Este protocolo describe la detección de microscopía confocal de receptor acoplado a proteína G internalización (GPCR) en células de mamífero. Incluye la cultura básica celular, transfección, y el procedimiento de microscopía confocal y proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de GPCR de fusión expresada.
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Artículo de método
La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal
En este artículo
Resumen
Resumen
La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) es una técnica de imagen óptica para imágenes de alto contraste. Es un enfoque poderoso para visualizar proteínas de fusión fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), para determinar su expresión, localización y función. La localización subcelular de las proteínas diana es importante para la identificación, caracterización y análisis funcional. La internalización es uno de los mecanismos predominantes que controlan la señalización del receptor acoplado a proteína G (GPCR) para garantizar las respuestas celulares adecuadas a los estímulos. En este trabajo describimos un método experimental para detectar la localización e internalización subcelular de GPCR en células HEK293 con microscopía confocal. Además, este experimento proporciona algunos detalles sobre el cultivo celular y la transfección. Este protocolo es compatible con una variedad de marcadores fluorescentes ampliamente disponibles y es aplicable a la visualización de la localización subcelular de la mayoría de las proteínas, así como de la internalización de GPCR. Esta técnica debería permitir a los investigadores manipular de manera eficiente la expresión génica de GPCR en líneas celulares de mamíferos y debería facilitar los estudios sobre la localización e internalización subcelular de GPCR.
Introducción
Las células poseen la maquinaria tráfico de carga para el transporte de materiales -tales como ligandos, microorganismos, nutrientes y proteínas de transmembrana en la célula de información, la energía y otros fines 1, 2 extracelular. Es crítico para la homeostasis celular, la función del tejido, y la supervivencia celular en general. La expresión basada en células de proteínas de fusión fluorescentes es una forma poderosa para estudiar la localización y la internalización de los receptores transmembrana, tales como G receptores acoplados a proteínas (GPCR), en las vías de señalización 3.
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Protocolo
1. Preparación de células
- La recuperación celular
- Transferencia de las 293 células criopreservadas de riñón embrionario humano (HEK293) a partir de un tanque de nitrógeno líquido a un baño de agua C 37 ° y agitar continuamente durante 1 - 2 min.
- Añadir 10 ml de medio de crecimiento completo equilibrado (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de solución de penicilina-estreptomicina suero bovino (FBS) y 1% fetal) a una placa de cultivo celular de 10 cm. añadir con cuidado las células descongeladas al medio de crecimiento equilibrado.
- Se incuban las células en una camisa de agua CO 2 incuba....
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Resultados
La Figura 1 muestra un ejemplo de un sistema de microscopio confocal. La Figura 2 presenta la expresión de pEGFP-N1 en células HEK293. Se detectó la señal de GFP en el citoplasma y núcleo. La Figura 3 muestra la localización subcelular de GnRHR de S. japonica en células HEK293, consistentes con nuestros resultados publicados previamente 15. La proteína de fusión con la etiqueta de EGFP en el extremo C-ter.......
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Discusión
El protocolo presentado aquí proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de la proteína de fusión GPCR expresado en células HEK293. La técnica se puede adaptar fácilmente para muchos genes diferentes y tipos de células, tales como para la localización celular y la internalización del receptor corazonin de Bombyx mori en células HEK293 y BMN 16.
La aplicación exitosa de este poderoso .......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores de este artículo desean agradecer al Prof. Jiayan Xie por la asistencia técnica y el uso del equipo. Este trabajo contó con el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (41406137).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Línea celular HEK293 | |||
| DMEM/Hidrocona de glucosa alta | SH30022.01 | L-glutamina de glucosa alta 4.0 mM | |
| Suero fetal bovino (FBS) | PuFei | 1101-100 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Genom | GNM10010 | |
| Penicilina-estreptomicina | Genom | GNM15140 | |
| 0.25% de tripsina y 0.02% EDTA | Genom | ||
| Opti-MEM (1x) | GIBCO, de Life Technologies | 31985-062 | de suero reducidos |
| Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección | Invitrogen | 11668027 Reactivo 1 | |
| X-tremeGENE HP DNA Reactivo de transfección | Roche | 6366236001 Reactivo 2 | |
| DAPI Solución de tinción | Beyotime | C1006 | |
| DiI | Beyotime | C1036 | |
| Medio de montaje antidecoloración | Beyotime | P0126 | |
| Paraformaldehído | Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC) | 80096618 | |
| Cultivo celular de 100 mm | CORNING | 430167 | |
| placa de 6 pocillos | ExCell Bio | CS016-0092 | |
| placa de 12 pocillos | ExCell Bio | CS016-0093 | |
| Cubreobjetos | de | ||
| Citoglas | 10127105P-G | ||
| Thermo Scientific Forma CO2 Incubadora | Thermo | 3111 | |
| TCS SP5II microscopio confocal de barrido láser | Leica |
Referencias
- Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
- Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
- Kallal, L., Benovic, J. L.
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Reimpresiones y permisos
