Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo o la lengua de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que expresan alfa-sinucleína humana con la mutación A53T familiar y luciferasa de luciérnaga, puede inducir la neuropatología, incluyendo la neuroinflamación , en su sistema nervioso central.
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Artículo de método
Imágenes de bioluminiscencia de la neuroinflamación en ratones transgénicos Después periférica La inoculación de la alfa-sinucleína fibrillas
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Resumen
Resumen
Para estudiar el comportamiento prión de mal plegada alfa-sinucleína, se necesitan modelos de ratón que permiten la transmisión rápida y sencilla de prionoids alfa-sinucleína, que causan la neuropatología dentro del sistema nervioso central (SNC). Aquí se describe que intraglossal o inyección intraperitoneal de las fibrillas de alfa-sinucleína en bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones, que sobreexpresan la alfa-sinucleína humana con la mutación A53T desde el promotor de la proteína prión y luciferasa de luciérnaga a partir de el promotor para la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), es suficiente para inducir la enfermedad neuropatológico. En comparación con Tg homocigotos (+ / + M83) ratones que desarrollan síntomas neurológicos severos partir de una edad de 8 meses, heterocigotos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) animales permanecen libres de la enfermedad espontánea hasta que llegan a una edad de 22 meses. Curiosamente, la inyección de las fibrillas de alfa-sinucleína a través de la intraperitoneal ruta indujo enfermedad neurológica con parálisis en cuatro de cinco Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones con una mediana de tiempo de incubación de 229 ± 17 días. animales enfermos mostraron depósitos graves de fosforilada alfa-sinucleína en el cerebro y la médula espinal. Las acumulaciones de alfa-sinucleína eran sarcosilo insoluble y colocalized con ubiquitina y p62, y fueron acompañadas por una respuesta inflamatoria que resulta en gliosis astrocítica y microgliosis. Sorprendentemente, la inoculación de las fibrillas de alfa-sinucleína en la lengua fue menos eficaz en la causa de la enfermedad, con sólo uno de los cinco animales inyectados que muestran patología alfa-sinucleína después de 285 días. Nuestros resultados muestran que la inoculación por vía intraglossal y más aún a través de la ruta intraperitoneal es adecuado para inducir la enfermedad neurológica con características pertinentes de sinucleinopatías en Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones. Esto proporciona un nuevo modelo para el estudio de la patogénesis prión inducird por prionoids alfa-sinucleína en mayor detalle.
Introducción
Hay evidencia creciente de que la alfa-sinucleína tiene características que son similares a las de la proteína priónica, en particular en su capacidad de auto-semillas y se propagan mal plegamiento entre las células y a lo largo de las vías neuronales. Esta propiedad de la alfa-sinucleína también se conoce como 'prion-como' o 'prionoid', y es apoyado por observaciones en experimentos de trasplante, que sugieren la transmisibilidad de mal plegada alfa-sinucleína de neuronas enfermas a trasplantado recién neuronas sanas 1, 2 , 3, 4. También la inyección directa de mal plegada alfa-sinucleína en el cerebro o la periferia, por ejemplo, el músculo del miembro posterior o de la pared intestinal, resulta en una extensión de la patología de la alfa-sinucleína a partes distales del CNS 5, 6, 7, 8, 9, 10. Se analizaron transmisión de prionoids alfa-sinucleína a través de rutas periféricas con más detalle y se dirigió a la cuestión de si mal plegada alfa-sinucleína puede neuroinvade el SNC después de una sola intraglossal o inyección intraperitoneal, una característica que anteriormente se había demostrado por priones, pero no para alfa- mal plegada sinucleína. Después de la inyección de los priones en la lengua, la neuroinvasión del SNC se logra a través de la propagación a lo largo del nervio hipogloso de la lengua que conduce al núcleo del nervio hipogloso, que se encuentra en el tronco cerebral 11. Como un modelo de ratón que elegimos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que sobreexpresan el mutante A53T de alfa-sinucleína humana a partir del promotor prión, y luciferasa de luciérnaga bajo el control de un promotor de GFAP para controlar la activación de astrocitos por bioluminiscencia, como se muestra anteriormente en el cerebro deratones 12 priones infectados. En nuestras manos Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) bigenic los ratones no desarrollaron la enfermedad hasta los 23 meses de edad como se ha demostrado por otros 13. Una sola inyección de fibrillas de alfa-sinucleína humanos a través de la intraglossal o enfermedad neurológica ruta inducida intraperitoneal con patología en el cerebro y médula espinal de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones que apoyan la hipótesis de que prionoids alfa-sinucleína compartir características importantes con priones 14.
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Protocolo
Todos los procedimientos, incluidos los animales se llevaron a cabo con la aprobación del comité de protección de los animales de la Agencia de Renania del Norte-Westfalia Estatal de Medio Ambiente (LANUV). Los animales fueron alojados y cuidados de acuerdo con condiciones estándar con un 12 h ciclo de luz / oscuridad y acceso libre a comida y agua.
1. Modelo animal
- Intercross hemizygous Tg (GFAP -luc +/-) ratones con ratones hemizygous Tg (M83 +/-) para generar hemizygous bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones 15, 16.
- Genotipo la progenie con PCR en tiempo real para la presencia del transgén que codifica la alfa-sinucleína humana y con PCR estándar para la luciferasa de luciérnaga 12, 17.
- Inocular a los animales a una edad de seis a ocho semanas.
2. Preparación del inóculo
- preparar monomeric alfa-sinucleína humana recombinante con la mutación A53T en tampón de solución salina tamponada con Tris (TBS) que contenía NaCl 150 mM en 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) como se ha descrito previamente 14.
- Preparar fibrilar alfa-sinucleína para inoculaciones por agitación 3 g / l de monómero alfa-sinucleína humana recombinante en un agitador orbital a 800 rpm y 37 ° C durante 5 días.
- Diluir conjuntos de fibrillas en solución salina tamponada con fosfato (PBS) para alcanzar una concentración final de 1 g / l para intraperitoneal o 2 g / l para inoculaciones intraglossal.
- Fragmentar las fibrillas de alfa-sinucleína con un sonicador de varilla durante 1 min (40 impulsos de 0,5 s de duración con una pausa de un segundo entre cada pulso y una amplitud ajustado a 50%) en hielo. Para evitar la contaminación por la cruz-siembra. Utilice sondas de sonicación limpios para preparar diferente inóculo.
3. Las inyecciones Intraglossal
- Anestesiar los animales con un intrapeinyección ritoneal de 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada. Utilice ungüento veterinario en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Fijar animales narcotizados cuidadosamente con cinta adhesiva sobre una placa de calentamiento en una posición de decúbito dorsal con las cabezas orientadas hacia el investigador.
- Llene una jeringa hipodérmica desechable 27 G con 5 l de fibrillas de alfa-sinucleína sonicó o PBS.
- Use una pinza de nariz chata pulgar con puntas dentadas para sostener la boca del animal abierta, y un par de segundos más pequeño fórceps para tirar con cuidado la lengua para que el lado inferior de la lengua accesible para inyección.
- Inyectar la aguja de la jeringa en la parte inferior derecha o izquierda de la lengua en la proximidad del nervio hipogloso. inyectar lentamente el inóculo después de 5 s. retraer lentamente la aguja después de 5 s para garantizar que el inóculoha penetrado en el tejido y no se pierde mientras se retrae la aguja.
- Soltar el animal de su fijaciones y dejarlo en la placa de calentamiento bajo monitorización constante hasta la recuperación completa.
4. inyecciones intraperitoneales
- Para las inyecciones intraperitoneales, narcotizar los animales en breve en una cámara de anestesia por inhalación con isoflurano / oxígeno utilizando un caudal de 2 L / min y el vaporizador se establece en 2%. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada.
- Llene una jeringa hipodérmica desechable 27 G con 50! L de las fibrillas de alfa-sinucleína sonicó o PBS.
- Directamente inyectar en el peritoneo del ratón y evitar penetrar en el intestino delgado o intestino ciego situado detrás de la pared abdominal mediante la celebración de al animal en una posición dorsal con la cabeza alejado del investigador y hacia abajo en aproximadamente 45 °. Observar a los animales hasta que se recuperende la anestesia.
5. La bioluminiscencia Imaging
- Image Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones cada 2-4 semanas utilizando un sistema de imágenes de bioluminiscencia.
- Antes de la formación de imágenes poco anestesiar los ratones en una cámara de isoflurano / oxígeno con un caudal de 2 L / min y el vaporizador se establece en 2%. Una pizca dedo gordo del animal y confirmar que no retira su extremidad posterior para asegurar la anestesia adecuada.
- Afeitado y depilar las cabezas de los ratones con una crema depilatoria. Colorear los oídos en negro con un marcador no irritante para bloquear la bioluminiscencia no específica.
- Diluir sal de potasio de D-luciferina, el sustrato de la luciferasa, en PBS a una solución madre de 30 mg / mL. Almacenar esta en partes alícuotas de 1 ml a -20 ° C. Proteger el D-luciferina disuelto a partir de la exposición a la luz.
- Pesar los animales antes de la inyección. Calcular el volumen exacto de D-luciferina para la inyección de 150 mg / kg peso corporal. Intraperitonealmente inyectar D-luciferin y devolver el animal a la cámara de anestesia.
- Iniciar el software de imágenes. Después de que el sistema de imagen ha alcanzado su temperatura de funcionamiento inicializar el sistema haciendo clic en el botón 'Inicializar' en el panel de control.
- Seleccione los botones 'luminiscentes' y 'fotografía'. Ajuste el tiempo de exposición a 60 s, el binning a 'Medio', el F / parada en '1', y la ganancia EM en 'Off'.
- Confirmar que el filtro de excitación se establece en 'Bloquear' y el filtro de emisión a 'Open', y ajusta la altura sujeto a 1,50 cm.
- Diez minutos después de la inyección con D-luciferina, colocar los animales sobre la placa de calentamiento en la cámara de formación de imágenes y asegurar que sus hocicos se colocan correctamente en la salida de la anestesia. Cierre el flujo de isoflurano / oxígeno de la cámara de inhalación y abrir el flujo de la cámara de formación de imágenes con una velocidad de flujo de 0,25 L / min y una evaporación de 2%. Cerrar la puerta de la cámara de imágenes prpresenten anomalías correspondientes.
- Haga clic en el botón 'Acquire' para medir la bioluminiscencia, que tarda 60 s. Detener el flujo de isoflurano y controlar a los animales hasta que se hayan recuperado después de regresar de vuelta a sus jaulas.
- Utilice el software de imágenes para cuantificar la bioluminiscencia. Dentro de la 'paleta de herramientas' seleccionar 'Herramientas de ROI. En 'Tipo' 'dentro de las herramientas de ROI' seleccionar "Medición de ROI.
- Dentro de las 'Herramientas de ROI' clic en la herramienta "círculo" y seleccione el número de regiones de interés para dibujar en el menú desplegable - idealmente '3' para los tres ratones.
- En la imagen, haga clic en cada ROI y bajo 'Properties' ajustar la anchura y la altura a 1,25 cm. Posicionar cada ROI sobre el área del cerebro que se cuantifica.
- En la parte superior izquierda de la imagen, ajustar el panel de unidades de 'radiación (fotones).
- Dentro de la 'Paleta de herramientas', seleccione 'Ajuste de imagen' y ajustar el mínimo yel máximo de la 'Escala de Color', por ejemplo, de 0.20e6 a 1.00e6.
- En 'Archivo' guardar los datos con 'Guardar'.
6. Análisis bioquímico
- Aislar los cerebros y las médulas espinales de acuerdo con protocolos establecidos 18, 19.
- Homogeneizar de todo el cerebro y las muestras de médula espinal enteros separado en PBS en presencia de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa (diluido a 1x en PBS) en dos 30 s ciclos con 6.000 rpm en un homogeneizador de tejidos. Asegúrese de que el cerebro y las muestras de la médula espinal se homogeneizan a una concentración final de 20% (peso / vol).
- Sonicar las muestras dos veces mientras que los mantiene en hielo con un pulso constante de 10 s y una amplitud establece en 50%.
- Ajuste los homogeneizados a 10% en PBS y NaCl 750 mM por ellos diluir 1: 1 con 1,5 M NaCl en PBS.
- Para separar los residuos celulares, centrifugar los homogenados a 1.000 xg durante 5 min a4 ° C. Mantener los sobrenadantes para los próximos pasos y desechar los pellets.
- Medir la concentración de proteína en los homogeneizados utilizando el ensayo de ácido bicinconínico (BCA) según las instrucciones del fabricante. Incubar 1,0 mg de proteína total a partir de homogeneizados de cerebro o 0,8 mg de homogeneizado de médula espinal en N-laurylsarcosyl a una concentración final de 10% (peso / vol) durante 15 min en hielo.
- Superposición de los homogeneizados sobre un colchón de sacarosa al 3 ml de 10% (peso / vol) en agua destilada y ultracentrifugar ellos en 465.000 xg durante 1 hora a 4 ° C.
- Resuspender los pellets en un tampón que contenía 4% de dodecilsulfato de sodio (SDS), 2% β-mercaptoetanol, glicina 192 mM, Tris 25 mM, y 5% (peso / volumen) de sacarosa.
- Hervir las muestras a 100 ° C durante 5 min y cargarlos en geles de SDS-poliacrilamida para electroforesis en un sistema de tampón de ácido morpholineethanesulfonic (MES).
- La transferencia de las proteínas separadas a difluoruro de polivinilideno (PVDF) membranas en un semiDry sistema secante.
- Se incuban las membranas en 0,4% (vol / vol) solución de formalina en PBS durante 30 min a temperatura ambiente en un rotor con 35 rpm para reticular las proteínas con la membrana.
- Bloquear las membranas en tampón de TBS que contiene 0,05% (vol / vol) de Tween 20 y la leche 5% (peso / vol) durante 1 h a temperatura ambiente.
- Se incuban las transferencias con el anticuerpo primario en tampón de bloqueo durante la noche a 4 ° C.
- Se lavan las membranas tres veces en tampón TBS y se incuban con anticuerpos secundarios peroxidasa o fluoróforo conjugado en TBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Visualizar los anticuerpos secundarios unidos por quimioluminiscencia o fluorescencia de acuerdo con protocolos establecidos 20.
Análisis 7. La inmunofluorescencia
- Deshidratar los cerebros diseccionados y las médulas espinales en una estación de procesamiento de tejidos e insertarlos en parafina utilizando una estación de parafina.
- Cortar el tis embebido en parafinademanda a con un microtomo en 8 micras secciones coronales gruesas y montar las secciones sobre portaobjetos de vidrio.
- Desparafinar las secciones de tejido mediante su incubación en dos baños xilol separados por 5 a 10 min y rehidratar ellos a través de una serie de baños de etanol graduado (100%, 90%, 70%, 50%) y finalmente con H 2 O.
- Incubar las secciones en tampón de 0,01 M de citrato (pH 6,0) durante 5 min a temperatura ambiente y, además, hervir durante 10 min en un horno microondas.
- Deje que las secciones se enfríen a temperatura ambiente y se incuban con una solución de peróxido de hidrógeno al 3% durante 30 min para inhibir peroxidasas endógenas.
- Bloquear las secciones de tejido por incubación con 20% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de albúmina de suero bovino (BSA), y 0,5% de Triton X-100 en PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Incubar las secciones con el anticuerpo primario diluido en 1% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de BSA, y 0,25% de Triton X-100 en PBS durante la noche a 4 ° C.
- Lavar las secciones dos veces con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 en PBS y una vez con PBS.
- Tinción de las secciones con los anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado correspondientes y la DAPI colorante nuclear diluido en 1% (vol / vol) de suero de cabra normal, 1% (vol / vol) de BSA, y PBS durante 1 h a temperatura ambiente.
- Después de lavar dos veces con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 en PBS y una vez con PBS, los portaobjetos cubreobjetos con medio de incrustación y visualizar la tinción con un microscopio de escaneo láser confocal.
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Resultados
Inyección periférica de prionoids alfa-sinucleína a través de la lengua o el peritoneo inducida neuropatología en el SNC de bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones (Tabla 1 y Figura 1). Después de una única inyección intraperitoneal con fibrillas de alfa-sinucleína, cuatro de cinco ratones desarrollaron enfermedad neurológica con una mediana de tiempo de incubación de 229 ± 17 días. Sorprendentemente, sólo uno de los ci...
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Discusión
Inyección periférica de las fibrillas de alfa-sinucleína en el peritoneo de Tg (M83 +/-: GFAP -luc +/-) ratones representa un método fácil para inducir la enfermedad neurológica acompañada de la neuroinflamación recapitular características importantes de sinucleinopatías. Del mismo modo, la inyección lengua representa otra ruta para la neuroinvasión por prionoids alfa-sinucleína en ratones transgénicos, pero es menos eficiente. Hemos elegido para poner fin a los experimentos en 420 días de...
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Olga Sharma, Theresa Hundt, y el personal de las instalaciones de microscopía y animales DZNE de apoyo técnico.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anti-actina anticuerpo | Merck Millipore | MAB1501 | |
| anti-alfa-sinucleína, fosfo S129 anticuerpo [pSyn#64] | Wako | 015-25191 | |
| anti-alfa-sinucleína, fosfo S129 anticuerpo [EP1536Y] | Abcam | ab51253 | |
| anticuerpo anti-GFAP | Dako | Z0334 01 | |
| anti-IBA-1 | anticuerpo Wako | 019-19741 | |
| anticuerpo anti-Sequestosoma-1 (p62) | Proteintech | 18420-1-AP | |
| anticuerpo anti-ubiquitina [Ubi-1] | Merck Millipore | MAB1510 | |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Invitrogen | 14190169 | |
| Ketamina | Ratiopharm | 100 mg/kg | |
| Xilacina | Ratiopharm | 10 mg/kg | |
| Jeringa de 27 G | VWR | 613-4900 | |
| Isoflurano | Piramal Healthcare | PZN 4831850 | |
| Crema depilatoria | Veet | ||
| Secureline marcador de laboratorio | Neolab | 25040 | |
| D-luciferina sal de potasio | Acris | LK10000 | 30 mg/mL solución madre |
| Thermomixer | Eppendorf | 5776671 | |
| Sonopuls Mini20 sonicador | Bandelin | 3648 | |
| IVIS Lumina II sistema de imagen | PerkinElmer | ||
| Living Image 3.0 Software | PerkinElmer | ||
| ratones Tg(M83+/-) o B6; Ratones C3-Tg (Prnp-SNCA * A53T) 83Vle/J | El Laboratorio Jackson | 004479 | |
| Pinzas de patrón estándar | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| Pinzas de patrón estrecho | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| N-laurylasarcosyl | Sigma | L5125-100G | |
| Optima Max-XP ultracentrífuga | Rotor Beckman Coulter | TLA-110 | |
| Tubos de policarbonato de tajo grueso | Beckman Coulter | 362305 | |
| NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels | Anticuerpo conjugado Thermo Fisher Scientific | WG1401BOX | |
| HRP | Cayman | Cay10004301-1 | |
| IR Dye 680 anticuerpo conjugado | LI-COR Biosciences | 926-68070 | |
| SuperSignal West Dura Sustrato de duración extendida | Thermo Fisher Scientific | 34075 | |
| Stella 3200 sistema de imagen | infrarrojo Raytest | ||
| Odyssey | LI-COR Biosciences | ||
| Tween 20 | MP Biomedicals | TWEEN201 | |
| Triton X-100 | Sigma | SA/T8787 | |
| Immobilon-FL Membrana PVDF | Merck Millipore | IPFL00010 | |
| Xylol | Sigma | Roth | |
| Peróxido de hidrógeno | Sigma | SA/00216763/000500 | solución de trabajo 3% |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Thermo Fisher Scientific | A3294-100G | |
| Suero de cabra | Thermo Fisher Scientific | PCN5000 | |
| 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | dilución de trabajo 1:50.000 |
| Medios de fluoromontaje | Microscopio | Omnilab SA/F4680/000025 | |
| LSM700 | Carl Zeiss | ||
| HALT inhibidores de la proteasa y la fosfatasa | Thermo Fisher Scientific | ||
| Precellys 24-Homogeneizador dual | Peqlab | 91-PCS24D | |
| Anticuerpo conjugado Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A31619 | |
| Anticuerpo conjugado Alexa Fluor 594 | Thermo Fisher Scientific | A11005 | |
| Pierce BCA Proteína Ensayo Kit | 10741395 | Thermo Fisher Scientific | |
| RM2255 Microscopio | |||
| LSM700 | Carl Zeiss |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
