Detección de la expresión de microARN en la membrana peritoneal de ratas mediante PCR cuantitativa en tiempo real

Resumen

Aquí presentamos un protocolo para la detección de la expresión de microRNA en la membrana peritoneal de rata mediante la cuantitativa de reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa en tiempo real. Este método es adecuado para estudiar el perfil de expresión de microARN en la membrana peritoneal de rata en varias condiciones patológicas.

Resumen

MicroRNAs (miRNAs) son pequeños ARN no codificantes que regulan la expresión del ARN mensajero post-transcriptionally. El perfil de expresión de miARN se ha investigado en diversos órganos y tejidos en ratas. Sin embargo, los métodos estándar para la purificación de miARNs y la detección de su expresión en la membrana peritoneal de rata no han sido bien establecidos. Hemos desarrollado un método eficaz y fiable para purificar y cuantificar miARNs utilizando cuantitativa en tiempo real de transcripción reversa reacción en cadena de la polimerasa (qRT-PCR) en la membrana peritoneal de rata. Este protocolo consta de cuatro pasos: 1) purificación de la muestra de membrana peritoneal; 2) purificación del ARN total incluyendo miARN de la muestra de membrana peritoneal; 3) transcripción inversa de miARN para producir cDNA; Y 4) qRT-PCR para detectar la expresión de miARN. Usando este protocolo, hemos determinado con éxito que la expresión de seis miRNAs (miARN-142-3p, miARN-21-5p, miRNA-221-3p, miARN-223-3p, miRNA-327, y miRNA-34a-5p)Significativamente en la membrana peritoneal de un modelo de fibrosis peritoneal de rata en comparación con los de los grupos de control. Este protocolo puede usarse para estudiar el perfil de la expresión de miARN en la membrana peritoneal de ratas en muchas condiciones patológicas.

Introducción

MicroRNAs (miRNAs) son cortos, no codificantes RNAs que post-transcriptionally regular la expresión de ARN mensajero (mRNA) ¹ . Los cambios en la expresión de miRNAs regulan la expresión de muchos mRNAs que desempeñan papeles fundamentales en diversas condiciones patológicas, incluyendo el cáncer, la inflamación, los trastornos metabólicos y la fibrosis ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} . Por lo tanto, miRNAs tienen poten....

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de ética animal de la Universidad Médica de Jichi y se realizaron de acuerdo con las directrices de Uso y Cuidado de Animales Experimentales de la Guía de la Universidad Médica de Jichi para Animales de Laboratorio.

1. Colección de muestras de peritoneo

1. Recoger los siguientes artículos: Tubo centrífugo de 50 ml con algodón empapado en isoflurano, lámina de corcho, placa de Petri con solución salina tamponada con fosfato (PBS), tijeras quirúrgicas y fórceps.
2. Eutanasiar una rata con una sobredosis de isofluorano, luego rociar la piel abdomin....

Resultados

Los resultados presentados aquí se basan en nuestro estudio previamente informado ⁸ . Se investigó el perfil de expresión de miARN en la fibrosis peritoneal. La fibrosis peritoneal es una complicación importante en la diálisis peritoneal. Se caracteriza por la pérdida de la monocapa de células mesoteliales y el exceso de acumulación de componentes de la matriz extracelular, y se asocia con la falla de la membrana peritoneal [ ^{14 ,}

Discusión

Utilizando el protocolo presentado en este manuscrito, miRNAs en la membrana peritoneal de rata fueron purificados con éxito y detectado utilizando qRT-PCR. La fiabilidad del análisis de datos de qRT-PCR depende de la calidad de miRNAs purificados. Por lo tanto, la pureza de miRNAs se puede comprobar antes de qRT-PCR por la relación de absorbancia a 260 nm a la de 280 nm, que se puede medir con un espectrofotómetro. Cuando la amplificación significativa de miARN no puede obtenerse utilizando qRT-PCR, la concentración de.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Trituradora QIA	Qiagen	79654	sistema de trituración de biopolímeros en una microcentrífuga columna de centrifugación
miRNeasy Mini kit	Qiagen	217004	columna de centrifugación a base de membrana de sílice
QIAzol reactivo de lisis	Qiagen	79306	reactivo de lisis a base de fenol/guanidina
Tampón RLT	Qiagen	79216	tampón de lavado 1 tampón
RWT	Tampón de lavado Qiagen	1067933
2 miScript II RT kit	Qiagen	218161	incluye 10 veces; Mezcla de nucleicos que contiene desoxinucleótidos, trifosfatos de ribonucleótidos y cebadores de oligo-dT; Mezcla de transcriptasa inversa miScript que contiene poli(A) polimerasa y transcriptasa inversa y; tampón miScript HiSpec
miScript SYBR Green PCR kit	Qiagen	218073	incluye QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix y miScript Universal Primer
RNU6-2 primer	Qiagen	MS00033740	no divulgado
miRNA-142-3p cebador	Qiagen	MS00031451	5'-UGUAGUGUUUCC UACUUUAUGGA-3'
cebador miRNA-21-5p	Qiagen MS00009079		5'-UAGCUUAUCAG ACUGAUGUUGA-3'miRNA-221-3p
cebador	Qiagen	MS00003857	5'-AGCUACAUUGU CUGCUGGGUUUC-3'miRNA-223-3p
cebador	Qiagen	MS00033320	5'-UGUCAGUUUG UCAAAUACCCC-3'miRNA-34a-5p
cebador	Qiagen	MS00003318	5'-UGGCAGUGUCU UAGCUGGUUGU-3'miRNA-327
cebador	Qiagen	MS00000805	5'-CCUUGAGGGG CAUGAGGGU-3'MicroAmp
Optical Placa de reacción de 96 pocillos para qRT-PCR	Thermo Fisher Scientific	4316813	placa de reacción de 96 pocillos
MicroAmp Optical Adhesive Film	Thermo Fisher Scientific	4311971	película adhesiva para placa de reacción de 96 pocillos
QuantStudio 12K Flex Flex Sistema de PCR en tiempo real	Flex Thermo Fisher Scientific		4472380 instrumento de PCR en tiempo real
QuantStudio 12K Flex Software versión 1.2.1.	Thermo Fisher Scientific	4472380	software de instrumento de PCR en tiempo real
metilglioxal	Sigma-Aldrich	M0252
Midperic	Terumo	no asignado	diálisis peritoneal
Sprague – Dawley rats	SLC	no asignar

líquido de