La detección de activados por ligando G receptor acoplado a proteína internalización por microscopía confocal

Resumen

Este protocolo describe la detección de microscopía confocal de receptor acoplado a proteína G internalización (GPCR) en células de mamífero. Incluye la cultura básica celular, transfección, y el procedimiento de microscopía confocal y proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de GPCR de fusión expresada.

Resumen

La microscopía de barrido láser confocal (CLSM) es una técnica de imagen óptica para imágenes de alto contraste. Es un enfoque poderoso para visualizar proteínas de fusión fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), para determinar su expresión, localización y función. La localización subcelular de las proteínas diana es importante para la identificación, caracterización y análisis funcional. La internalización es uno de los mecanismos predominantes que controlan la señalización del receptor acoplado a proteína G (GPCR) para garantizar las respuestas celulares adecuadas a los estímulos. En este trabajo describimos un método experimental para detectar la localización e internalización subcelular de GPCR en células HEK293 con microscopía confocal. Además, este experimento proporciona algunos detalles sobre el cultivo celular y la transfección. Este protocolo es compatible con una variedad de marcadores fluorescentes ampliamente disponibles y es aplicable a la visualización de la localización subcelular de la mayoría de las proteínas, así como de la internalización de GPCR. Esta técnica debería permitir a los investigadores manipular de manera eficiente la expresión génica de GPCR en líneas celulares de mamíferos y debería facilitar los estudios sobre la localización e internalización subcelular de GPCR.

Introducción

Las células poseen la maquinaria tráfico de carga para el transporte de materiales -tales como ligandos, microorganismos, nutrientes y proteínas de transmembrana en la célula de información, la energía y otros fines ^{1, 2} extracelular. Es crítico para la homeostasis celular, la función del tejido, y la supervivencia celular en general. La expresión basada en células de proteínas de fusión fluorescentes es una forma poderosa para estudiar la localización y la internalización de los receptores transmembrana, tales como G receptores acoplados a proteínas (GPCR), en las vías de señalización ^3.

La expresión de proteínas de fusión etiquetadas con proteína verde fluorescente (GFP) de medusa Aequorea victoria, combinada con técnicas de detección de fluorescencia directa, ha ganado amplia aceptación en proteínas de metas de investigación ^{4, 5, 6.} detecti basada en GFPOn tiene la ventaja de permitir la obtención de imágenes en tiempo real de las células vivas y evitar artefactos de fijación ^7. Una serie de vectores de clonación versátiles se ha construido para facilitar la expresión de fusiones de proteínas a GFP en diversas células ^{8, 9.} El vector pEGFP-N1 es un vector plásmido ampliamente utilizado y comercializado que codifica una proteína verde fluorescente (EGFP), que ha sido optimizado de GFP de tipo salvaje para más brillante de fluorescencia y mayor expresión en células de mamífero. Para observar la señal fluorescente de EGFP expresa en células de mamífero, la microscopía de fluorescencia debe llevarse a cabo con la excitación a 488 nm y la emisión a 507 nm, preferiblemente con microscopía confocal.

Control de la localización subcelular y la internalización mediada por ligando de los receptores es una técnica común para investigar la transducción de la señal y la función de los GPCR ^{10 11.} En la mayoría de los casos, la internalización conduce a la desensibilización de los GPCRs (la atenuación de la respuesta de estímulo a pesar de la presencia de agonistas) ^{12, 13.} Los receptores internalizados pueden ser incorporados en el lisosoma y degradado, o pueden ser reciclados de nuevo a la superficie celular, dependiendo de la naturaleza de los receptores y las líneas celulares utilizadas en los experimentos.

Los receptores de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHRs) pertenecen a la familia GPCR y tienen una estructura típica de proteínas GPCR, con un terminal amino extracelular, un terminal -COOH intracelular, y siete transmembrana (TM) Dominios ^14. La transfección del plásmido recombinante Sj GnRHR-EGFP (con el gen GnRHR de Sepiella japonica) y la detección la microscopía confocal de GnRHR Sj EGFP-etiquetados (expresado en células HEK293) se informó Previouastuto, y la fluorescencia de GFP se estableció como un reportero para los ensayos de localización de la proteína transmembrana ^15. Ahora, la internalización de Sj GnRHR, activado por S. japonica hormona liberadora de gonadotropina (GnRH Sj), se demostró en modales tiempo- y dependientes de la dosis por microscopía confocal.

Protocolo

1. Preparación de células

1. La recuperación celular
   1. Transferencia de las 293 células criopreservadas de riñón embrionario humano (HEK293) a partir de un tanque de nitrógeno líquido a un baño de agua C 37 ° y agitar continuamente durante 1 - 2 min.
   2. Añadir 10 ml de medio de crecimiento completo equilibrado (medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), 10% de solución de penicilina-estreptomicina suero bovino (FBS) y 1% fetal) a una placa de cultivo celular de 10 cm. añadir con cuidado las células descongeladas al medio de crecimiento equilibrado.
   3. Se incuban las células en una camisa de agua CO ₂ incubadora a 37 ° C con una atmósfera humidificada que contiene 95% de aire y 5% de _CO2 durante 2 - 4 h.
   4. Después de 2 - 4 h, comprobar que las células se adjuntan. Reemplazar el medio de crecimiento equilibrado y de cultivo por otro 24 - 48 h.
      NOTA: Cambiar el medio de crecimiento equilibrado es útil porque elimina sulfóxido de dimetilo (DMSO) y protege contra el daño celular.
2. paso Celular
   1. Después de 24 - 48 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia, desechar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células con 2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Agitar el plato suavemente.
   2. Desechar el PBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA (solución salina, 0,25% de tripsina y 0,02% de EDTA). Para digerir completamente las células, agitar el plato cuidadosamente y aspirar fuera de la solución de tripsina-EDTA. Ponga el plato en el 37 ° C con camisa de agua de _CO2 durante 3 min.
      NOTA: Durante este período, preparar tres nuevos 10 cm placas de cultivo celular y añadir 10 ml de medio de crecimiento equilibrado a cada uno.
   3. El uso de un microscopio de luz, determinar si las células se han levantado de la parte inferior del plato. Añadir 2 ml de medio de crecimiento equilibrado al plato. Mezclar mediante pipeteo y pipetear inmediatamente 0,6 ml de la suspensión celular a cada uno de los nuevos platos. Se mezclan suavemente mediante pipeteado y permiten que las células se incuban a 37 ° C y 5% de _CO2.

Siembra 2. Cell

1. Después de 24 - 48 h, cuando las células a pases han crecido hasta cerca de la confluencia, desechar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células con 2 ml de PBS. Agitar el plato suavemente.
2. Desechar el PBS y añadir 1 ml de tripsina-EDTA. Para digerir completamente las células, agitar el plato cuidadosamente y aspirar fuera de la tripsina-EDTA. Ponga el plato en el 37 ° C con camisa de agua de _CO2 durante 3 min.
   NOTA: Durante este período, preparar una placa de 6 pocillos mediante la adición de 2 ml de medio de crecimiento equilibrado a cada pocillo.
3. Añadir 1 ml de medio de crecimiento equilibrado al plato, si, bajo la observación microscópica, las células que han levantado de la parte inferior del plato. Mezclar mediante pipeteo y de inmediato pipetear 0,1 ml de suspensión de células (el volumen se ajusta de acuerdo a la densidad de crecimiento de las células) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos preparado (placa de células menos de 6 pocillos con 2 ml de medio de crecimiento equilibrado). Mezclar suavemente pipeteando y permitir que las célulasincubar a 37 ° C y 5% de _CO2.

Transfección 3. Cell

1. Método de transfección 1, con formulaciones de liposomas
   NOTA: Por favor, véase la Tabla de Materiales para el reactivo de transfección 1.
   1. Al día siguiente, asegurar que las células deben ser del 85 - 95% confluentes.
   2. Añadir 3 g de ADN plásmido (500 ng / l) y 100 l de medio de suero reducido a un tubo de microcentrífuga estéril, y mezclar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   3. Preparar 9 l de Reactivo 1 y 100 l de medio de suero reducido en otro tubo de microcentrífuga, y mezclar suavemente. Incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
   4. Combinar la mezcla de plásmido se diluyó con diluido Reactivo 1 (volumen total = 215 l). Mezclar suavemente y se incuba durante 20 min a temperatura ambiente.
   5. medio Aspirar placa de células cultivadas, y añadir 1,5 ml de DMEM fresco sin FBS.
   6. Añadir 215! L de DNA-transfección mezcla de reactivos a cada gota a gota bien, y mezclar suavemente por agitación de la placa.
   7. Incubar a 37 ° C y 5% de _CO2 durante 4 - 8 h. Reemplazar con DMEM fresco con 10% de FBS.
   8. Se incuban las células a 37 ° C y 5% de CO ₂ durante otras 24 - 48 h antes de ejecutar cualquier experimentos.
2. Método de transfección 2, con las formulaciones de liposomas
   NOTA: Por favor, véase la Tabla de Materiales para el reactivo de transfección 2.
   1. Añadir medio de suero 2 g de ADN plásmido (500 ng / l), 4 l de Reactivo 2, y 100! L redujeron en un tubo estéril de microcentrífuga. Mezclar suavemente y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
   2. Añadir la mezcla de transfección a las células de una manera gota a gota.
   3. Después de la transfección, se incuban las células durante 24 - 48 h a 37 ° C y CO ₂ al 5%, antes de ejecutar cualquier experimentos.

4. Cultivo de células en cubreobjetos

1. Remover el medio de crecimiento de la placa de 6 pocillos de cultivo.
2. Lavar la monocapa de células con 1 ml de PBS sin calcio y magnesio.
3. Añadir 0,5 ml de tripsina-EDTA. Agitar el plato con cuidado y aspirar fuera de tripsina-EDTA. Incubar la placa de cultivo durante 3 min a 37 ° C y 5% de _CO2. El tiempo de incubación real varía con la línea celular utilizada.
   NOTA: Durante este período, preparar una nueva placa de 12 pocillos y añadir 15 mm de diámetro cubierta estéril se desliza a cada pocillo. Los cubreobjetos recubiertos con lisina, la laminina, o colágeno pueden mejorar la unión de las células para las células HEK293 que se desprenden fácilmente.
4. Cuando se separan las células, se añade medio de crecimiento completo 1 ml pre-calentado a cada pocillo. Mezclar mediante pipeteo y transferir inmediatamente el número requerido de células a la placa de 12 pocillos con cubreobjetos. Añadir medio de cultivo completo fresco a cada pocillo para ajustar el volumen total a 1 ml
5. Se incuban las células durante 16 - 24 h a 37 ° C y CO ₂ al 5%.
   NOTA: Después de 30 -60 min, la mayoría de las células se han adherido a los cubreobjetos estériles.

5. Confocal Microscopy Detección

1. localización celular
   1. Después de 16 - 24 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia en los cubreobjetos estériles en la placa de 12 pocillos, añadir la sonda de membrana, DiI, a cada pocillo, dando una concentración final de 5? M. Permitir que las células se incuban durante 30 min a 37 ° C y 5% de _CO2.
   2. Después de 30 min, eliminar el medio de crecimiento equilibrado y lavar las células dos veces en PBS frío (2 - 8 ° C).
   3. Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 min.
      Precaución: El paraformaldehído es moderadamente tóxico por contacto con la piel o por inhalación, y se designa como un carcinógeno humano probable. Productos químicos humos capuchas, recintos de balance de ventilación u otras medidas de protección debe utilizarse durante el manejo de pesaje y de paraformaldehído.
   4. Lavar las células fijadas dos veces en PBS. Añadir 200-300 l de DAPI (4' , 6-diamidino-2-fenilindol) solución (0,5 mg / ml) a cada pocillo y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente.
   5. Lavar las células dos veces con PBS. Retire cuidadosamente la cubierta se desliza de la placa y la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos de microscopio cargados con una gota de medio de montaje (50% v / v de glicerol / agua). Eliminar el exceso de medio de montaje de los portaobjetos.
2. internalización celular
   1. Después de 16 - 24 h, cuando las células han crecido hasta cerca de la confluencia en los cubreobjetos estériles en la placa de 12 pocillos, quitar el medio de crecimiento equilibrado y añadir fresco, calentado medio DMEM (37 ° C). Se incuban las células durante 1 hora a 37 ° C y 5% de _CO2.
   2. Tratar las células con diferentes concentraciones (0, 10 ^-12, 10 ^-9, y 10 ^-6 M) de ligando para 30 min y tratarlos con 10 ^-6 M ligando para diferentes momentos (0,10, 30 y 60 min).
   3. Lavar las células dos veces en PBS frío (2 - 8 ° C). Fijar las células mediante la adición de 1 ml de una solución de paraformaldehído al 4% (en PBS) a cada pocillo. Agitar suavemente durante 15 min.
   4. Lavar las células dos veces en PBS. Retire cuidadosamente la cubierta se desliza de la placa y la mecha el exceso de PBS. Invertir en portaobjetos de microscopio cargados con una gota de medio de montaje (50% v / v de glicerol / agua). Eliminar el exceso de medio de montaje de los portaobjetos.
3. Microscopia confocal
   1. A su vez en el hardware del microscopio confocal, incluyendo la potencia de la lámpara de mercurio, microscopio PC, escáner, y el láser. Accede a la cuenta del sistema operativo, iniciar el software, compruebe la configuración y seleccione láser. A su vez en las diferentes unidades del sistema de microscopía confocal en el orden según las instrucciones.
   2. Colocar los portaobjetos preparados sobre la platina del microscopio. Coloque la muestra sobre la lente del objetivo utilizando el controlador de etapa. Añadir una gota de aceite de cedro ena cubreobjetos cuando se selecciona la lente de inmersión en aceite. Coloque la cubierta se desliza en las diapositivas que se enfrenta la lente.
   3. Encuentra las células de interés bajo el microscopio de fluorescencia.
   4. Cambiar al modo de escaneo. Elegir la potencia del láser y el rango espectral de la emisión del fluoróforo. Capturar las imágenes confocal de alta calidad por la intensidad del láser afinación y otros parámetros.

Resultados

La Figura 1 muestra un ejemplo de un sistema de microscopio confocal. La Figura 2 presenta la expresión de pEGFP-N1 en células HEK293. Se detectó la señal de GFP en el citoplasma y núcleo. La Figura 3 muestra la localización subcelular de GnRHR de S. japonica en células HEK293, consistentes con nuestros resultados publicados previamente ^15. La proteína de fusión con la etiqueta de EGFP en el extremo C-ter...

Discusión

El protocolo presentado aquí proporciona un método eficiente y fácilmente interpretable para detectar la localización subcelular y la internalización de la proteína de fusión GPCR expresado en células HEK293. La técnica se puede adaptar fácilmente para muchos genes diferentes y tipos de células, tales como para la localización celular y la internalización del receptor corazonin de Bombyx mori en células HEK293 y BMN ^16.

La aplicación exitosa de este poderoso ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Línea celular HEK293
DMEM/Hidrocona de glucosa alta		SH30022.01	L-glutamina de glucosa alta 4.0 mM
Suero fetal bovino (FBS)	PuFei	1101-100
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Genom	GNM10010
Penicilina-estreptomicina	Genom	GNM15140
0.25% de tripsina y 0.02% EDTA	Genom
Opti-MEM (1x)	GIBCO, de Life Technologies	31985-062	de suero reducidos
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección	Invitrogen		11668027 Reactivo 1
X-tremeGENE HP DNA Reactivo de transfección	Roche		6366236001 Reactivo 2
DAPI Solución de tinción	Beyotime	C1006
DiI	Beyotime	C1036
Medio de montaje antidecoloración	Beyotime	P0126
Paraformaldehído	Sinopharm Chemical Reagent Co.(SCRC)	80096618
Cultivo celular de 100 mm	CORNING	430167
placa de 6 pocillos	ExCell Bio	CS016-0092
placa de 12 pocillos	ExCell Bio	CS016-0093
Cubreobjetos	de
	Citoglas	10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2 Incubadora	Thermo	3111
TCS SP5II microscopio confocal de barrido láser	Leica