Selectivamente la etiqueta fluorescente GnRH-I, II y III Los derivados son instrumentos fiables para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular. Este manuscrito introduce experimentos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de estos conjugados de GnRH en diversas líneas celulares.
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Artículo de método
En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia
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Resumen
Resumen
análogos de GnRH son eficaces restos de dirección y capaz de administrar agentes anticancerígenos selectivamente en células tumorales malignas que los receptores de GnRH altamente exprés. Sin embargo, el análisis cuantitativo de la captación celular de GnRH análogos 'y los tipos de células investigadas en los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH se limitan actualmente. Previamente introducida, marcado fluorescente selectivamente GnRH I, II y III derivados proporcionar gran capacidad de detección, y tienen propiedades químicas adecuadas para experimentos reproducibles y robustos. También se encontró que los métodos apropiados en marcha hasta la fecha con estos análogos de GnRH etiquetados podrían ofrecer nueva información sobre los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH. Este manuscrito presenta algunos experimentos simples y rápidas con respecto a la captación celular de [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III en la EBC-1 (pulmón), el BxPC-3 (páncreas) y en el Detroit-562- (faringe) t malignoumor células. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, el nivel de la superficie celular de los receptores de GnRH-I también fue examinado en estas líneas celulares antes y después del tratamiento con GnRH por microscopía confocal de barrido láser. La absorción celular de conjugados de GnRH-FITC se cuantificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. En estos experimentos se observó diferencias menores entre los análogos de la GnRH y las principales diferencias entre los tipos de células. Las diferencias significativas entre las líneas celulares se correlacionan con su nivel distinto de los receptores de la superficie celular GnRH-I. Los experimentos introducidas contienen métodos prácticos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de los conjugados GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración en diferentes cultivos de células adherentes. Estos resultados podrían predecir la eficacia de dirección de fármaco de conjugados de GnRH en el cultivo celular dado, y ofrecer una buena base para futuros experimentos en el examen de los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH.
Introducción
Sistemas de administración dirigida de fármacos a base de péptidos se han convertido en un desarrollo rápido y área prometedora en la terapia del cáncer en los últimos años 1, 2. Gonadotropina humana tipo liberación de receptor de la hormona I (GnRH-IR) se encuentra principalmente en la glándula pituitaria, pero también está presente en varios otros tejidos que son responsables de autorreproducción 3. GnRH-IR también se expresa en una serie de tejidos de cáncer, relacionados o no con el sistema reproductivo 4, 5. La eleva....
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Protocolo
1. Preparación de Cultivos Celulares y Reactivos
- Mantener los cultivos de células en medio recomendado por el fabricante, suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal y antibióticos (denominado medio completo). Mantener el matraz de cultivo celular en un, 5% de CO 2 atmósfera incubador humidificado a 37 ° C. Siga la proliferación y la confluencia de las células por microscopio invertido (con objetivo de 10x de contraste de fase).
- Cuando las células alcanzan la confluencia adecuada, se elimina el medio, y se lava el cultivo con 2-3 ml, estéril tamponada con fosfato salino (PBS). Retire el PBS y añadir 0,5 ml, solución de tripsina-....
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Resultados
Las imágenes obtenidas por microscopía de barrido láser confocal (CLSM) ofrecen información acerca de la espectacular captación de los conjugados de GnRH-FITC en el cultivo de células en un determinado tiempo y forma dependiente de la concentración. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, la presencia de la GnRH-IR en la superficie celular también es verificable por el experimento CLSM. Además, mediante el uso de una sonda fluorescente rojo lejano tinción de ADN, es posible contrateñ.......
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Discusión
Los experimentos descritos en este documento utilizar análogos de la GnRH marcadas selectivamente para adherente cribado cultivos de células in vitro. La microscopía confocal y citometría de flujo métodos son adecuados para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular de estos conjugados de GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración. Estos experimentos tienen los siguientes pasos críticos: 1) mantener un cultivo celular estéril, sana; 2) péptidos GnRH deben ser de a.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El proyecto fue apoyado por el Fondo Nacional de Investigación OTKA (K 104045).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Banco de células EBC-1 | JCRB | JCRB0820 | Carcinoma de células escamosas de pulmón |
| humano BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Adenocarcinoma de páncreas humano |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Carcinoma faríngeo humano |
| RPMI-1640 Medio con L-glutamina | Lonza BE12-702F | Medio de cultivo para células BxPC-3 | |
| Mínimo de Eagle Esencial Medio | Lonza | BE12-611F Medio de | cultivo para células EBC-1, y complementado con piruvato de sodio al 0,1% para células Detroit-562 |
| Suero fetal bovino | Euro | Clon ECS0180L | Complementa el medio de cultivo |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complementa el medio de cultivo (antibióticos) |
| Matraces de cultivo celular de línea estándar | VWR | 10062-872 | Proporciona un entorno de crecimiento consistente y estéril para las células |
| Mezcla de tripsina-EDTA | Lonza | BE17-161E | Retire las células adjuntas |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvente |
| Dimetilsulfóxido | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvente |
| tripano, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Utilizado para contar células |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | hecho por nosotros | - | Pureza ≥ 98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | fabricado por | nosotros-Pureza ≥ 98% (HPLC) | |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | fabricado por | nosotros-Pureza ≥ 98% (HPLC) | |
| fondo de vidrio Portaobjetos microscópico de 8 pocillos | Ibidi | 80826 | Uso en el experimento CLSM |
| Placa de cultivo celular Corning Costar, 12 pocillos | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Uso en el experimento FACS |
| Solución de fijación (10% formalina tamponada neutra) | Bio-Optica | 01V60P | Fijar células adherentes |
| Albúmina sérica bovina Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevenir la unión inespecífica de los anticuerpos | |
| Anticuerpo GnRHR | Proteintech | 19950-1-AP | Reactivo de inmunocitoquímica, se une a los receptores humanos de GnRH tipo I |
| Anticuerpo secundario, Alexa Conjugado con flúor 546 | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Reactivo de inmunocitoquímica, se une al anticuerpo primario |
| Solución de sonda fluorescente (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Núcleos de contratinción |
| Medio de montaje acuoso Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Uso en el experimento CLSM, preservando la fluorescencia |
| Microscopio invertido | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Compruebe el fenotipo y la confluencia de los cultivos celulares |
| Microscopio de barrido láser confocal invertido | Zeiss | LSM-710 | Uso en el experimento CLSM |
| Citómetro de flujo | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Uso en el experimento FACS |
Referencias
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
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Reimpresiones y permisos
