Un método simple para identificar quinasas que regulan la pluripotencia de las células madre embrionarias mediante la detección de inhibidores de alto rendimiento

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo cuantitativo y escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas para los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva.

Resumen

Las células madre embrionarias (ESC) pueden auto-renovarse o diferenciarse en todos los tipos de células, un fenómeno conocido como pluripotencia. Distintos estados pluripotentes han sido descritos, denominados pluripotencia "naïve" y "primada". Los mecanismos que controlan la transición ingenua-primed son mal entendidos. En particular, seguimos siendo mal informados sobre las proteínas quinasas que especifican naïve y primado pluripotentes estados, a pesar de la creciente disponibilidad de alta calidad de los compuestos de la herramienta de sonda quinasa función. Aquí, describimos una plataforma escalable para llevar a cabo pantallas de moléculas pequeñas dirigidas a los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva-cebada en CES de ratón. Este enfoque utiliza condiciones sencillas de cultivo celular y reactivos estándar, materiales y equipos para descubrir y validar inhibidores de quinasas con efectos hasta ahora no apreciados sobre la pluripotencia. Discutimos aplicaciones potenciales para esta tecnología, incluyendo cribado de otras moléculas pequeñasColecciones tales como inhibidores de quinasa cada vez más sofisticados y bibliotecas emergentes de compuestos de herramientas epigenéticos.

Introducción

Las células madre embrionarias (ESC) tienen la capacidad de auto-renovarse o diferenciarse en cualquier tipo celular en el cuerpo adulto, un fenómeno conocido como pluripotencia ¹ . Evidencia reciente indica que existen estados pluripotentes distintos del desarrollo, denominados pluripotencia "naïve" y "cebada" ² . Naïve CES representan un estado de desarrollo similar a la que se encuentra en el embrión preimplantación [ ^3] . Por el contrario, los CES pluripotentes preparados están preparados para salir de la pluripotencia y diferenciarse en linajes embrionarios especializados ^{4 , 5} .

Los estados pluripotentes naïve y priming están marcados por redes reguladoras de genes distintas. La pluripotencia naïve se caracteriza por la expresión de factores clave de transcripción de pluripotencia tales como Nanog, factores de transcripción tipo Krueppel (Klfs), Rex1 ² y Esrrb 6. En los CES de ratón (mESCs), la pluripotencia primada se caracteriza por una expresión reducida de marcadores ingenuos y una firma de expresión génica específica que incluye la ADN metiltransferasa de novo Dnmt3b ⁷ . Las células madre epiblasas pluripotentes pluripotentes primitivas (EpiSCs) ^{4 , 5} expresan adicionalmente el marcador de Epiblast Fgf5 y marcadores de cebado de linaje tales como Brachyury ⁸ .

Los mESCs proporcionan un modelo manejable para sondar los mecanismos que controlan las transiciones pluripotentes iniciadas por ingenuo in vitro . Cuando se cultivan en factor inhibidor de leucemia (LIF) y suero bovino fetal (FBS), los MESC experimentan una transición dinámica entre estados pluripotentes naïve e iniciados ^{9 , 10} . Funciones de señalización LIF-Jak-Stat3 para promover una ingenua red reguladora de genes ¹¹ , mientras que la señalización autocrina a través de la vía Erk1 / 2 del factor de crecimiento de fibroblastos 4 (Fgf4) conduce la transición al estado iniciado ¹² . Sin embargo, sigue siendo un desafío para evaluar sistemáticamente el papel de las proteínas quinasas en la especificación de distintos estados pluripotentes.

Aquí, describimos una plataforma cuantitativa y escalable para realizar pantallas de moléculas pequeñas dirigidas a los reguladores de quinasa de la transición pluripotente primitiva. Utilizamos condiciones simples de cultivo de mESC y reactivos estándar, materiales y equipos para descubrir y validar inhibidores de quinasas con capacidad hasta ahora no apreciada para estabilizar la pluripotencia ingenua. Además, se discuten potenciales aplicaciones extendidas para esta tecnología, incluso para el cribado de otras colecciones de moléculas pequeñas tales como bibliotecas de inhibidores emergentes dirigidas a reguladores epigenéticos.

Protocolo

1. Colocación de Bibliotecas de Inhibidores de Quinasa de Pequeña Molécula

1. Agrupar las librerías inhibidoras de las colecciones de inhibidores de quinasa accesibles al público, por ejemplo , la Biblioteca de Redes Integradas de Firmas Celulares (LINCS) de Harvard Medical School, una colección selectiva de 228 potentes y selectivos inhibidores de quinasa (http://lincs.hms.harvard.edu) , Y el conjunto de inhibidores de la proteína quinasa (PKIS), una colección de compuestos 376 reunida por investigadores industriales (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) ¹³ . Alternativamente, ensamble una colección inhibidora de quinasa a medida de compuestos comercialmente disponibles.
   NOTA: En nuestro laboratorio, hemos reunido una colección de 72 inhibidores potentes y selectivos de quinasas de herramientas que cubren 51 cinasas objetivo primarias, todas las cuales están disponibles de fuentes comerciales.
2. Ensamble los inhibidores de quinasas en placas de 96 pocillos para un procesamiento óptimo de alto rendimiento en concentraciones múltiples (use 1, 0.1 aNd 0,01 mM). Incluya en cada placa pocillos de control que contengan sólo DMSO e inhibidores de control de referencia PD173074 (FGFRi) y Ruxolitinib (JAKi), que se sabe que promueven los estados pluripotentes naïve y cebado respectivamente. Anotar en una hoja de cálculo o software similar.

2. Condiciones y procedimientos de cultivo de la mESC para la preparación de la pantalla

1. Preparar platos de 10 cm revestidos con gelatina al 0,1% mediante la adición de 5 ml de gelatina al 0,1% (p / v) a placas de 10 cm e incubar a temperatura ambiente durante 5 min. Aspirar la gelatina y dejar secar la placa durante 2 min.
2. Cultivo de cualquier línea estándar de mESC a 37 ° C 5% de CO ₂ sobre placas de 10 cm revestidas con gelatina al 0,1% en medio MESC estándar (véase Tabla de Materiales) que contiene 100 ng / ml de GST-LIF, 10% de Suero fetal de ternera y 5% Reemplazo. Reemplazar los medios de comunicación todos los días y pasar los mESCs a alrededor del 80% de confluencia cada segundo día a una dilución de 1: 5-1: 10.
3. Al paso mESCs, aspirar los medios y lavar con 5 mL oF de solución salina tamponada con fosfato (PBS) por placa.
4. Añadir 1 ml de tripsina-EDTA (tripsina al 0,05%, EDTA al 0,02%) por placa de mESCs e incubar a 37 ° C durante 10 min.
5. Resuspender las células tripsinizadas en 4 ml de medio de mESC y centrifugar a 1.200 rpm durante 5 min.
6. Resuspender completamente el sedimento celular en 5 ml de medio mESC, pipetear hacia arriba y hacia abajo para generar una única suspensión celular.
7. Contar las células mediante la combinación de una suspensión de 10 μL de células y 10 μ l de azul Trypan (0,4%). Coloque en una cámara de recuento de células o utilice un hemocitómetro y un microscopio óptico.
8. Se sembró 3 x 10 ³ mESCs en placas de 96 pocillos revestidas con gelatina al 0,1%, volumen final 100 μl de medio, usando una pipeta multicanal.
9. Aplique inhibidores de quinasa a una dilución de 1: 100 (1 μl de inhibidor añadido a 100 μl de medio) usando una pipeta multicanal. Pipetar suavemente los medios para mezclar el inhibidor y la suspensión celular, luego dejar que las células se asienten en una campana de cultivo de tejidos durante 1 h para asegurar una distribución igual de acroSs la superficie de la galjanoplastia. Células de cultivo durante 48 h sin cambiar los medios.
   NOTA: Las placas de reserva de 1 / 0.1 / 0.01 mM darán una concentración de inhibidor final de 10/1 / 0.1 μM, respectivamente. Se recomienda iniciar la pantalla a una concentración final de 1 μM para asegurar la inhibición efectiva de las quinasas diana primarias, al mismo tiempo que se minimizan los efectos fuera de destino.

3. Análisis de detección de inhibidores de quinasa

1. Lavar las placas mESC de 96 pocillos en 200 μl de PBS usando un aspirador multicanal y pipetas.
2. Hacer extractos celulares en 150 μl de tampón de lisis (Tris 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, NP-40 al 1% (v / v), desoxicolato de sodio al 0,5% (p / v), β-glicerofosfato 10 mM , Pirofosfato sódico 10 mM, NaF 1 mM, Na _ { ₃ } VO _ {4} 2 mM, Comprimidos completos para cocteleros con inhibidores de proteasas).
3. Aclarar los extractos por centrifugación a 1.500 xg durante 30 min en placas de 96 pocillos de fondo en V.
4. Inmovilizar 100 μL de sobrenadantes en un nitrocelDe membrana de lulosa utilizando un colector de puntos de vacío de 96 pocillos.
5. Seque la membrana y se mancha con 40 mL de Ponceau S para asegurar una transferencia consistente.
6. Lavar la membrana con TBST y bloquear en TBST / 3% (p / v) de leche.
7. Incubar en anticuerpos Nanog y Dnmt3b a una dilución de 1: 1.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche en polvo durante la noche.
8. Lavar las membranas en 3 x 10 min en TBST e incubar en 30 ml de anticuerpos secundarios a una dilución de 1: 10.000 (v / v) en TBST / 3% (p / v) de leche.
9. Desarrollar utilizando un sistema de imagen inmunoblotting digital.
   NOTA: Si es posible, utilice inmunoblotting de fluorescencia cuantitativa para detectar Nanog y Dnmt3b. Sin embargo, la señal de fondo para Dnmt3b por inmunotransferencia de fluorescencia es demasiado alta. Por lo tanto, se utilizan anticuerpos secundarios de fluorescencia anti-conejo (Nanog) y anti-ratón-HRP (Dnmt3b) de 800 nm.

4. Análisis de datos de pantalla y validación de inhibidores como reguladores de pluripotencia de buena fe

NOTA: Este es un paso crítico para asegurar que sólo se identifiquen moduladores de pluripotencia de buena fe. Es esencial triar inhibidores basados ​​tanto en la relación Nanog: Dnmt3b como en la señal global, para asegurar que los inhibidores de quinasa que afectan negativamente a la supervivencia de mESC no se seleccionan para un análisis posterior.

1. Cuantificar la señal de Nanog y Dnmt3b utilizando el software de análisis de inmunotransferencia e importar valores en una hoja de cálculo o software similar. Calcular la relación Nanog: Dnmt3b para todas las muestras en comparación con el control de DMSO. Además, determinar la señal total de Nanog y Dnmt3b para asegurar que los inhibidores de la quinasa no afectan a la relación Nanog: Dnmt3b alterando la viabilidad del mESC.
2. Utilizar relaciones Nanog: Dnmt3b para identificar inhibidores que promuevan la pluripotencia ingenua (relación Nanog: Dnmt3b mayor que el control) y pluripotencia (Nanog: Dnmt3b ratio inferior al control). Ajustar el corte a una desviación de 2x de los valores de control, y filtrar los inhibidores de quinasa que producen una señal Nanog + Dnmt3b total de menos que50% del valor de control de DMSO para generar una lista de confianza alta de inhibidores de quinasa que estabilizan los estados pluripotentes naïve (alto Nanog: Dnmt3b ratio) y primado (bajo Nanog: Dnmt3b ratio).
3. Validar los inhibidores de la quinasa mediante la siembra de mESCs a 2 x 10 ⁵ células por 6 pocillos en 2 ml de medio y añadir inhibidores de quinasa a 1 μM durante 48 h, sin cambiar los medios.
4. Lyse mESCs en tampón de lisis y analizar la expresión de Nanog y Dnmt3b por inmunotransferencia SDS-PAGE convencional.
5. Además validar hits por SDS-PAGE immunoblotting para naïve pluripotencia marcadores Klf2 y Klf4, y Oct4 para garantizar que la pluripotencia se mantiene después de 48 h de tratamiento con inhibidores.

Resultados

Utilizando el procedimiento presentado aquí ( Figura 1 ), se selecciona la biblioteca LINCS de 228 potentes y selectivos inhibidores de quinasa para identificar los que modulan mESC pluripotencia. La biblioteca se prepara a una concentración de 0,1 mM para una dilución 1: 100 y concentración final de selección de 1 μM en mESCs. 48 h después, los mESCs se lisaron y se prepararon extractos para el análisis cuantitativo dot blot de la expresión de Nanog y Dnmt3b ( Figura 2 , parte superior). Los resultados de otras concentraciones de cribado no se representan aquí por brevedad. Se determina la relación Nanog: Dnmt3b para cada inhibidor de quinasa y se clasifican los compuestos y se aplica un corte 2x ( Figura 2 , parte inferior). La señal total de Nanog y Dnmt3b relativa al control se superpone a la clasificación de inhibidores y se somete a un corte de 0,5x, para permitir la selección de inhibidores que muestren una toxicidad significativa de mESC. Los inhibidores selectivos de la quinasa que estabilizan a los naïve staTe se validan usando inmunotransferencia Nanog / Dnmt3b convencional ( Figura 3 ). Los objetivos de cinasa primaria de estos inhibidores se presentan en la Tabla 1 . También demostrar la aplicabilidad de esta pantalla para identificar los inhibidores que estabilizar el estado de cebado [ ^14] .

Figura 1: Flujo de trabajo para el cribado de inhibidores de quinasa que modulan la transición primitiva. MESC se trataron con una biblioteca de inhibidor de quinasa compuesto 228 a una concentración final de 1 μM. Los lisados ​​se prepararon y se transfirieron a membranas de nitrocelulosa para análisis por inmunotransferencia, y se determinaron los niveles de Nanog y Dnmt3b (Figura adaptada de Williams et al., ¹⁴ ). Haga clic aquí para ver Arger de esta figura.

Figura 2: Análisis de pantalla de pluripotencia con cebado naïve e identificación del inhibidor. (Superior) Representante Nanog y Dnmt3b immuno dot-blot imágenes. (Parte inferior) Se determinaron los valores de Nanog y Dnmt3b para cada inhibidor de quinasa en relación con el control de DMSO, y se determinaron las relaciones de Nanog: Dnmt3b y la señal relativa total de Nanog + Dnmt3b y los inhibidores se clasificaron en comparación con el control de DMSO. Se identificaron inhibidores que alteraban la relación de Nanog: Dnmt3b más allá de un umbral de 2 veces superior o inferior al control de DMSO como conductores de pluripotencia inocua o cebada. Se fijó un umbral de 2x por debajo del control de DMSO a inhibidores de triaje que comprometieron la supervivencia de mESC. Se destacan los inhibidores seleccionados para su posterior validación. (Figura adaptada de Williams et al., ¹⁴ ).S / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Validación de los compuestos de éxito seleccionados identificados. MESCs fueron tratados con 1 μ M AZD4547 (un inhibidor selectivo FGFR) o los inhibidores indicados identificados a partir de la pantalla en la Figura 2. Nanog: Dnmt3b niveles determinados por SDS-PAGE estándar y análisis de inmunotransferencia. Los valores numéricos de Nanog relativo: Dnmt3b y Nanog + Dnmt3b se indican en la tabla a continuación, e inhibidores que estabilizan el estado pluripotente naïve resaltado en verde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Compuesto	Objetivos primarios		Otras metas
AV-951	VEGFR
HG-6-64-01	ABL, BRAF, RET, CSF1R, EGFR, EPHA8, FGFR, FLT3, KIT, LOK, MAP4K1, p38b, MUSK, PDGFR, TAOK3, TNNI3K
WH-4-023	Lck		Src
R406	Syk
GW-572016	HER2		EGFR
KIN001-244	PDK1
WZ-4-145	CSF1R, DDR1, EGFR, TIE1, PDGFR2
WZ-7043	CSF1R, DDR1, FGFR y TAO1
GW786034	VEGFR1		VEGFR2, VEGFR3 &# 160;
AZD-1480	JAK2

Tabla 1: Compuestos de impacto seleccionados y su (s) diana (s) de cinasa primaria.

Discusión

Aquí demostramos una metodología ampliamente accesible para investigar el papel de las vías de señalización de la quinasa en la regulación de la transición pluripotente primitiva. Esto aborda una pregunta clave en el campo ESC. Aunque los enfoques de genómica y transcriptómica de alto rendimiento se usan rutinariamente para identificar reguladores transcripcionales clave de estados pluripotentes ingenuos e iniciados, la dilucidación de las redes de señalización de pluripotencia ha demostrado ser un desafío. Ahora proporcionamos una estrategia flexible que emplea inhibidores químicos para identificar quinasas que controlan la transición pluripotente primitiva en mESCs. Esto se basa en equipos simples, reactivos y materiales que están disponibles para la mayoría de los laboratorios que estudian la señalización celular y ESC biología. Crítico para el éxito de esta plataforma es nuestro desarrollo de un ensayo robusto para cuantificar la transición entre ingenuo y primado estados pluripotentes. El establecimiento de este ensayo requirió modificaciones iterativas significativas a las células platDensidad, tiempo de incubación del inhibidor y condiciones de inmunotransferencia.

Los enfoques de moléculas pequeñas están ganando terreno para el uso racional en aplicaciones terapéuticas ESC ^{15 , 16} . Una ventaja importante de la selección de moléculas pequeñas es que los compuestos de herramienta están diseñados y / o modificados para una captación celular eficiente. La eficacia de la transfección no es limitante y no es necesario el uso de sistemas de administración peligrosos como el lentivirus. Además, los inhibidores frecuentemente inhiben múltiples isoformas dentro de una familia de quinasas ( por ejemplo Fgfr1-4, Jak1-3), que supera la redundancia funcional que impide las técnicas de interferencia genética / genómica como RNAi y CRISPR / Cas9. A medida que los compuestos de herramientas más potentes y selectivos se hagan disponibles a partir de programas de descubrimiento de fármacos tanto académicos como farmacéuticos, las quinasas poco estudiadas y mal entendidas serán empujadas a la vanguardia de la investigación de ESC. Por lo tanto, proponemos que este altoEl enfoque de selección desfasada abrirá nuevas vías de investigación en las redes de regulación del CES.

Una limitación menor de esta tecnología es que incluso los inhibidores de moléculas pequeñas más potentes y selectivos se implican e inhiben múltiples quinasas no relacionadas in vivo . Sin embargo, los datos de perfiles de inhibidores de quinasa cada vez más completos permiten identificar fácilmente los objetivos funcionales de los inhibidores de quinasa (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan; http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibidores). Finalmente, en principio, nuestra plataforma puede aplicarse para interrogar cualquier recolección de moléculas pequeñas o ensayos celulares para los que se disponga de anticuerpos de inmunotransferencia de alta calidad. Esto permitirá el estudio de múltiples sistemas reguladores en la regulación de la pluripotencia y facilitar la identificación de los inhibidores de moléculas pequeñas que modifican diversos procesos celulares. Especıficamente, se prevé que la aplicación de colecciones de moléculas peque~nas emergentes tales como el epıgenoTic sondas que está siendo desarrollado por el Structural Genomics Consortium (http://www.thesgc.org/chemicalprobes/epigenetics) tiene el potencial de descubrir más nuevos reguladores de las transiciones pluripotentes.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
mESC media
CCE mESCs	ATCC	ATCC  SCRC-1023
DMEM Media	Gibco	11965092
L-Glutamina	Gibco	25030081	Final: 2 mM
de Penicilina/Estreptomicina	Gibco	15140122	Final: 50 U/ml
2-mercaptoetanol	Sigma	M6250	Final: 0,1 mM
Factor Inhibidor de la Leucemia (fusión GST)	Reactivos y servicios		Final: 100 ng/mL
Factor Inhibidor de la Leucemia	Thermo	PMC9484	Final: 100 ng/mL
de Aminoácidos No Esenciales	Gibco	11140050	Final: 0,1 mM
de Piruvato de Sodio	Gibco	11360070	Final: 1 mM
KnockOut Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	Final: 5%
Definido Suero Fetal Bovino	Fisher 10703464		Final: 10%
Name	>Company	Número de catálogo	Comentarios
TC materiales
Trypsin-EDTA (0.05%), rojo fenol	Thermo	25300054
Gelatina de piel porcina	Sigma	1890
Nunc MicroWell 96-Plate	Thermo	156545
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Gibco	14190136
V-bottom 96 pocillos	Greiner Bio-one	651261
Name	Company	< strong>Número de catálogo	Comments
Lysis Buffer
		103157P
Cloruro de sodio	VWR	97061
EDTA	Sigma	E4884
1% NP-40	Sigma	9016-45-9
Sodio Desoxicolato	Sigma	D6750-100g
β-glicerofosfato	Sigma	G9422
Pirofosfato de sodio	Sigma	13472-36-1
Fluoruro de sodio	Sigma	450022
Ortovanadato de sodio	Sigma 450243
Roche Inhibidor de Proteasa Completo Tabletas de Cóctel Sigma		CO-RO
strong>Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Químicos
Tween	Sigma	P1379-1L
Leche en polvo	Marvel
Name	Company	Número de catálogo	Comentarios
Western Blotting
Protran BA 85 Nitrocelulosa 0.45 &micor; M  Tamaño de poro (20 cm x 20 cm Hojas) (25 Hojas)	GE	10401191
Ponceau S	Sigma	P7170-1L
Nombre	Compañía	Número de catálogo	Comentarios
Equipo de laboratorio
Minifold I Sistema	GE	10447850
ChemiDoc	BioRad	1708280
LiCor Odyssey Imager	LiCor
Name	Company	>Número de catálogo	Comentarios
>Antibodies
Anti-mouse Nanog	Reprocell	RCAB001P
Anti-Dnmt3b	Imgenex	IMG-184A
IRDye 800CW Burro anti-Conejo	Licor	926-32213
Tecnología de Señalización Celular	Anti-Ratón-HRP	7076S
Anti-Klf2	Millipore	09-820
Anti-Klf4	R& D Sistemas	AF3158
Anti-Oct4	Santa Cruz	sc-5279