de este estudio, se usó el plásmido pUC19N (2729 pb) (creado por el laboratorio de S. Wilson, NIEHS). Este plásmido contiene tres sitios de restricción estrechamente espaciados para la nickasa Nt.BstNBI que enmarcan un estiramiento de 48 nucleótidos (nt). Después de la incubación con la nickasa, el tramo de ssDNA entre estos sitios puede ser eliminado y reemplazado por un oligonucleótido que contiene cualquier característica diana. Después de cada paso, se somete a ensayo la digestión enzimática completa mediante gel de agarosaElectroforesis. Se puede distinguir el ADN circundante circular debido a su menor movilidad electroforética en comparación con el plásmido superenrollado original. La separación del ADN y la sustitución del estiramiento eliminado por el oligonucleótido de sustrato específico se pueden evaluar mediante digestión con una enzima de restricción que incisa el sustrato exclusivamente dentro de la región entre los cortes. La alineación del plásmido circular por la enzima se suprimirá por lo tanto para el ADN gapped y se restaurará después de la inserción del oligonucleótido específico. Por último, dos sitios de restricción de endonucleasa (idealmente cortadores únicos) permiten la generación de un sustrato de ADN lineal, con longitud como se desee y con el sitio diana específico en una posición definida así como una burbuja de ADN a una distancia de la lesión en 5 'O 3'.

El reconocimiento de las lesiones por las helicasas NER puede ser investigado a través de imágenes AFM. La translocación del ADN bloqueado de las helicasas en tEl sitio de la lesión es visible como un pico en la distribución de la posición de la proteína en el ADN e indica el reconocimiento de la lesión. Debido a que la translocación del ADN de estas helicasas es además direccional, con una polaridad de 5 'a 3', la dependencia del reconocimiento de la lesión en la posición del sitio de carga (burbuja de ADN aguas arriba o aguas abajo de la lesión) también indica si la lesión es preferentemente reconocida En el filamento de ssDNA no translocado o en el lado opuesto, ^{5 , 9} . En las siguientes secciones, se introducirán los métodos utilizados y se discutirán brevemente los hallazgos principales de estos experimentos. Es importante destacar que, análogamente al trabajo ejemplar sobre reparación de ADN mostrado aquí, la formación de imágenes AFM puede aplicarse al estudio de diferentes sistemas de interacción de ADN, tales como la replicación o transcripción de ADN ^{8 , 12 , 13 , 14}

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Preparación de sustratos de ADN ¹¹
   1. Generación de una brecha ssDNA en el plásmido
      1. Se completa la digestión de una muestra del plásmido (en este caso: pUC19 modificado, pUC19N) en un tubo de reacción con una apropiada nickasa (aquí: Nt.BstNBI) seguido de inactivación por calor enzimático, usando las condiciones según el protocolo del fabricante (véase la figura 1 para un esquema presentación). Comience con ~ 50 μL y ~ 500 nM de plásmido para un rendimiento suficiente.
      2. Verificar el plasmid nicking mediante electroforesis en gel de agarosa en muestras diluidas (~ 20 nM) ¹⁵ . Use guantes para protección contra el tinte de unión al ADN utilizado para la visualización del ADN.
         NOTA: Diferentes movilidades electroforéticas permiten la distinción entre el ADN plasmídico circular mellado (relajado) y superenrollado ( Figura 1 ).
      3. Eliminar el estiramiento de ssDNA inciso (entre los sitios de corte) del plásmido porIncubación con un exceso de sim 10 veces del oligonucleótido complementario (oligonucleótido 1 de la Tabla 1 ), agitación a 300 rpm durante 30 minutos cerca de la temperatura de fusión del oligonucleótido (aquí: 68ºC para pUC19N) en un bloque térmico ( Figura 1). ).
      4. Se separa el plásmido bloqueado de los fragmentos de ADN más pequeños usando un filtro de corte molecular de 50 kDa (MWCO) por centrifugación durante 10 min a 10.000 xg en una centrífuga de mesa ( Figura 1 ). Para extraer el ADN concentrado del filtro, invierta el filtro e inserte en un nuevo tubo de reacción de 1,5 ml. Centrifugar durante 3 min a 1.000 x g.
      5. Rellene la muestra de ADN concentrada resultante a 500 μL con agua filtrada desionizada, agregue un exceso adicional de 5 veces de oligonucleótido complementario y repita los pasos 1.1.1.3 y 1.1.1.4 al menos 3 veces.
      6. Ensayo para la eliminación completa del ADN por incubación con una enzima de restricción adecuada (aquí: XhoI o BglII) utilizando conditiOns según la descripción del fabricante. Utilizar muestras de ADN diluidas (melladas contra mues- tras) (~ 20 nM). Se hace funcionar una electroforesis en gel de agarosa para distinguir entre el plásmido linealizado (que no contiene hueco de ssDNA) y el ADN no escindido (ADN gapped) usando el ADN cortado como control positivo (incluir una escalera de ADN para referencia, Figura 1 ). Usar guantes.
   2. Rellenar la brecha con oligonucleótidos modificados de ssDNA
      1. Recobre el plásmido bloqueado mediante la incubación con un exceso de ~ 25 veces de un oligonucleótido fosforilado 5 'que contiene el sitio diana específico elegido, incubando a ~ 45ºC durante 4 h ( Figura 1 ). En este caso, utilice ssDNA de 48 nt que contenga una lesión, ya sea una timina aductada con fluoresceína o un dímero de pirimidina de ciclobutano (CPD), y además una secuencia no complementaria corta (8 nt) para producir burbujas de ADN (véase Tabla 1 ).
      2. Vincular de forma covalente el inserto recocido al plásmido por incubaCon T4 ADN ligasa durante una noche a temperatura ambiente de acuerdo con el protocolo del fabricante ( Figura 1 ). Para esta reacción, se añade una solución concentrada de tampón concentrada con ATP para producir condiciones de tampón adecuadas para la ligasa ( por ejemplo , se usa tampón de reacción UvrB: Tris-HCl 50 mM pH 7,5, MgCl2 10 mM, KCl 50 mM, DTT 5 mM, ATP).
      3. Ensayo para la inserción del oligonucleótido específico en el plásmido con abertura por digestión de muestras diluidas con una enzima de restricción adecuada (igual que en 1.1.1.6) de acuerdo con el protocolo del fabricante seguido de una electroforesis en gel de agarosa (como en 1.1.1.6, Figura 1 ).
   3. Preparación de un sustrato de ADN lineal
      1. Digerir el ADN del plásmido modificado con enzimas de restricción (idealmente con un solo sitio de restricción en el plásmido) usando las condiciones recomendadas por el fabricante ( Figura 1 ). Este paso produce fragmentos lineales que contienenModificación introducida en una posición definida. En este caso, utilice el corte SspI y BspQI en las posiciones 613 y 255 pb aguas arriba y aguas abajo del inserto, respectivamente, dando como resultado un fragmento de ADN de 916 pb que contiene el sitio de lesión específico a aproximadamente el 30% de la longitud del ADN.
         NOTA: Para los experimentos de formación de imágenes AFM como se describe aquí, los fragmentos de ADN con longitudes entre ~ 200 pb y ~ 2.000 pb son sustratos adecuados.
      2. Aislar el fragmento diana mediante electroforesis en gel de agarosa y extracción de gel utilizando un equipo comercial. Use guantes para protección.
      3. Opcionalmente, se corta el gel de agarosa con un bisturí para separar la escala de ADN y los carriles de muestra diluidos (los dos primeros carriles) de los carriles que contienen el ADN concentrado a purificar. Sólo exponga la parte del gel con los dos primeros carriles a la irradiación UV colocando sólo esta parte del gel sobre una mesa UV.
         1. Cortar la banda correspondiente al fragmento de elección con un bisturí. Vuelva a unir las dos partes del gel (de la lengüeta UVLe). Utilizar la posición de la banda escindida de la muestra diluida como orientación para la posición de la banda del sustrato de ADN deseado. Tenga en cuenta la mayor concentración cortando rebanadas ligeramente más amplias que para el control diluido.
            NOTA: Debido a que aquí se investigó el reconocimiento de las lesiones UV, se evitó cuidadosamente la introducción de lesiones UV adicionales a través de la irradiación UV en el sustrato de ADN mediante este enfoque.
      4. Calcular la concentración de ADN c a partir de la absorción a 260 nm medida por un espectrofotómetro UV-Vis utilizando la ley de Lambert-Beer con un coeficiente de extinción molar medio de ADN de doble hebra (dsDNA) de ε _{260 nm} ~ 6.700 M ^-1 cm ^-1 por pb:
         
         Donde L es la longitud de la trayectoria (longitud de la cámara de medida, típicamente 1 cm).
3. Expresión y purificación de proteínas
   1. Recombinantemente expresar UvrB en E. coli y purificar la proteína a través de la afinidad de talón de chitina estándar ¹⁵ y cromatografía de exclusión de tamaño ¹⁵ como se describe anteriormente [ ^16] .
      NOTA: El gen uvrB de Bacillus caldotenax se había clonado en el vector pTYB1.
   2. Expresar XPD en E. coli y purificar la proteína a través de la afinidad estándar de níquel IDA ¹⁵ y la cromatografía de exclusión de tamaño ¹⁵ seguido por cromatografía de intercambio aniónico ¹⁵ , como se describió anteriormente ¹⁷ .
      NOTA: El gen de la proteína del grupo D de Chaetomium thermophilum Xeroderma pigmentosum (XPD) se había clonado en el vector pBADM11. C. thermophilum p44 era un regalo amable del laboratorio de Caroline Kisker, expresado y puriComo se describe ¹⁷ .

2. Experimento de AFM

1. preparación de la muestra
   1. Opcionalmente, preincubar el sustrato de ADN a 65 ° C durante 10 minutos en un bloque de calor para eliminar cristales potenciales de micro-sal que pueden haberse formado durante el almacenamiento en el frigorífico.
   2. Preparar tampón (s) de reacción a una concentración de 10 veces (10 x tampones).
      NOTA: El tampón de reacción XPD a 1 x concentración contenía Tris-HCl 20 mM pH 7,5, KCl 10 mM, MgCl2 5 mM, TCEP 1 mM, ATP 2 mM; 1x tampón de reacción UvrB contenía 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM KCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, y 1 mM ATP.
   3. Pre-incubar las proteínas a una mayor concentración en condiciones de incubación adecuadas para mejorar la formación de complejos. Pre-diluir un pequeño volumen ( por ejemplo , 1 μl) de las proteínas individuales en un tampón de reacción de proteína 1x a la concentración deseada y mezclar pequeños volúmenes ( por ejemplo , 1 μl) de tLas soluciones de proteínas individuales en un tubo de reacción de 0,5 ml.
      1. Coloque el tubo en un bloque de calor para temperaturas de incubación más altas que la temperatura ambiente. Elija una relación de concentración dependiendo de la estequiometría compleja esperada, ya sea equimolar o las concentraciones correspondientes. Aquí, se incuba 1 μl de XPD (20 μM en 1 x tampón de reacción XPD) y 1 μl de p44 (20 μM en tampón de reacción 1x XPD) a 10 μM cada 10 min a 37 ° C.
   4. Incubar las muestras a concentraciones adecuadas de proteína y ADN en el tampón de reacción de proteínas en un tubo de reacción de 0,5 ml. En este caso, utilizar 500 nM UvrB o 1 μM XPD + 1 μ M p44 y 100 nM de ADN. Pipetear volúmenes pequeños para ahorrar material, por ejemplo , 0,25-0,5 μL de proteína (diluida previamente a una concentración de incubación de 10 veces) y ADN en un volumen total de 2,5-5 μl de tampón de reacción de proteína 1x. En este caso, incubar durante 30 min a 37 ° C en un bloque de calor. Girar brevemente en un tubo de reacción (~ 1 s) en un centrifugador de mesaE para asegurar la mezcla de pequeños volúmenes.
2. Depósito de muestra
   1. Prepare un sustrato de mica: corte un pedazo aproximadamente de 1 x 1 cm ² de mica de tiras más grandes usando un bisturí. Retirar las capas superiores de la pieza mineral multicapa de mica usando cinta adhesiva para revelar una superficie de sustrato limpia, plana y atómicamente lisa.
      NOTA: La pieza de mica puede reutilizarse para experimentos múltiples mediante la separación de otras capas.
   2. Preparar el tampón de deposición de AFM con agua filtrada desionizada, por ejemplo , HEPES 25 mM pH 7,5, Na-acetato 25 mM, acetato Mg 10 mM. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,02 μm.
      NOTA: Los cationes divalentes en el tampón de deposición sirven para quelar las moléculas de ADN cargadas negativamente a la superficie de mica, que también se carga negativamente a pH neutro. Si la concentración relativamente alta de iones de Mg2 ⁺ en el tampón de deposición plantea un problema para un sistema de proteína-ADN particular, alternativamente,La superficie de la mica puede cargarse previamente con grupos amino usando química basada en silatrane para proporcionar cargas superficiales positivas para el anclaje ¹⁸ . La deposición de la muestra puede entonces llevarse a cabo en un tampón que no contiene o sólo cantidades bajas de cationes divalentes.
   3. Diluir la muestra (ver 2.1) para la deposición inmediata sobre la mica en el tampón de deposición. Deposite un pequeño volumen (aquí: 20 μL).
      NOTA: Los factores de dilución dependen de la concentración de la muestra. Aquí, diluya las muestras 50-100x. Como regla general, ~ 1 nM de ADN da como resultado una buena cobertura superficial de ~ 1.000 pb.
   4. Enjuagar inmediatamente la muestra tres o cuatro veces con unos pocos mililitros de agua desionizada filtrada, eliminar el exceso de líquido y secar con un chorro suave de nitrógeno. Todo el proceso, desde la deposición de muestras hasta muestras secas, se puede llevar a cabo en menos de 30 s.
   5. Fijar el pedazo de mica en una diapositiva del microscopio usando la cinta adhesiva en sus bordes.
      NOTA: Los diferentes sistemas AFM hanOtros requisitos para la fijación de la muestra a la etapa. Otros AFM poseen etapas magnéticas, y las piezas de mica se fijan en discos magnéticos, por ejemplo , usando pegamento térmico. Los detalles del sistema AFM utilizado aquí se pueden encontrar en la Tabla de Materiales.
3. Imágenes AFM
   1. Coloque la muestra (véase 2.2.5) en el centro de la etapa AFM y fije la lámina del microscopio en el escenario con pastillas magnéticas.
   2. Inserte la punta AFM en el soporte de la punta. Utilice cantilevers con una sonda afilada (<10 nm) AFM adecuada para la oscilación, imagen de modo de contacto intermitente en el aire. Utilice sondas AFM, por ejemplo, como se indica en la Tabla de materiales . Aquí (depende de AFM), fije la punta en el soporte debajo de una abrazadera apretando el tornillo de sujeción (apretado con los dedos). Inserte el soporte de la punta en el cabezal de medición AFM. Coloque la cabeza en la espalda para este paso.
   3. Coloque el cabezal de medición AFM en la parte superior de la muestra. Los detalles dependen del modelo AFM. Aquí estoyAsegúrese de que la cabeza se mantenga estable con sus patas dentro de las muescas del escenario. Asegúrese de que la mica se encuentra en el escenario donde la punta AFM se ciernen directamente encima de ella. Los tornillos micrométricos a la derecha de la platina permiten el posicionamiento fino de la muestra.
   4. Alinee el láser AFM en la parte trasera del voladizo para obtener una intensidad de señal óptima desde el fotodetector sensible a la posición sobre el que se refleja el láser. Los detalles dependen del modelo AFM.
      1. Aquí, gire las ruedas en el lado derecho y en la parte posterior del cabezal de medición AFM para ajustar las posiciones x e y del láser AFM para dirigirla centralmente al extremo del voladizo. Ver la señal de reflexión en la ventana de vídeo AFM (si está disponible, aquí: presione el icono de la cámara y seleccione la entrada: Svideo).
      2. Una vez ubicada de forma cruda, optimice la señal de suma del detector (suma en la suma y la ventana del medidor de deflexión en el software AFM) ajustando la posición del láser con las dos ruedas (permanezca al final del voladizo, la suma signaL depende del tipo AFM y cantilever, aquí: apunte para suma> 5).
   5. Cero la señal de diferencia de los diodos superior e inferior de la matriz de detectores (aquí: señal de desviación en la ventana Sum and Deflection Meter) dirigiendo la reflexión del AFM al centro del detector (aquí: gire la rueda en el lado izquierdo de la medición AFM cabeza).
      NOTA: Las desviaciones de cero indican la deflexión del voladizo debido a las interacciones superficiales, que se traducen en información de altura por el AFM.
   6. Determine la frecuencia de resonancia en voladizo mediante una melodía de frecuencia implementada en el software AFM (aquí: comando automático en la ventana Master Panel / Tune). Elija una amplitud correspondiente a la entrada de 1 V para el piezo que acciona la oscilación en voladizo. Ajuste la frecuencia de oscilación a un valor ligeramente inferior (5%) a la frecuencia de resonancia y cero a la fase de oscilación.
   7. Acercar la punta a la superficie de la muestra utilizando el mod de acoplamiento brutoE (aquí: comando Engage en la ventana del Panel Maestro) hasta que se alcance el ajuste de protección (set-point). Use ~ 2% de corte de la amplitud de oscilación de nivel libre como punto de ajuste (aquí, ingrese el punto de ajuste 980 mV en el panel maestro).
   8. Acople finamente la punta AFM con la superficie de la muestra bajando el punto de ajuste usando el software AFM. Objetivo de la imagen de modo repulsivo con la fase de oscilación en voladizo (fase en la suma y la ventana del medidor de deflexión) justo por debajo de la fase de nivel libre (antes de enganche, aquí por lo general ~ 70). En este caso, utilice puntos finales típicos del orden del 70-80% de la amplitud de nivel libre (1 V).
   9. Antes de escanear, elija las señales para la grabación en el Panel de canales maestros. Elija la altura (Ht) y la amplitud (Am).
   10. Comience el análisis de muestra (aquí: comando Hacer Escanear en la ventana del Panel Maestro). Utilice una velocidad de exploración de, por ejemplo, 2,5 μm / s (velocidad de escaneo de comandos en el panel maestro) a áreas de superficie de imagen de 4 μm x 4 μm u 8 μm x 8 μm (introduzca Tamaño de exploración en el panel maestroL) con resoluciones de píxeles de 2.048 o 4.096 (Puntos de escaneo y líneas de escaneado en el panel maestro), respectivamente.
   11. Guarde el archivo de imagen (comando Guardar imagen en el panel maestro) sin modificaciones de ajuste (seleccione Ninguno en el panel de canal principal / Guardar ajuste de plano).
   12. Para un análisis posterior, procese la imagen guardada. Cargue la imagen (comando Examinar datos guardados en el menú Análisis de AFM). Abra el Panel de Modificación (presione M en la parte superior de la imagen). Aplique un plano plano en las dimensiones x e y a la imagen de altura (extensión HtR) (comando XY en la ventana Planefit en el panel Modificar, escoja Planefit Order 3). Luego aplanar la imagen (comando Aplanar en la ventana Aplanar en el panel Modificar) eligiendo Ordenar plano 3.
   13. Exporte la imagen como un archivo TIFF (presione Comandos en la parte superior de la imagen, elija Exportación TIFF 2x correspondiente a la resolución de 2,048 píxeles) para un análisis posterior.

3. Análisis de AFM

1. Volumen del complejo proteico
   1. Pre-Seleccionar complejos proteína-ADN relevantes mediante la inspección visual directa de las imágenes en el software AFM, utilizando un esquema de color adecuado para maximizar las diferentes apariencias de diferentes complejos de tamaño (ver diferentes colores y tamaños de diferentes complejos en la Figura 2 , aquí: esquema de color SeaLandAndFire en El software AFM). Para las muestras de XPD, los complejos posibles incluyeron XPD / p44-DNA así como XPD-DNA y p44-DNA, con tamaños claramente diferentes debido a las masas moleculares relativamente grandes y diferentes de XPD (~ 95 kDa) y p44 (~ 40 kDa) .
   2. Mida los volúmenes de los picos individuales de proteína en el ADN para verificar el tipo complejo. Esto se puede lograr con software de imagen diferente (aquí: la herramienta de sección del software AFM).
      1. Mida la altura (h) y el diámetro (d) de las secciones del pico de la proteína con los cursores de la ventana de sección. Mida el diámetro cerca de la base de la sección de partículas.
      2. Determine el volumen (V) del guisanteKs utilizando modelos matemáticos simples, por ejemplo , utilizando la siguiente fórmula, que se basa en un modelo de tapa esférica:
         
   3. Traducir los volúmenes medidos en una masa molecular aproximada de proteínas.
      1. Inicialmente, se calibra el sistema de AFM para la conversión de volumen a peso molecular (MW) utilizando una gama de proteínas con peso molecular conocido (aquí: un total de 12 experimentos con entre 25 y 851 puntos de datos se realizaron en 5 proteínas diferentes en monómero, , Trimérico o tetramérico) ^{4 , 19 , 20} . Depósito y proteínas de imagen (como se describió anteriormente, en 2.2 y 2.3) y medir sus volúmenes como se describió anteriormente (3.1.2). Trazar los volúmenes sobre sus pesos moleculares conocidos. El gráfico resultante mostrará una relación lineal entre V y MW, cuya ecuación puede obtenerse porUna línea ajustada a los datos. Para el sistema AFM utilizado aquí, se obtuvo la siguiente relación ¹⁹ :
         
         NOTA: Este paso no tiene que repetirse antes de cada medición, pero sólo se realiza una vez. La calibración de volumen a MW se puede aplicar a imágenes obtenidas bajo condiciones de imagen similares usando sondas AFM con diámetros ligeramente variables.
      2. Con base en sus volúmenes medidos (3.1.2) y en la calibración V-MW (3.1.3.1), determine el MW aproximado de los complejos proteínicos ²⁰ , que proporciona información sobre su contenido molecular. Se obtuvieron muestras de XPD / p44, ~ 50 kDa, ~ 100 kDa, y ~ 140 kDa, consistentes con complejos de p44-ADN (o picos causados ​​por mera superestructura de ADN), picos de XPD solamente y picos de XPD / p44 respectivamente .
2. Posiciones complejas de proteínas en el ADN
   1. Determinar el ADNFragmento longitudes.
      1. Trace los fragmentos de ADN en las imágenes AFM, por ejemplo , con la función de línea a mano alzada de un software de análisis de imagen adecuado (ver por ejemplo Tabla de Materiales) y mida la longitud de la línea.
         NOTA: Excluir los agregados de ADN así como los fragmentos cortados por los márgenes de la imagen.
      2. Bin y trazar las longitudes de ADN de todo el experimento en un histograma, utilizando un adecuado análisis de datos y software de gráficos ( por ejemplo , ver Tabla de Materiales ).
      3. Ajustar las distribuciones de longitud con una curva gaussiana en el análisis de datos y software de gráficos para determinar la longitud de los fragmentos de ADN. Con el fin de conocer la posición del sitio diana de ADN insertado (véase 1.1), sólo incluya fragmentos de ADN con la longitud correcta dentro de dos desviaciones estándar desde el centro de la curva de Gauss (y = ₀ + z exp (-2 (xx _c ) ² / w ² ), donde z es un factor normalizado yx _c yw son el centro yMáximo ancho máximo del Gaussiano) en otros análisis.
         NOTA: La longitud del ADN en el centro de la curva de Gauss debe estar cerca de la longitud teórica del fragmento de ADN (calculado usando 0,34 nm / bp). Las longitudes de hasta 10% más cortas que el valor teórico son típicas y son probablemente causadas por los límites de resolución de AFM.
   2. Determinar las posiciones de los picos de proteínas en sustratos de ADN.
      1. Mida la distancia de los picos de proteína desde el extremo del fragmento de ADN más cercano, como se describe en 3.2.1.1 y divida la longitud total del ADN para obtener distancias en unidades de fracción de longitud de ADN.
      2. Colocar y trazar las distancias medidas en un histograma usando un software de análisis de datos y graficación adecuado (véase, por ejemplo , la figura 3 ). Como regla general, elija un tamaño bin que proporcione aproximadamente √n contenedores para n puntos de datos.
         NOTA: Dado que los extremos del ADN no se pueden distinguir aquí, trazar sólo una fracción de la longitud del ADN 0,5 (centro del fragmento de ADNCión). Debido a que la unión del extremo del ADN no es el foco del estudio, excluya los extremos del ADN de los análisis comenzando a separar los datos de posición ligeramente después de la posición 0 ( por ejemplo , aquí: binning de una fracción de longitud de ADN de 0,02).
   3. Determine la especificidad del sitio objetivo de las distribuciones de posición complejas de proteínas.
      1. Ajustar el máximo (ocurrencias de enlace mejoradas) en la distribución de posición con una curva de Gauss como en 3.2.1.3 pero sobre la altura de la unión de fondo (ver Figura 3 ).
      2. Calcular la especificidad S para el sitio específico frente al fondo de ADN no específico (moléculas de proteína unidas a sitios de ADN no específicos) con la siguiente fórmula ²¹
         
         A _sp : Número de complejos específicos (área bajo la curva de Gauss)
         A _nsp : Número de complejos no específicos (área del fondo, 0 ); La fracción de longitud de ADN cubierta aquí es de 0,48 para un histograma que comienza en 0,02 de longitud de ADN)
         N: número de posibles sitios de unión al ADN (aquí: N = 914 excluyendo los extremos del ADN)
3. Ángulos de flexión del ADN
   1. Usando la herramienta de ángulo en un software de análisis de imagen adecuado, mida el ángulo β entre dos líneas colocadas centralmente a lo largo de la columna vertebral del ADN y centrándose en el pico de la proteína (véase, por ejemplo , inserto en la Figura 4 ). Mida los ángulos para un número estadísticamente relevante de complejos proteína-ADN (> 50, idealmente> 100) ^{2 , 3 , 5} .
      NOTA: El ángulo de doblado del ADN se define como 180 °-β ^{2 , 3 , 5} .
   2. Uso de análisis de datos y software de gráficos(Véase la Tabla de Materiales) producen un histograma de distribución de ángulo de curvado dividiendo los ángulos de doblado del ADN.
   3. Ajuste la distribución del ángulo de curvatura con una curva de Gauss. Si más de un máximo es aparente en la distribución, elija el ajuste máximo de Gauss máximo. El centro o centros de la (s) curva (s) gaussiana (s) da (n) el estado de ángulo de curvatura medio de la especie particular.
   4. Si un desplazamiento en el ángulo o ángulos de curvatura (máximo de ajuste (s) gaussiano) es aparente para distribuciones, por ejemplo, de diferentes variantes proteicas o especies complejas de proteínas diferentes, aplique una prueba t de estudiante para evaluar el nivel de significación del Cambios.

Resultados

Distinguir entre diferentes tipos complejos basados ​​en volúmenes complejos de proteínas

La actividad helicasa de la NER helicasa UvrB procariótico es estimulada por la unión del ADN ^{22 , 23} . UvrB requiere una región no apareada en el ADN (una burbuja de ADN) con el fin de cargar correctamente en una de las dos hebras individuales ssDNA. In vivo , esta estructu...

Discusión

Los análisis estadísticos AFM de posiciones de unión de proteínas en fragmentos de ADN largos que contienen sitios diana específicos pueden revelar detalles interesantes sobre las estrategias particulares empleadas por la proteína para reconocer estos sitios ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Para interpretar las distribuciones de posición resultantes, es necesario conocer ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sonda de fuerza molecular (MFP) 3D	Asylum Research	N/A	microscopio de fuerza atómica (AFM)
Precision 390	DELL	N/A
ordenador ThermoMixer y bloque de 1,5 mL	Eppendorf	5382000015	bloque de calor para la preparación
de ADN Rotilabo Block-Heater H 250 & bloques para tubos de 0,5 mL	Carl Roth GmbH	Y264.1 & Bloque de calor Y267.1	para incubaciones de proteínas-ADN
Mini-Sub Cell GT	Bio-Rad Laboratories GmbH		1704467 cámara de electroforesis con fundición de gel y fuente de alimentación
Power Pac Basic	Bio-Rad Laboratories GmbH		1645050 fuente de alimentación para electroforesis
Centifuge 5415 D con rotor	Eppendorf	2262120-3	centrífuga
de mesa Ultra-Lum electrónica UV transillumonador MEB-15	Ultralum	900-1322-02	mesa de irradiación UV
NanoDrop ND-1000	VWR International / PEQLAB Biotechnologie GmbH	N/A	Espectrofotómetro UV
TKAX-CAD con 0,2 μ m filtro de cápsula	Unity Lab Services	N/A	desionización y filtro de agua
Name	Company	Número de catálogo	Comments
Software
MFP software en Igor Pro	Asylum Research	N/A	AFM software
ImageJ (procesamiento de imágenes Java de código abierto)	NIH Image	N/A	Software de análisis de imágenes
Excel (Microsoft Office)	Microsoft Corporation	N/A	software de análisis de datos
Origin9 / Origin2016	OriginLab Corporation	N/A	software de análisis y gráficos de datos estadísticos
Name	Company	Número de catálogo	>Comentarios
Material
OMCL-AC240TS	Olympus	OMCL-AC240TS	AFM voladizos
grado V-5 moscovita	SPI Suministros	1805	hojas de mica
Amicon Ultra 0.5 mL 50k Ultracell	Millipore Ireland Ltd.	UFC505096	filtros centrífugos
NucleoSpin Extract II	Macherey-Nagel GmbH	740 609.250	Kit de extracción de gel de agarosa
Rotilabo papel de celulosa tipo 111A	Carl Roth GmbH	AP59.1	AFM papel secante para deposición
Anatop 25 (0,02 μ m)	Whatman GmbH	6809-2102	filtro de jeringa
SSpI, BspQI	New England Biolabs (NEB)	R0132, R0712	enzimas de restricción para la preparación del sustrato de ADN
XhoI, BglII		R0146, R0144	enzimas de restricción para la preparación de ADN controla
la enzima de restricción de corte Nt.BstNBI	New England Biolabs (NEB)	R0607	nickase
T4 ADN ligasa	New England Biolabs (NEB)	M0202S	Ligasa
Tris, HEPES	Carl Roth GmbH	4855, 9105	productos químicos tampón
NaCl, MgCl2, KCl, MgAcetato	Carl Roth GmbH	3957, HN03, HN02, P026	productos químicos de sal
NaAc	Sigma-Aldrich Chemie GmbH	32318	productos químicos de sal
DTT, TCEP, EDTA		6908, HN95, 8040	productos químicos/ reactivos
agarosa, ácido acético, HCl	Carl Roth GmbH	2267, 3738, K025	reactivos
ATP	Carl Roth GmbH	K054	nucleótidos
oligonucleótido #1 en la Tabla 1	Biomers		Oligonucleótidos de ADN complementarios personalizados oligonucleótidos
#2, #3 y #6 en la Tabla 1	Integrated DNA Technologies (IDT)		fluoresceína personalizada que contiene oligonucleótidos
oligonucleótidos #4  y #5 en la Tabla 1	privado (disponible en, por ejemplo, TriLink o GlenResearch)		CPD que contiene oligonucleótidos
SafeSeal tubo de reacción 0,5 mL y 1,5 mL	Sarstedt	72.704 y 72.706	tubos de incubación
GeneRuler 1 kb	Thermo Scientific	SM0311	DNA ladder
6x concentrado gel de carga colorante púrpura	Nuevo England Biolabs (NEB)	51406	Tinte de carga de ADN
Midori Green	Nippon Genetics Europe GmbH	999MG28055	Tinción de ADN