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Artículo de método

Mejora de la Fuerza, Potencia, Capacidad Aeróbica Muscular y Tolerancia a la Glucosa a través del Entrenamiento de Fuerza Progresiva a Corto Plazo entre Ancianos

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DOI:

10.3791/55518

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5 de julio de 2017

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1Åstrand Laboratory of Work Physiology, The Swedish School of Sport and Health Sciences, GIH, 2Department of Neuroscience, Karolinska Institutet, 3Department of Physiology and Pharmacology, Karolinska Institutet

En este artículo

Resumen

El efecto del entrenamiento de resistencia a corto plazo en personas mayores fue investigado mediante el uso simultáneo de varios métodos. En comparación con un grupo control, se observaron muchas mejoras, como la capacidad aeróbica muscular, la tolerancia a la glucosa, la fuerza, el poder y la calidad muscular ( es decir, la proteína implicada en la señalización celular y la composición del tipo de fibra muscular).

Resumen

Este protocolo describe el uso simultáneo de una amplia gama de métodos para examinar la capacidad aeróbica muscular, la tolerancia a la glucosa, la fuerza y ​​el poder en las personas mayores que realizan entrenamiento de resistencia a corto plazo. El entrenamiento de resistencia progresiva supervisada durante 1 h tres veces a la semana durante 8 semanas fue realizado por participantes RET (71 ± 1 años, rango 65-80). En comparación con un grupo de control sin entrenamiento, el RET mostró mejoras en las medidas utilizadas para indicar la fuerza, potencia, tolerancia a la glucosa y varios parámetros de la capacidad aeróbica muscular. Entrenamiento de fuerza se realizó en un gimnasio con sólo equipo de gimnasio robusto. Un dinamómetro isocinético para la fuerza del extensor de la rodilla permitió la medición de la fuerza concéntrica, excéntrica y estática, que aumentó para el grupo RET (8-12% post-versus pre-test). La potencia (velocidad de desarrollo de la fuerza, RFD) a los 0-30 ms iniciales también mostró un aumento para el grupo RET (52%). Una prueba de tolerancia a la glucosa con frequeNt de glucosa en sangre mostraron mejoras sólo para el grupo RET en términos de valores de glucosa en sangre después de 2 h (14%) y el área bajo la curva (21%). El perfil lipídico en la sangre también mejoró (8%). A partir de muestras de biopsia muscular preparadas utilizando histoquímica, la cantidad de fibra tipo IIa aumentó y una tendencia hacia una disminución de IIx en el grupo RET reflejó un cambio en un perfil más oxidativo en términos de composición de fibra. Western blot (para determinar el contenido de proteínas relacionadas con la señalización de la síntesis de proteínas musculares) mostró un aumento del 69% tanto en Akt y mTOR en el grupo RET; Esto también mostró un aumento en las proteínas mitocondriales para el complejo OXPHOS II y citrato sintasa (ambos ~ 30%) y para el complejo IV (90%), sólo en el grupo RET. Demostramos que este tipo de entrenamiento de resistencia progresiva ofrece varias mejoras ( por ejemplo, fuerza, potencia, capacidad aeróbica, tolerancia a la glucosa y perfil lipídico plasmático).

Introducción

El envejecimiento se asocia con una pérdida de masa muscular (sarcopenia), fuerza y ​​potencia. Reducción de la fuerza, y probablemente aún más importante, el poder, los resultados en la inmovilidad, un mayor riesgo de lesiones, y una calidad de vida reducida. El entrenamiento de resistencia es una estrategia bien conocida para contrarrestar la sarcopenia y el deterioro de la función muscular. Se puede obtener una estimación aproximada de la fuerza muscular a partir de la carga o del número de repeticiones logradas. Sin embargo, este estudio obtuvo información más detallada y precisa sobre la función muscular utilizando un dinamómetro isocinético para recopilar información sobre el par durante la contracción isométrica, concéntrica y excéntrica, así como sobre la cinética del desarrollo de la fuerza.

La capacidad aeróbica, tanto a nivel del cuerpo entero (VO 2 máx ) como en el músculo esquelético, se reduce en las personas mayores. La disminución de la frecuencia cardíaca con la edad explica una gran parte de la disminución del VO 2máx 1 ,La capacidad oxidativa, en gran medida relacionada con la reducción de la actividad física 2 , contribuye. La función mitocondrial deteriorada también puede estar implicada en el desarrollo de sarcopenia y resistencia a la insulina 3 . La capacidad aeróbica muscular fue evaluada en biopsias musculares a través de análisis bioquímicos de los contenidos de enzimas mitocondriales y complejos de proteínas localizados tanto en la matriz (citrato sintasa) como en la membrana mitocondrial interna. Además, se utilizaron técnicas histoquímicas para medir el efecto del entrenamiento de resistencia sobre la morfología del músculo ( es decir, la composición del tipo de fibra, el área transversal de la fibra y la densidad capilar). Un método alternativo para evaluar la capacidad aeróbica muscular sería utilizar la espectroscopía de resonancia magnética para medir la tasa de resíntesis de creatina fosfato después de la depleción inducida por el ejercicio [ 4] . Este método proporciona una estimación de la capacidad aeróbica muscular in vivoPero no puede discriminar entre disfunción mitocondrial y trastornos circulatorios. Además, los altos costos del equipo limitan el uso de esta técnica en la mayoría de los laboratorios. La capacidad aeróbica (VO 2 máx y densidad mitocondrial) puede mejorarse mediante el ejercicio de resistencia en personas jóvenes y ancianas 5 , 6 . Sin embargo, el efecto del entrenamiento de resistencia sobre estos parámetros ha sido menos investigado, especialmente en sujetos de edad avanzada, y los resultados son conflictivos 7 , 8 , 9 , 10 .

La diabetes tipo 2 es una enfermedad generalizada en la población de edad avanzada. La inactividad física y la obesidad son factores importantes relacionados con el estilo de vida que explican el aumento de la incidencia de la diabetes tipo 2. El ejercicio aeróbico de baja intensidad se recomienda a los sujetos con tolerancia reducida a la glucosa. Sin embargo, es uncAprender cómo el entrenamiento de fuerza en los ancianos afecta la tolerancia a la glucosa / sensibilidad a la insulina 11 , 12 . La forma más precisa de medir la sensibilidad a la insulina es utilizar la técnica de la pinza de glucosa, donde la glucosa en sangre se mantiene constante por la infusión de glucosa durante las condiciones de insulina elevada [ 13] . Las desventajas con esta técnica son que consume tiempo e invasiva (cateterización arterial) y requiere instalaciones especiales de laboratorio. En este estudio, la prueba de tolerancia a la glucosa oral, que es común en las unidades de salud, se utilizó. Este método es adecuado cuando varios sujetos deben ser investigados durante un periodo de tiempo limitado.

Los ensayos y la cronología del procedimiento experimental pueden resumirse como sigue. Utilice tres días separados para las pruebas antes y después de un período de ocho semanas, con la misma disposición y horarios aproximados (≥24 h entre cada día, < Fuerte> Figura 1). En el primer día de prueba, medir: datos antropométricos, tales como altura, masa corporal, masa libre de grasa (FFM) y circunferencia de la parte superior de la pierna ( es decir, 15 cm por encima del ápice de la rótula en posición supina relajada). Capacidad de ciclismo submáximo; Y la fuerza muscular de la rodilla, como se describe en los pasos 4 y 5. Tome una biopsia muscular del muslo en el segundo día de prueba. Para obtener descripciones adicionales, consulte el paso 6.1. Pruebe la tolerancia oral a la glucosa (OGTT) el último día de prueba. Para obtener descripciones adicionales, consulte el paso 7.1. Pida a todos los participantes que eviten una actividad física vigorosa durante 24 horas y que ayunen durante la noche antes de cada día de prueba. Sin embargo, pídales que eviten la actividad física extenuante durante 48 horas antes del día de prueba de la OGTT. Pídales que sigan su actividad física diaria normal y hábitos de dieta. Tenga en cuenta que antes y después de la intervención, tanto los grupos de auto-reporte de la ingesta de alimentos y el tipo de alimentos se mantuvieron sin cambios.

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Figura 1: Protocolo experimental. Diagrama esquemático. El tiempo entre los tres exámenes previos y posteriores fue similar para cada sujeto y fue de al menos 24 h. Más detalles se dan en el texto. Esta cifra ha sido modificada de Frank et al. Scand. J. Med. Sci. Deportes . 2016: 26, 764 - 73. 28 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este estudio buscó investigar el efecto del entrenamiento de resistencia a corto plazo en personas mayores sobre la capacidad oxidativa muscular y la tolerancia a la glucosa. El segundo objetivo fue examinar el efecto sobre la fuerza, la potencia y las mejoras cualitativas musculares ( es decir, las proteínas implicadas en la señalización celular y la composición del tipo de fibra muscular).

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Protocolo

El Comité Regional de Ética de Estocolmo, Suecia, aprobó el diseño de la investigación.

1. Material

  1. Reclutar mujeres y hombres relativamente sanos de 65 a 80 años de edad que tengan valores de IMC entre 20 y 30 kg · m -2 . Aleatorícelos en dos grupos. Asegúrese de que los individuos en ambos grupos tengan niveles de actividad física relativamente bajos ( es decir, actividad física diaria moderada y no entrenamiento regular).
  2. Excluir a los usuarios de bloqueadores beta y aquellos con enfermedad coronaria y problemas neurológicos o articulares graves.
  3. Pregunte a los sujetos por su consentimiento por escrito después de informarles de posibles molestias y riesgos en las sesiones de prueba y entrenamiento.
  4. Equilibrar el entrenamiento de resistencia (RET) y el control sin grupos de entrenamiento (CON) en términos de edad, sexo e IMC. Pida a un grupo que realice RET bajo un entrenador durante 1 h tres veces a la semana durante ocho semanas; El otro grupo servirá como controLs (CON).

2. Pruebas y Entrenamiento

Nota: Los ocho ejercicios son ejercicios de entrenamiento de fuerza estándar: sentada presionar las piernas, sentada abdominal crujido, supino pecho prensa, asentada espalda extensión, sentada presionar el hombro, sentado remo, sentado extensión de la pierna (extensión de la rodilla) ; Vea la Figura 8 en la sección Resultados Representativos.

  1. Durante la primera sesión de entrenamiento, evalúe la fuerza máxima en una repetición máxima (1 RM) para cada ejercicio de entrenamiento.
    NOTA: El modelo 1 RM se utiliza comúnmente y se define como la carga a la que el sujeto puede levantar o empujar la resistencia sólo una vez pero no dos veces.
    1. Antes del comienzo, pida al participante realizar un calentamiento corto (con algunos ensayos iniciales con cargas de peso muy bajo) del ejercicio ensayado. Posteriormente, aumente la carga hasta justo por debajo del valor probable de 1 RM (más a menudo el máximo de 3-4 aumentó loAnuncios). Registre la carga máxima que el sujeto puede realizar sólo una vez (= 1 RM).
    2. Mida 1 RM en los ocho ejercicios de entrenamiento de fuerza estándar (vea la Figura 8 en la sección Resultados Representativos). Pida a los sujetos que descansen por lo menos 2-3 min entre cada ejercicio probado.
      NOTA: Se utilizó equipo de entrenamiento de fuerza para todos los ejercicios de entrenamiento, incluyendo las pruebas de cada ejercicio de entrenamiento.
  2. Pida al grupo RET entero que realice 1 h de entrenamiento de fuerza supervisado tres veces a la semana durante ocho semanas. Pida a los participantes que realicen, después del calentamiento, los ocho ejercicios de entrenamiento estándar antes mencionados. Deben repetir un ejercicio 12 veces en cada conjunto y realizar tres series de cada ejercicio. Deje reposar durante 1 min entre cada set y 2-3 min entre cada ejercicio.
    1. Pida a los sujetos que realicen cada ejercicio lo más rápido posible durante la fase concéntrica ( es decir, la fase de acortamiento muscular) y lentamente durante la faseExcéntrica ( es decir, fase de alargamiento muscular).
      NOTA: Los sujetos pueden hacer los ejercicios en cualquier orden. Sin embargo, pídales que empiecen y terminen con un ejercicio de piernas y que también intenten realizar los ocho ejercicios en el orden presentado. Utilice equipo de entrenamiento de fuerza para los ocho ejercicios.
    2. Durante cada sesión de entrenamiento, pida a los participantes que realicen tres series de 75-80% de 1 RM para cada ejercicio. Aumentar la carga en aproximadamente el 5% de la sesión después de cuando un participante puede hacer 12 repeticiones en los tres conjuntos de un ejercicio.

3. Prueba de ciclismo submáximo

Nota: Realice la prueba de ciclos submáxima el día 1 de prueba (ver Introducción y Figura 1 ).

  1. Realice una prueba de cicloergómetro, incluyendo dos niveles submáximos, cada uno durante 4 min 14 , 15 . Ajuste la primera velocidad de trabajo a ser baja (30 W) y la segunda a 60-120 W, sin pausa entre las cargas del cicloergómetro.
    NOTA: La primera carga es la misma para todos los sujetos, pero el segundo y último nivel submáximo debe ser de aproximadamente 65-85% de la frecuencia cardiaca máxima para cada sujeto. Ambas cargas deben ser las mismas antes y después del período de intervención de 8 semanas de entrenamiento.
    1. Base el segundo nivel de carga más alto en las pruebas de familiarización realizadas antes de los ensayos preguntando cómo es físicamente activa la persona y haciendo que el sujeto inicie el ciclo por un corto tiempo; El líder de la prueba formará una opinión basada en la frecuencia cardíaca del sujeto en cuanto a qué carga submáxima final es apropiada.
    2. Anote la media de la frecuencia cardiaca constante (FC) usando un monitor de frecuencia cardiaca a través de un cinturón de pecho durante el último minuto en las tasas de trabajo bajas y altas, tomando la media de la FC observada a las 3:15, 3:30, 3:45 , Y 4:00 min a cada tasa de trabajo.
    3. Utilizar un dispositivo ergo-espirométrico para determinar la composición del gas (O 2 y CO 2 ) en el aire expirado e inspirado. Registrar la relación de intercambio de respiración (RER, es decir, CO 2 / O 2 ), y cuantificar los valores medios RER durante el último minuto (de cuatro medidas cada 15 s) a ambas cargas de carga de trabajo.

4. Fuerza del extensor de la rodilla: par estático, excéntrico y concéntrico y la tasa de desarrollo de la fuerza

Nota: Realizar mediciones de la fuerza de rodilla en el día de prueba 1 (ver Introducción y Figura 1 ).

  1. Antes de las grabaciones, pida al sujeto que efectúe un calentamiento en bicicleta durante 8-10 minutos en un cicloergómetro al nivel submáximo (es decir, aproximadamente 65-85% de la frecuencia cardíaca máxima).
  2. Pida al sujeto que se siente en el banco de un dinamómetro isocinético. Fijar el tronco del sujeto con correas sobre los hombros y las caderas. Asegure firmemente la caña del sujeto al eje del dinamómetro con dos correas: una debajo de la rodilla y una abovE el tobillo. Alinee el eje de la articulación de la rodilla con el centro de rotación del eje del dinamómetro.
  3. Cuando el sujeto está asegurado, evalúe la máxima fuerza voluntaria de la rodilla como par máximo, con el sujeto sentado en el dinamómetro isocinético. Inicialmente, permite al sujeto realizar varios ensayos para familiarizarse con el equipo de resistencia de la rodilla (dinamómetro isocinético).
  4. Pida al individuo que realice cuatro extensiones máximas voluntarias excéntricas y concéntricas de la rodilla (alternativamente), con la pierna derecha a una velocidad angular constante de 30 grados / s. Ajuste el rango de movimiento entre 90 ° y 15 ° (pierna recta = 0 °).
    1. En la tarea excéntrica, pídale al sujeto que resista el eje del dinamómetro con un esfuerzo máximo a través de todo el movimiento desde el ángulo de la rodilla de 15 ° a 90 °. En la tarea concéntrica, pida al sujeto que presione la parte inferior de la pierna en el eje del dinamómetro en una extensión de la rodilla, lo más duro posible en todo el rango de movimiento.
  5. Permita un descanso de 4 minutos después de las grabaciones dinámicas. A continuación, evalúe el par máximo estático de contracción voluntaria (MVC) cuatro veces en un ángulo de 65 ° de la rodilla. En cada prueba estática, pida a los sujetos, sentados en el mismo dinamómetro, que golpeen tan rápido y duro como puedan contra el eje del dinamómetro, que ahora está fijo (a 65 °) y no se puede mover.
  6. Para señales de par (fuerza), convierta las señales analógicas de par a digital utilizando un convertidor analógico-digital conectado al dinamómetro isocinético.
    NOTA: El convertidor cambia automáticamente las señales analógicas del dinamómetro a las señales digitales, que luego se exportan automáticamente al ordenador donde se recogen los datos.
    1. Ajuste la frecuencia de muestreo a 5 kHz en el programa de análisis de software de la computadora. Almacene las señales digitales en el ordenador para un análisis posterior del valor de resistencia con el programa de análisis de software.
  7. En el análisis posterior, utiliceEl valor más alto obtenido de cuatro ensayos para cada sujeto en las mediciones excéntrica, concéntrica y estática. En el programa de software, haga clic en el valor más alto de los cuatro ensayos y anote el valor de resistencia mostrado en la pantalla de la computadora.
    1. Registre el par máximo máximo en las excéntricas y en las grabaciones concéntricas para cada sujeto y el valor de resistencia más alto entre los cuatro ensayos estáticos.
      NOTA: La prueba dinamométrica isocinética de la fuerza del extensor de rodilla en posición sentada tiene confiabilidad y validez apropiadas 16 , 17 .
  8. Mida la velocidad de desarrollo de fuerza (torque) (RFD) durante 0-30 ms y 0-200 ms en el valor más alto encontrado entre los ensayos estáticos. Ajustar el valor de cero en el nivel de 7,5 Nm para el inicio de la contracción de la fuerza extensora de la rodilla (tiempo: 0 ms) 18 , 19 . Mueva el cursor (en el programa de software paraFuerza) al valor "7,5 Nm" en la escala y para obtener la posición durante 0 ms.
    1. Para la evaluación previa a la prueba, ajuste el cursor en el valor de 30 ms (después del tiempo 0 ms). Anote el valor que muestra el aumento en Nm a 30 ms ( es decir, el incremento en Nm de 7,5 Nm = 0 ms). Realice el mismo procedimiento para el valor posterior a la prueba.
    2. Calcule el incremento en el porcentaje del valor Nm (numerador) después de la prueba comparado con el valor Nm (denominador) del pre-test durante el período de 0-30 ms. Por lo tanto, presentar el aumento RFD en porcentaje de la pre-prueba a la post-prueba. Haga los mismos análisis para el intervalo de tiempo de 0-200 ms.

5. Biopsia muscular

Nota: Realice una biopsia muscular el día 2 de la prueba (ver Introducción y Figura 1 ).

  1. Tomar una biopsia muscular de la porción media del músculo del muslo vasto lateral con un conchotome 20 .
    1. Antes de la biopsia, inyectar 1-2 mL de anestesia local subcutáneamente y en la fascia. Después de un par de minutos, haga una incisión con un pequeño bisturí a través de la piel y la fascia, aproximadamente 1/3 de la distancia de la rótula a la espina ilíaca anterior superior. Extraer alrededor de 100-150 mg de tejido muscular utilizando el conchotome.
  2. Las muestras de congelación para histoquímica en isopentano se enfriaron hasta su punto de congelación en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80ºC. Almacene una muestra de 30-50 mg de tejido muscular.
  3. Congelar rápidamente las muestras para análisis de proteínas en nitrógeno líquido y almacenarlas a -80 ° C. Almacene una muestra de 30-50 mg de tejido muscular.

6. OGTT

Nota: Realice el OGTT (prueba oral de tolerancia a la glucosa) el día 3 de la prueba (ver Introducción y Figura 1 ). El tiempo entre el ejercicio y la OGTT debe ser superior a 48 h y debe ser similar entre el pre- y post-tests. Se utiliza un OGTT oral de 2 horas para investigar si las muestras de sangre frecuentes durante este tiempo muestran niveles normales o aumentados, indicando condiciones de diabetes o prediabetes.

  1. Realizar la prueba de OGTT en la mañana sobre los sujetos que han ayunado durante la noche y no han hecho ningún ejercicio extenuante en el día de la prueba o el día anterior.
  2. Tomar muestras de sangre (4 ml) de los participantes en decúbito supino a través de una cánula venosa en la vena antecubital 15 minutos antes y justo antes de la ingesta de glucosa, seguido de 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la ingestión de la glucosa 75 g de glucosa en una solución de 250 g / l).
  3. Centrifugar las muestras de sangre a 1.500 xg y 4 ° C durante 10 min y almacenar el plasma a -20 ° C para el análisis futuro. Utilice las muestras para realizar pruebas estándar de nivel de glucosa (paso 7).
  4. Para glucosa, insulina y c-péptido, calcule el área bajo la curva (AUC) determinando la integral de tiempo de la glucosa por encima de los niveles basales de glucosa. Utilizar los resultados de la OGTTPara calcular la sensibilidad a la insulina para todo el cuerpo usando el método de Matsuda 21 , según la ecuación: 10 000 * √ [(Glucosa basal * Insulina basal ) * ( Media de glucosa * Media de insulina).

7. Análisis de muestras de sangre

  1. Cuantificar la concentración de glucosa en el plasma venoso con un analizador automatizado. Ajustar el nivel de tolerancia a la glucosa alterada a valores de glucosa en sangre> 7,8 mmol / L después de un OGTT de 2 horas 22 .
  2. Utilizar kits ELISA 22 para realizar análisis de plasma de insulina y c-péptido. Utilice un lector de placas. Coloque las placas ELISA para la insulina y el c-péptido en un lector de placas (cada una en una ocasión aparte).
    NOTA: El lector de placas mide la cantidad de insulina y la cantidad de c-péptido midiendo las muestras en la placa a ciertas absorbancias. Los lípidos sanguíneos TG, HDL, apolipoproteína A1 y apolipoproteína B se analizaron con métodos estándar enEl hospital de la universidad de Karolinska, Estocolmo, Suecia.

8. Análisis de muestras musculares

  1. Inmunotransferencia
    1. En primer lugar, liofilizar la muestra muscular en un liofilizador a una presión inferior a 10 -1 mbar durante 12 h. Disítelo de modo que esté libre de sangre y tejido conectivo usando una aguja y una pinza bajo un microscopio óptico. Guárdelo a -80 ° C.
      NOTA: Una cantidad adecuada de músculo está entre 1 y 5 mg de peso seco, pero el protocolo puede ajustarse a menos de 1 mg, hasta llegar a fibras individuales. Debido a la baja cantidad de tejido muscular presente en una biopsia, los valores de ese participante RET no se usaron para inmunotransferencia.
    2. Homogeneizar las muestras musculares (HEPES), ácido etilendiaminotetraacético 1 mM (EDTA), etilenglicol-bis (5 ml) de etilenglicol-bis (Éter β-aminoetilo) -N, N, N ', N'-tetraacet(EGTA), 10 mM de MgCl2, 50 mM de β-glicerofosfato, 1% de TritonX-100, 1 mM de Na3VO4, 2 mM de ditiotreitol, 20 μg / mL de leupeptina, 50 μg / mL de aprotinina, 1% de inhibidor de fosfatasa Cóctel, y 40 μg / μl de PMSF (fluoruro de fenilmetilsulfonilo).
      1. Coloque una cucharada de perlas de óxido de zirconio de 0,5 mm en cada tubo con el músculo. Añadir el tampón y homogeneizar durante 2 x 1 min en el paso de velocidad 7-8 (aquí, el máximo es 10) y 4 ° C.
    3. Centrifugar el homogeneizado durante 10 min a 10.000 x g. Transferir el sobrenadante restante a nuevos tubos y descartar el sedimento que contiene las proteínas estructurales.
    4. Espectrofotométricamente determinar la concentración de proteínas en el sobrenadante con un kit comercialmente disponible utilizando un lector de placas a 660 nm [ 23] .
      1. A continuación, diluir las muestras con 2 x tampón de muestra de Laemmli y tampón de homogeneización (1: 1) hasta una concentración final de proteína de 1,5 mu g /# 181; L. Calentar a 95 ° C durante 5 minutos para desnaturalizar las proteínas. Almacenar las muestras diluidas a -20 ° C antes del análisis.
    5. Para electroforesis en gel de poliacrilamida nativa (PAGE), cargar 30 μg de proteína de cada muestra en geles de gradiente prefabricado de 18 pocillos (4-20% de acrilamida) y realizar electroforesis a 300 V durante 30 min en hielo.
    6. Equilibrar el gel en tampón de transferencia (base Tris 25 mM, glicina 192 mM y metanol al 10%) durante 30 minutos a 4ºC. Transferir proteínas a membranas de fluoruro de polivinilideno con tamaños de poro de 0,2 μm a una corriente constante de 300 mA durante 3 ha 4 ° C.
    7. Para confirmar la carga y la transferencia iguales, mancha las membranas con una mancha de proteína total 24 . Para cada proteína diana, cargue todas las muestras de cada sujeto en el mismo gel y ejecute todos los geles al mismo tiempo.
    8. Bloquear la membrana durante 1 h a temperatura ambiente en solución salina tamponada con Tris (Tris-base 20 mM, NaCl 192 mM, TBS, pH 7,6) que contiene5% de leche sin grasa.
    9. Incubar las membranas durante la noche con anticuerpos primarios (ver la lista de materiales) diluidos en TBS que contiene 2,5% de leche sin grasa y suplementado con Tween-20 al 0,1% (TBS-TM).
    10. Después de la incubación del anticuerpo primario, lavar las membranas (2 x 1 min más 3 x 5 min) con TBS-TM e incubar con anticuerpos secundarios (ver la Lista de Materiales) conjugados con peroxidasa de rábano picante durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar de nuevo con TBS-TM (2 x 1 min y 3 x 10 min) y de nuevo someterlos a cuatro lavados adicionales de 5 min con TBS.
    11. Aplique 6-12 ml de sustrato quimioluminiscente a la membrana durante 5 min. Coloque la membrana entre dos láminas de plástico transparentes. Coloque las membranas delante de una cámara CCD bloqueando la luz externa. Realice exposiciones en serie utilizando un filtro de cámara quimioluminiscente.
      1. Utilice el programa de software para adquirir 10 exposiciones durante 2 min, o hasta que las señales estén saturadas. Utilice una configuración estándar, tanto para los ajustes del filtro óptico tO adquirir quimioluminiscencia, así como para la configuración de la lente.
    12. Utilice la exposición más alta que no conduzca a la saturación y marque los contornos de la banda. Cuantificar las bandas como la intensidad x mm 2 utilizando el mismo software. Restar el ruido de fondo de la intensidad de la banda. Presentar los resultados relativos a la tinción de proteína total y expresarla como el cambio porcentual en comparación con la línea de base.
  2. Histoquímica
    NOTA: La técnica de histoquímica a continuación se basa en los métodos descritos en una publicación anterior 25 .
    1. Para histoquímica, corte secciones transversales en serie (10 μm) a -20 ° C usando un criostato. Montar las secciones transversales sobre los portaobjetos de vidrio almacenados en una cubeta de vidrio y secar al aire las rebanadas de biopsia a temperatura ambiente.
    2. Preparar soluciones tampón para cada nivel de pH para la preincubación a pH 4,3, 4,6 y 10,3 para la tinción con ATPasa 26 . Para visualizar capilares, staEn las secciones transversales utilizando el método de amilasa-PAS 27 .
    3. Calibrar un medidor de pH vertiendo las soluciones de calibración en recipientes de calibración marcados. Presione el botón apropiado para seleccionar el pH del menú principal.
      1. Enjuague la sonda con agua desionizada y coloque la sonda en el primer vaso de calibración. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en la membrana. Mida la primera solución de calibración y luego presente la siguiente solución de calibración (la pantalla pedirá la siguiente solución).
      2. Enjuague la sonda con agua desionizada y luego colóquela en el segundo vaso de calibración. Asegúrese de que no hay burbujas de aire en la membrana. Mida una segunda solución de calibración y proceda a la siguiente solución de calibración.
      3. Enjuague la sonda con agua desionizada y colóquela en un tercer vaso de calibración. Asegúrese de que no haya burbujas de aire en la membrana. Mida la tercera solución de calibración.
        NOTA: Cuando la calibración esBueno, la pantalla mostrará brevemente, " 3r Buffer OK" y luego volverá al menú principal.
    4. Utilice los tampones de la siguiente manera para la tinción con ATPasa.
      1. Para preparar una solución a pH 10.3, se utilizan dos soluciones diferentes: (A) 4,506 g de glicina, 4,8 g de CaCl2, 3,51 g de NaCl y 600 ml de dH2O y (B) 2,176 g de NaOH y 540 ml De dH $ ₂ $ O. Almacenar las soluciones en una habitación fría o en un refrigerador. Úsalos en el plazo de un mes.
      2. Para preparar soluciones a pH 4,3 y 4,6, se lleva a cabo una "preincubación con ácido". Preparar el ácido para la preincubación utilizando: 6,47 g de acetato de Na, 3,7 g de KCl y 500 ml de dH $ ₂ $ O. A continuación, se prepara una solución al 1% de CaCl $ ₂ $ disolviendo 2,5 g de ésta en 250 ml de dH $ ₂ $ O. % De CoCl $ ₂ $ disolviendo 5 g de ella en 250 ml de dH $ ₂ $ O.
      3. Guarde y utilice estas soluciones como se mencionó anteriormente. Por último, preparar 0,2% de sulfuro de amonioMezclando 800 μl de (NH $ ₄ $) $ ₂ $ S al 20% en 40 ml de dH $ ₂ $ O. Preparar el último de nuevo.
    5. Preparar soluciones a ciertos valores de pH como sigue. Después de la calibración del medidor de pH, retire las cubetas y los cloruros de calcio y cobalto del refrigerador y déjelos calentar a temperatura ambiente antes de teñir.
      1. Para un pH de 10,3 , se añaden alrededor de 25 ml de solución A a un pequeño vaso de vidrio (aproximadamente 70 ml). Mida el pH. Seguir agregando la solución B hasta alcanzar el pH requerido de 10.37. Si la tinción es demasiado oscura, aumente el pH. Si es demasiado brillante, reduzca el pH.
      2. Para un pH de 4.6 , añadir alrededor de 25 ml de "preincubación ácida" a un vaso de precipitados de vidrio pequeño. Mida el pH. Reducir el pH utilizando ácido acético 5 M. Si la imagen de la mancha es demasiado oscura, trate de aclarar con el aumento del pH. Si es demasiado brillante, oscurecer con un pH disminuido. Si la tinción no ayuda, intente otro pH: 4,8 instEad de 4.6.
      3. Para un pH de 4.3 , haga lo mismo que para 4.6, pero agregue más ácido acético. Disminuir el pH si la mancha es demasiado brillante, y aumentar el pH si es demasiado oscuro para las fibras que se especifican.
      4. Prepare la solución de ATP de la siguiente manera. Se pesan 0,017 g de ATP por cubeta (10 ml), por lo que 0,051 g por 3 cubetas o 0,068 g por 4 cubetas. Tomar 30 mL (para 3 cubetas, 10 mL / cuvette) de la solución a pH 10.3 (usar un vaso de escala de cilindro) y ponerlo en un vaso de precipitados con ATP pesado.
        1. Mezclar bien y medir el pH. Reducir el pH utilizando HCl concentrado hasta que el pH alcance exactamente 9,40.
      5. Para la incubación a varios valores de pH, haga lo siguiente. Colocar la solución 10.3 en una cubeta e incubarla en un baño de agua a 37 ° C durante 9 min. Colocar la solución 4.3 en otra cubeta e incubarla a temperatura ambiente durante 5 min. Colocar la solución 4.6 en la última cubeta e incubar a RT durante 1 min.
      6. Siguiendo el pH preferidoProcedimiento de incubación, aplicar el contenido de cada cubeta como sigue. Lavar 15 veces con dH $ ₂ $ O. Agregar la solución de ATP (0,170 g de ATP / 100 ml de H2O) a la muestra de biopsia. Incubar en un baño de agua a 37 ° C durante 30 min. Lavar 15 veces con dH $ ₂ $ O.
      7. Añadir la solución de CaCl 2 (1 g de CaCl 2/100 ml de H 2 O) a la muestra de biopsia en las cubetas. Incubar a TA durante 3 min. Lavar 15 veces con dH $ ₂ $ O. Agregar la solución de CoCl $ ₂ $ (2 g de CoCl $ ₂ $ / 100 ml de H $ ₂ $ O) a la muestra de biopsia en las cubetas. Incubar a TA durante 3 min. Lavar 15 veces con dH $ ₂ $ O.
      8. Colóquela en una solución de (NH 4 ) 2 S durante 30 s y lávese rápidamente 15 veces bajo la campana extractora. Pegue las rodajas de biopsia en el cristal de la diapositiva. Para evitar las burbujas, apriete las biopsias, pero no demasiado duro.
    6. Seleccione una región de la sección transversal sin artefactos o cortes longitudinales de la fibra. Analizar bajo una liGht usando software.
    7. Evaluar el área de la sección transversal (CSA), los capilares y la clasificación del tipo de fibra ( es decir, tipo I, IIA o IIX) a través de un análisis de imágenes por computadora de una media de al menos 150-200 fibras por biopsia. Desde un microscopio, la imagen de las fibras musculares en las secciones transversales asegura que los tres tipos de fibras musculares ( ie, tipo I, IIA y IIX) tengan diferentes tonos de blanco a gris a negro, dependiendo de la tinción del pH ( es decir, 4,34, 4,65 y 10,37).
    8. Comience marcando algunas fibras del tipo-I. A continuación, el programa registrará automáticamente las otras fibras de tipo I. Compruebe que todas las fibras de tipo I estén marcadas correctamente. Para marcar una fibra determinada, haga clic en el botón "Vector". Utilice el cursor para medir el área de cada fibra muscular seleccionada individualmente.
    9. Después del análisis de las fibras de tipo I, continúe el mismo procedimiento para el tipo IIA y el tipo IIX. El promedio ± SEM para cada tipo de fibra muscular ( es decir, tipo I, IIA, y IIX) debe calcularse con respecto a la cantidad de fibra y la CSA para los grupos RET y CON.
      Nota: El área de la sección transversal (CSA), los capilares y la clasificación del tipo de fibra ( ie, tipo I, IIA e IIx) se evaluaron a partir de una media de 163 ± 9 fibras por biopsia.

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Resultados

Material

En el estudio participaron 21 mujeres y hombres relativamente saludables, de 65 a 80 años de edad, con valores de IMC entre 20 y 30 kg · m -2, que fueron asignados al azar a dos grupos. Los individuos de ambos grupos tenían niveles de actividad física relativamente bajos ( es decir, un nivel moderado de actividad física diaria y ningún entrenamiento físico regular). Un grupo (n = 12, 6 mujeres y 6 hom...

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Discusión

En este estudio se han utilizado varias técnicas para investigar los efectos del entrenamiento de resistencia progresiva a corto plazo en la función / morfología muscular de los sujetos mayores, la capacidad aeróbica y la tolerancia a la glucosa. El principal hallazgo fue que, en comparación con un grupo control, se produjeron muchas mejoras en la capacidad aeróbica muscular, tolerancia a la glucosa, fuerza, potencia y calidad muscular ( es decir, proteína implicada en la señalización celular y composición de l...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Andrée Nienkerk, Dennis Peyron y Sebastian Skjöld por supervisar las sesiones de entrenamiento y varias pruebas; A los sujetos participantes; A Tim Crosfield para la revisión del idioma; Y al apoyo económico de la Escuela Sueca de Deporte y Ciencias de la Salud.

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Materiales

mTOR (1:1.000)Señalización celular, Danvers, Massachusetts, EE. UU.
Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Western blot
Pierce 660 nm Kit de ensayo de proteínasThermo Scientific, Rockford, IL, EE. UU. 22662
SuperSignal West Femto Sustrato de máxima sensibilidad Thermo Scientific34096
Cóctel de inhibidores de proteasa Halt (100x)Thermo Scientific78429
Restore PLUS Tampón de decapado Western BlotThermo Scientific46430
Pierce Kit de tinción de proteínas reversible para membranas de PVDFThermo Scientific24585
10 st - 4– 20% Criterion TGX Gel, 18 pocillos, 30 y micro; LBio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE. UU. 567-1094
Membrana de PVDF Immun-Blot Bio-Rad162-0177
Precision Plus Protein Estándares de doble color Bio-Rad161-0374
2x Tampón de muestra LaemmliBio-Rad161-0737
10x Tris/GlycineBio-Rad161-0771
2-MercaptoetanolBio-Rad161-0710
Tween 20Bio-RadP1379-250ML
Análisis de banda con Quantity One versión 4.6.3.softwareBio-Rad
Inhibidor de la fosfatasa al 1% coctailSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EE. UU
2983
Akt (1:1.000)Señalización celular, Danvers9272
Señalización celular, Citrato sintasa de Danvers
(CS) (1:1.000)Gene tex, San Antonio, California, EE.UU.
OXPHOS (1:1.000)Abcam, Cambridge, Reino Unido<
strong>Equipment - Análisis de muestras musculares
Bullet Blender 1.5 para homogeneizarNext Advance, Nueva York, EE.UU.
Lector de placasTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Suiza
Histochemistry
Mayer hematoxylinHistoLab, Vä stra Frö lunda, Suecia  1820
Aceite Red oSigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA00625-25y
NaClSigma-Aldrich793566-2.5 kg
Cloruro de CobaltoSigma-Aldrich60818-50G
AmilasaSigma-AldrichA6255-25MG
ATPSigma-AldrichA2383-5G
GlicinaVWR-chemicals / VWR-international, Spå nga, Suecia101196X
Cloruro de calcioVWR-chemicals / VWR-international22328.262
Iso-pentanoVWR-chemicals / VWR-international24872.298
Etanol 96%VWR-chemicals / VWR-international20905.296
NaOHMERCK, Estocolmo, Suecia1.06498.1000
Acetato de NaMERCK1.06268.1000
KClMERCK1.04936.1000
Sulfuro de amonioMERCKU1507042828
Ácido acético 100%MERCK1.00063.2511
Schiffs&agudo; ReactivoMERCK1.09033.0500
Ácido peryódicoMERCK1.00524.0025
CloroformoMERCK1.02445.1000
pH-metro LANGEHACH LANGE GMBH, Düsseldorf, Alemania
Microscopio ópticoOlympus BH-2, Olympus, Tokio, Japón
Cryostat  Leica CM1950Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania
Software Leica Qwin V3Leica Microsystems
Gel Doc 2000 - Bio-Rad, configuración de la cámaraBio-Rad Laboratories AB, Solna, Suecia 
Programa de software Quantift One - 4.6 (versión 4.6.3; Bio Rad)Bio-Rad Laboratories AB, Solna, Suecia 
Prueba de tolerancia a la glucosa oral, OGTT
Glukos APL 75 gAPL, Estocolmo, Suecia323.188
Analizador automatizado Biosen 5140EKF Diagnostics, Barleben, Alemania
Insulina y péptido C en kit de plasma ELISAMercodia AB, Uppsala Suecia10-1132-01, 10-1134-01
Placa lectorTecan infinite F200 pro, Mä nnedorf, Suiza
Más equipos
Medidas de masa libre de grasaFFM-Tanita T5896, Tanita, Tokio, Japón
Equipo de entrenamiento de fuerza para todos los ejercicios de entrenamientoCybex International Inc., Medway, Massachusetts, EE. UU.  
Cicloergómetro Ergómetro Monark 893E, Monark Exercises, Varberg, Suecia 
Monitor de frecuencia cardíaca RS800, PolarPolar Electro OY, Kampele, Finlandia
Oxycin-Pro - dispositivo ergoespirométrico automáticoErich Jaeger GmbH, Hoechberg, Alemania
Dinamómetro isocinético, Isomed 2000, fuerza muscular de la rodillaD& R Ferstl GmbH, Henau, Alemania
Sistema de adquisición de datos CED 1401 y software SignalCambridge Electronic Design, Cambridge, Reino Unido
Software para el análisis de la fuerza muscular, Spike 2, versión 7Signal Hound, LA Center, WA, EE. UU.
Software Statistica para análisis estadísticosStatistica, Stat soft. inc, Tulsa, Oklahoma, EE. UU.
Equipo de biopsia muscular
Weil Blakesley conchotomeWisex, Mö lndal, Suecia
Anestesia local Carbocaína, 20 mL, 20 mg/mL; Astra Zeneca, Sö dertä lje, Suecia169,367
Maquinilla deafeitar de seguridad de plumas de hoja quirúrgica CO, LTD, Osaka, Japón  
Secundario anti-conejo y anti-ratón ligado a HRP (1:10.000)11048030

Referencias

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