Artículo de método

En Vitro Imágenes y cuantificación de la eficiencia de la focalización de Drogas de los análogos de GnRH marcado con fluorescencia

DOI:

10.3791/55529

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21 de marzo de 2017

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1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

En este artículo

Resumen

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Selectivamente la etiqueta fluorescente GnRH-I, II y III Los derivados son instrumentos fiables para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular. Este manuscrito introduce experimentos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de estos conjugados de GnRH en diversas líneas celulares.

Resumen

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análogos de GnRH son eficaces restos de dirección y capaz de administrar agentes anticancerígenos selectivamente en células tumorales malignas que los receptores de GnRH altamente exprés. Sin embargo, el análisis cuantitativo de la captación celular de GnRH análogos 'y los tipos de células investigadas en los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH se limitan actualmente. Previamente introducida, marcado fluorescente selectivamente GnRH I, II y III derivados proporcionar gran capacidad de detección, y tienen propiedades químicas adecuadas para experimentos reproducibles y robustos. También se encontró que los métodos apropiados en marcha hasta la fecha con estos análogos de GnRH etiquetados podrían ofrecer nueva información sobre los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH. Este manuscrito presenta algunos experimentos simples y rápidas con respecto a la captación celular de [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III en la EBC-1 (pulmón), el BxPC-3 (páncreas) y en el Detroit-562- (faringe) t malignoumor células. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, el nivel de la superficie celular de los receptores de GnRH-I también fue examinado en estas líneas celulares antes y después del tratamiento con GnRH por microscopía confocal de barrido láser. La absorción celular de conjugados de GnRH-FITC se cuantificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. En estos experimentos se observó diferencias menores entre los análogos de la GnRH y las principales diferencias entre los tipos de células. Las diferencias significativas entre las líneas celulares se correlacionan con su nivel distinto de los receptores de la superficie celular GnRH-I. Los experimentos introducidas contienen métodos prácticos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de los conjugados GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración en diferentes cultivos de células adherentes. Estos resultados podrían predecir la eficacia de dirección de fármaco de conjugados de GnRH en el cultivo celular dado, y ofrecer una buena base para futuros experimentos en el examen de los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH.

Introducción

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Sistemas de administración dirigida de fármacos a base de péptidos se han convertido en un desarrollo rápido y área prometedora en la terapia del cáncer en los últimos años 1, 2. Gonadotropina humana tipo liberación de receptor de la hormona I (GnRH-IR) se encuentra principalmente en la glándula pituitaria, pero también está presente en varios otros tejidos que son responsables de autorreproducción 3. GnRH-IR también se expresa en una serie de tejidos de cáncer, relacionados o no con el sistema reproductivo 4, 5. La elevada expresión de GnRH-IR en varias células tumorales malignas en comparación con los tejidos sanos proporciona una oportunidad para que la terapia dirigida 5, 6.

Muchos hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) se han desarrollado en las últimas décadas, que podrían ser utilizados como restos de direccionamientof "> 7, 8, 9. Estos péptidos son capaces de administrar agentes anticáncer con alta selectividad en células tumorales malignas que sobre-expresa GnRH-IR 6. Varios fármacos anti-tumorales conjugados de GnRH con una mayor selectividad y una mejor eficiencia de la no conjugada correspondiente fármaco libre se ha informado de 7, 8, 9.

Publicaciones anteriores sobre los péptidos de GnRH y sus receptores informaron que la GnRH-IR puede asumir diversas conformaciones que tienen una selectividad diferente para la GnRH análogos 10. La GnRH-IR altamente variable ha vías de señalización complejos y diversos están dotados de actividad diferente en contra de sus ligandos naturales y artificiales 11. Estos hechos hacen investigación de sistemas basados ​​en GnRH desafiante. Por otra parte, la y poseen potencial terapéutico prometedor. Varios experimentos con péptidos GnRH radiomarcados se informó anteriormente 12, 13, 14, 15, pero los experimentos en los que se utilizaron los análogos de GnRH marcados con fluorescencia son todavía limitada. Si bien el etiquetado radiactivo ofrece alta sensibilidad, etiquetado fluorescente tiene varias otras ventajas, por ejemplo, el manejo más fácil, y la capacidad de contratinción con diferentes fluoróforos. Tres análogos de GnRH comunes que con éxito han sido utilizados para la administración de fármacos son el [D-Lys 6] GnRH-I, [D-Lys 6] GnRH-II y III-GnRH, pero la eficacia de estos péptidos como restos de direccionamiento es raramente en comparación 16, 17. Por otra parte, los resultados de experimentos separados en los que se utilizaron diferentes células cancerosas y análogos de la GnRH es diversa.

ntent "> Sobre la base de estas consideraciones, se centró en el tumor de orientación y el potencial de suministro de medicamento de estos péptidos de GnRH y de este modo sintetizado y caracterizado la [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] - conjugados de péptido GnRH-III 18 Estos análogos están etiquetados selectivamente con FITC en la cadena lateral de su (relación de péptido-FITC Lys o D-Lys 1: 1 en cada uno. conjugado). la idea era que el etiquetado fluorescente selectiva puede ofrecer información novedosa de estos péptidos, y permite su buen seguimiento y cuantificación fiable. estos conjugados tienen una manipulación segura y detectabilidad fiable, que hacen que sea más fácil de comparar la eficiencia de la orientación del tumor, y la la detección de numerosos tipos de células tumorales malignas. esperamos que se ponga a experimentos hechos con estos conjugados peptídicos podría contribuir al desarrollo de cáncer de novela de orientación conjugados GnRH con las drogas, y ayudará a identificar nuevas alquitrán terapéuticaconsigue así.

El presente manuscrito demuestra algunos experimentos reproducibles y rápidos con conjugados GnRH-FITC. La expresión de la superficie celular de GnRH-R es una condición determinante en cuanto a la absorción de GnRH, por lo que simultáneamente investigó el nivel de la superficie celular de GnRH-IR en las líneas celulares ensayadas. Estamos visualizar los conjugados de GnRH y GnRH-IR-FITC por microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y se cuantificó la captación celular de conjugados de GnRH-FITC usando células activadas por fluorescencia (FACS).

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Protocolo

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1. Preparación de Cultivos Celulares y Reactivos

  1. Mantener los cultivos de células en medio recomendado por el fabricante, suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal y antibióticos (denominado medio completo). Mantener el matraz de cultivo celular en un, 5% de CO 2 atmósfera incubador humidificado a 37 ° C. Siga la proliferación y la confluencia de las células por microscopio invertido (con objetivo de 10x de contraste de fase).
  2. Cuando las células alcanzan la confluencia adecuada, se elimina el medio, y se lava el cultivo con 2-3 ml, estéril tamponada con fosfato salino (PBS). Retire el PBS y añadir 0,5 ml, solución de tripsina-EDTA estéril 0,25% al ​​cultivo celular y se incuba a 37 ° C hasta que las células se separan (aproximadamente 10 min).
  3. Suspender las células en 3 a 4 ml de medio completo estéril para detener la tripsina y transferirlos a un tubo de centrífuga estéril. Centrifugar las células a 150 xg durante 4 minutos a temperatura ambiente (RT). Descartar el sobrenadante con cuidado y suspender la pEllet en 2-3 ml de medio completo estéril.
  4. Sacar 100 l de la suspensión celular y se mezcla con 100 l 0,4% (m / V) de tripano solución de azul, para teñir las células muertas. Cargar 10 l de esta mezcla en un hemocitómetro y determinar el número de células viables por microscopio invertido.
  5. Diluir la cantidad requerida de suspensión de células preparada en el paso 1.3 a 10 ml con medio completo estéril, que contiene 4 x 10 4 células / mL.
  6. Añadir 250 l de suspensión celular (preparado en el paso 1.5) por pozo (10 4 células / pocillo) en siete pozos del primer fondo de cristal de 8 pocillos portaobjetos de microscopio. Utilice esta diapositiva en el método de captación de GnRH.
  7. Añadir 250 l de suspensión celular (preparado en el paso 1.5) por pozo (10 4 células / pocillo) en cinco pozos de la segunda diapositiva de 8 pocillos microscópica. Esta diapositiva se utiliza en el método de expresión de GnRH-IR.
  8. Añadir 1 ml de suspensión de células (preparado en el paso 1.5) por pocillo (4 x 10 4 células / pocillo) en siete wells de una placa de 12 pocillos. Esta placa se utiliza en el método de cuantificación de la GnRH.
  9. Deje que las células se adhieren en los dos portaobjetos de microscopio y la placa. Incubar en un, 5% de CO 2 atmósfera incubador humidificado a 37 ° C durante 48 h.
  10. Después de la incubación comprobar las células por microscopio invertido (con objetivo de 10x de contraste de fase). Si las células son sanas y unido, continúe con los siguientes pasos.
  11. Preparar mM GnRH-FITC solución al 10 acciones en dimetilsulfóxido (DMSO) de cada uno de los tres conjugados 18. (Use estas concentraciones de dilución: 16,43 mg / l [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 g / l [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II y 16.47 g / l [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Mantener estas soluciones madre en un lugar oscuro a temperatura ambiente y el uso de ellos hasta dentro de unas semanas.
  12. Diluir 1,7 l cada una de las tres soluciones madre 10 mM GnRH-FITC en 1,7 ml de medio completo. Agitar estas soluciones. (Tse son el 10 M GnRH-FITC tratamiento de medios de comunicación.) Diluir 150 ml de cada uno de los tres 10 M GnRH-FITC medio de tratamiento en 1,35 ml de medio completo. Agitar estas soluciones también (estos son los 1 M GnRH-FITC medio de tratamiento).
    NOTA: Todos los GnRH-FITC que contiene medio de tratamiento debe ser protegido de la luz y se utiliza dentro de pocas horas.
  13. Precalentar el seis GnRH-FITC medio de tratamiento (preparado en la etapa 1.12) y 4 ml de medio completo a 37 ° C.
  14. Diluir 3 l de solución de sonda fluorescente 5 mM (contratinción nuclear mencionado en la Lista de Materiales) en 3 ml de PBS a 5 micras. Esta solución debe protegerse de la luz, deberá mantenerse a temperatura ambiente y se utilizan dentro de unas cuantas horas.

2. Microscopía confocal de barrido láser (CLSM)

  1. Método de captación de GnRH
    1. Tome la primera lámina de microscopio, preparado en la etapa 1.6 y una pipeta el medio completo de cada uno de los siete bien. Añadir 250 l de medi completa precalentadoum en el primer pocillo. Use esto como un control negativo. Añadir 250 l de la precalentado GnRH-FITC tratamiento de medios de comunicación (de 1,13) a cada uno de los siguientes seis pozos (3 pocillos con 1 M y 3 con 10 mM). Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 5 h.
    2. Pipetear hacia fuera el medio de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de solución de fijación (10% de formalina tamponada neutral) en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
    3. Pipetear la solución de fijación de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contiene 5 mM solución de sonda fluorescente preparado en la etapa 1.14 en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
    4. Pipetear la solución de la sonda fluorescente de cada pocillo, y se lavan las células dos veces con 250 l de PBS con cuidado. Añadir 3-4 gotas de medio de montaje en cada pocillo, por fin. Mantenga la diapositiva en la oscuridad a temperatura ambiente, hasta que la proyección de imagen.
  2. Método de expresión de GnRH-IR
    1. Tome la segunda lámina de microscopio de 8 pocillos preparada en el paso 1.7 y pipetear el medio completo de cada uno de los cinco pozos.
    2. Añadir 250 l de medio completo precalentado en el primer pocillo, utilice este control negativo. Añadir 250 l de medio completo precalentado en el segundo pozo también, y usar esto para examinar la expresión de GnRH-IR antes del tratamiento con GnRH.
    3. Añadir 250 ml de cada uno de los tres precalentado 10 micras GnRH-FITC medios de tratamiento en los próximos tres pozos. Utilice estos pozos para tratar previamente las células con conjugados GnRH-FITC antes de examinar la expresión de GnRH-IR. Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 1 h.
    4. Pipetear el medio de tratamiento de cada uno de los tres pocillos que se utilizan para examinar la expresión de GnRH-IR después del tratamiento GnRH y lavar los pozos con 250 l de medio completo precalentado. Añadir 250l de medio completo precalentado en cada uno de los tres pozos. Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 1 h.
    5. Pipetear hacia fuera el medio de cada uno de los cinco pocillos y lavar las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de solución de fijación en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
    6. Pipetear la solución de fijación de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contenía albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución de bloqueo cada pocillo e incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h.
    7. Diluir 10 l de anticuerpo primario GnRH-IR en 1 ml de PBS (relación 1: 100). Mantenerlo a temperatura ambiente y utilizarlo hasta dentro de unas horas.
    8. Pipetear la solución de bloqueo BSA de cada pocillo, excepto el control negativo (primer pozo). Se lavan las células con 250 l de PBS (excepto el pocillo de control negativo). Añadir 250 l de PBS que contenía GnRH-IR anticuerpo primario preparado en la etapa 2.2.7 en EACh bien (excepto el control negativo). Incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h, en un lugar oscuro.
    9. Diluir 2,5 l de Alexa 546 anticuerpo secundario marcado en 1,25 ml de PBS (relación 1: 500).
      NOTA: Esta solución debe protegerse de la luz, mantenerlo a temperatura ambiente y utilizarlo hasta dentro de unas horas.
    10. Pipetear soluciones de cada uno de los cinco pozos y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contienen 546 AF anticuerpo secundario marcado preparado en la etapa 2.2.9 en cada pocillo. Incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h en la oscuridad.
    11. Pipetear la solución de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contiene 5 mM solución de sonda fluorescente preparado en la etapa 1.14 en cada pocillo y se incuba el portaobjetos durante 10 min, a temperatura ambiente.
    12. Pipetear la solución de la sonda fluorescente de cada pocillo y se lavan las células dos veces con 250 l de PBS con cuidado. Añadir 3-4 gotas de medio de montaje en cada pocillo, después. Mantenga la diapositiva en la oscuridada TA hasta que la formación de imágenes microscópicas.
  3. Imaging
    1. Imagen de las células por confocal invertido microscopio de escaneo láser (usando 63X objetivo de inmersión en aceite)
      1. Utilice las siguientes longitudes de onda de excitación / emisión. conjugados GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticuerpo marcado: 488/546 nm (uso sólo para el método de expresión de GnRH-IR), sonda fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
      2. Configurar los parámetros de imagen utilizando las células de control negativo. Use estos parámetros para las células tratadas imagen (Figura 3). Volver a ajustar los parámetros de imagen en cada portaobjetos microscópico en el comienzo del análisis. imágenes afinar y exportación con el software proporcionado por el fabricante si es necesario.

3. celular activada por fluorescencia (FACS)

  1. Método de cuantificación GnRH
    1. Tomar el plato preparado en la etapa 1.8 y pipetear el medio completo de EAch de los siete pozos. Añadir 1 ml de medio completo precalentado en el primer pocillo. Use esto como un control negativo. Añadir 1 ml de cada uno de los seis precalentado el tratamiento de los medios de comunicación (3 pozos con 1 M y 3 pozos con 10 mM) en los próximos seis pozos. Se incuba la placa en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 5 h.
    2. Pipetear a cabo el medio de cada pocillo. Lavar las células dos veces con 2 ml de PBS con cuidado. Añadir 500 l de solución de tripsina-EDTA en cada uno de los pozos. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (aproximadamente 10 min).
    3. Añadir 1 ml de medio completo en cada pocillo para detener la tripsina. Agitar la placa. Suspender las células suavemente con una pipeta, y la transferencia de la suspensión de cada pocillo a tubos de FACS. Centrifugar los tubos a 150 xg durante 4 minutos, a 4 ° C.
    4. Derrama los sobrenadantes con cuidado, con un solo movimiento. Añadir 500 l de PBS helado en cada tubo de FACS y suavemente volver a suspender las células. Mantener los tubos en hielo hasta el finaldel experimento.
  2. Análisis y cálculo
    1. Analizar las células por citometría de flujo. Para la excitación, el uso de longitudes de onda láser de argón de 488 nm y para la detección de usar 530 nm longitud de onda. Configurar el citómetro de flujo parámetros mediante la ejecución de las células de control negativo. Use estos parámetros para analizar las células tratadas (Figura 4A). Evaluar los datos con el software del fabricante, determinar los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI), y calcular los valores relativos de las IFM.

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Resultados

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Las imágenes obtenidas por microscopía de barrido láser confocal (CLSM) ofrecen información acerca de la espectacular captación de los conjugados de GnRH-FITC en el cultivo de células en un determinado tiempo y forma dependiente de la concentración. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, la presencia de la GnRH-IR en la superficie celular también es verificable por el experimento CLSM. Además, mediante el uso de una sonda fluorescente rojo lejano tinción de ADN, es posible contrateñ...

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Discusión

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Los experimentos descritos en este documento utilizar análogos de la GnRH marcadas selectivamente para adherente cribado cultivos de células in vitro. La microscopía confocal y citometría de flujo métodos son adecuados para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular de estos conjugados de GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración. Estos experimentos tienen los siguientes pasos críticos: 1) mantener un cultivo celular estéril, sana; 2) péptidos GnRH deben ser de a...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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El proyecto fue apoyado por el Fondo Nacional de Investigación OTKA (K 104045).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Banco de células EBC-1JCRBJCRB0820Carcinoma de células escamosas de pulmón
humano BxPC-3ATCCCRL-1687Adenocarcinoma de páncreas humano
Detroit-562ATCCCCL-138Carcinoma faríngeo humano
RPMI-1640 Medio con L-glutaminaLonza BE12-702FMedio de cultivo para células BxPC-3
Mínimo de Eagle Esencial MedioLonzaBE12-611F Medio decultivo para células EBC-1, y complementado con piruvato de sodio al 0,1% para células Detroit-562
Suero fetal bovinoEuroClon ECS0180LComplementa el medio de cultivo
MycoZap Plus-CL LonzaVZA-2012Complementa el medio de cultivo (antibióticos)
Matraces de cultivo celular de línea estándarVWR10062-872Proporciona un entorno de crecimiento consistente y estéril para las células
Mezcla de tripsina-EDTA LonzaBE17-161ERetire las células adjuntas
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)LonzaBE17-516FSolvente
DimetilsulfóxidoSigma-AldrichD8418-100MLSolvente
tripano, 0.4%Thermo Fisher Scientific15250061Utilizado para contar células
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-Ihecho por nosotros- Pureza ≥ 98% (HPLC)
[D-Lys6(FITC)]-GnRH-IIfabricado pornosotros-Pureza ≥ 98% (HPLC)
[Lys8(FITC)]-GnRH-IIIfabricado pornosotros-Pureza ≥ 98% (HPLC)
fondo de vidrio Portaobjetos microscópico de 8 pocillosIbidi80826Uso en el experimento CLSM
Placa de cultivo celular Corning Costar, 12 pocillosSigma-AldrichCLS3513-50EAUso en el experimento FACS
Solución de fijación (10% formalina tamponada neutra)Bio-Optica01V60PFijar células adherentes
Albúmina sérica bovina Sigma-AldrichA7906-10GPrevenir la unión inespecífica de los anticuerpos
Anticuerpo GnRHRProteintech19950-1-APReactivo de inmunocitoquímica, se une a los receptores humanos de GnRH tipo I
Anticuerpo secundario, Alexa Conjugado con flúor 546Thermo Fisher ScientificA11035Reactivo de inmunocitoquímica, se une al anticuerpo primario
Solución de sonda fluorescente (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254Núcleos de contratinción
Medio de montaje acuoso FluoromountSigma-AldrichF4680-25MLUso en el experimento CLSM, preservando la fluorescencia
Microscopio invertidoElektro-Optika Ltd. Alpha XDS-2TCompruebe el fenotipo y la confluencia de los cultivos celulares
Microscopio de barrido láser confocal invertidoZeissLSM-710Uso en el experimento CLSM
Citómetro de flujoBD BiosciencesBD FACSCaliburUso en el experimento FACS
Solución azul de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

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GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

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