Method Article

Técnicas para inducir la senescencia celular y cuantificar

DOI:

10.3791/55533

⸱

May 1st, 2017

 , 
1Laboratory of Epidemiology and Population Science, National Institute on Aging, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La senescencia celular, el estado irreversible de la detención del ciclo celular, puede ser inducida por diferentes tipos de estrés celular. A continuación, describimos protocolos para inducir senescencia y métodos celular para evaluar marcadores de senescencia.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En respuesta a estrés celular o daño, las células proliferantes pueden inducir un programa específico que inicia un estado de detención del ciclo celular a largo plazo, denominado senescencia celular. La acumulación de células senescentes se produce con el envejecimiento del organismo y por medio de cultivo continuo in vitro. Las células senescentes influyen en muchos procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la reparación de tejidos y la regeneración, la supresión de tumores, y el envejecimiento. Características de las células senescentes incluyen, pero no se limitan a, aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal); INK4a p16, p53, y p21 niveles; mayores niveles de daño del ADN, incluyendo γ-H2AX; la formación de asociada a senescencia heterocromatina Foci (SAHF); y la adquisición de un fenotipo secretor asociada a la senescencia (SASP), un fenómeno que se caracteriza por la secreción de una serie de citoquinas pro-inflamatorias y moléculas de señalización. A continuación, describimos los protocolos para ambos replicativa ysenescencia daño en el DNA inducida en células cultivadas. Además, destacamos técnicas para controlar el fenotipo senescente utilizando varios marcadores asociados con la senescencia, incluyendo SA-β-gal, γ-H2AX y tinción SAHF, y para cuantificar los niveles de proteína y ARNm de reguladores del ciclo celular y factores de SASP. Estos métodos se pueden aplicar a la evaluación de la senescencia en varios modelos y tejidos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hace más de medio siglo, Hayflick y sus colegas describen cómo las células no transformadas proliferen en cultivo, pero sólo durante un periodo finito de tiempo 1. el cultivo a largo plazo de fibroblastos humanos hizo que las células para detener la proliferación; sin embargo, eran metabólicamente activa, y esto fue llamado senescencia celular. La senescencia puede ser beneficioso para la inhibición de la tumorigénesis, pero también puede ser perjudicial, ya que se cree que contribuyen a la pérdida de capacidad de regeneración que se produce con el envejecimiento 2, 3. Las células senescentes se han demostrado que se acumulan en los tejidos como humanos 4 edad y han sido implicados en una serie de procesos biológicos, incluyendo el desarrollo embrionario, la cicatrización de heridas, reparación de tejidos, y la inflamación 2 relacionada con la edad.

passaging continua de las células en cultivo induce senescencia replicativa, que se ha relacionadoa telómero desgaste y la inestabilidad genómica. Diversas tensiones de células, incluyendo daño en el ADN y oncogenes, también pueden causar la senescencia 3. La senescencia causado por factores distintos de desgaste de los telómeros se llama a menudo inducida por el estrés o la senescencia prematura y generalmente depende de la INK4A p16 / Rb ruta de la 5. Aunque la proliferación, las células no transformadas aparecen típicamente husillo en forma, las células senescentes pueden ser identificados como que tiene ciertas características, incluyendo una, gran morfología plana y aumento de la actividad β-galactosidasa asociada a la senescencia (SA-β-gal) (Figuras 1 y 2). Las células senescentes también se acumulan marcadores de daño de ADN, incluyendo γ-H2AX (Figura 3) 6, y, potencialmente, asociada a la senescencia heterocromatina focos (SAHF) (Figura 4) 7. Las células senescentes tienen mayores niveles de los reguladores del ciclo celular, incluyendo p 16 (INK4A p16) y / o p21 y p53 (Figura 5) 8, 9. Además, datos recientes han demostrado que las células senescentes pueden tener efectos no autónomos mediante la secreción de una serie de citocinas y quimiocinas pro-inflamatoria llamada la asociada a la senescencia secretora fenotipo (SASP) 10. Aunque este fenómeno SASP puede variar de tipo celular a tipo celular, en general, se demuestra por un aumento de la interleucina-6 (IL-6), IL-8, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), crecimiento- α regulado oncogén (GRO-α), y GRO-β, entre otros (Figura 6). El estrés o daño particular que induce la senescencia también pueden influir en el fenotipo secretor 11, 12, 13. SASP puede ser detectado mediante la medición de los niveles de proteínas secretadas utilizando ELISAs o matrices citoquina / proteínas = "xref"> 10, 14. Aunque los mecanismos post-transcripcionales pueden regular los niveles de proteína SASP 11, 15, 16, 17, los cambios en los niveles de mRNA también pueden detectarse en muchos casos. Estos cambios son generalmente más sensibles y más fácil de cuantificar que las mediciones de nivel de proteínas. Otros marcadores senescentes también pueden ser evaluados, incluyendo persistente daño en el ADN focos nucleares, denominados segmentos de ADN con alteraciones de la cromatina de refuerzo senescencia (DNA-cicatrices) 18, y diversos otros marcadores 3, 19, 20.

A continuación, describimos técnicas comunes para la inducción de la senescencia en células en cultivo y también para la medición de varios marcadores de senescencia, incluyendo SA-β-Gal, γ-H2AX, SAHF, y la proteína y ARNm de senescenciamoléculas NCE-asociado.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Inducción de la senescencia replicativa

  1. Fibroblastos diploides humanos bajo paso Descongelar (por ejemplo, WI-38 y IMR-90) u otras líneas celulares.
    NOTA: Aquí, se utilizaron fibroblastos diploides humanos, pero estos protocolos se puede utilizar para evaluar la senescencia en otros tipos de células, tales como endotelial, epitelial, o células madre mesenquimales. condiciones de cultivo pueden ser optimizadas para los diferentes tipos de células utilizados debido a las diferentes tasas de crecimiento o condiciones de crecimiento.
    NOTA: Las células deben estar proliferando y tienen una morfología de husillo (véase la Figura 1 para un esquema y la Figura 2 para los ejemplos). Idealmente, las células deben tener un nivel de duplicación de la población (PDL) de <30 en el inicio de los experimentos para evitar que posibles células senescentes replicativa.
    1. Calcular la PDL de las células utilizando la siguiente ecuación PDL = log (N f / N 0) / log2, donde N f es el número de células final y N 0 es el número inicial de células sembradas 21.
  2. Cultura WI-38 células en de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS), 1% de aminoácidos no esenciales, y 1% de penicilina / estreptomicina.
  3. Crecer IMR-90 células en DMEM suplementado con 10% de FBS y 1% de penicilina / estreptomicina.
  4. Crecer todas las células a 37 ° C y 5% CO 2. continuamente crecer las células y dividir cada de 2 - 4 d cuando las células alcanzan ~ 70 - 80% de confluencia. Monitorear la confluencia celular usando un microscopio de luz. Evitar las células con una mayor confluencia, ya que esto puede afectar el crecimiento celular debido al contacto inhibición.
  5. Monitor de las células bajo un microscopio de luz para el aspecto morfológico de las células senescentes (ver las figuras 1 y 2) y para cuando no hay cambio en la PDL de un subcultivo a la siguiente.

2. ADN senescencia inducida por daños

  1. Células de la placa (por ejemplo, WI-38, IMR-90, u otro tipo de célula) a una densidad escasa (es decir, ~ 300.000 células / placa de 6 cm) en un plato apropiado para el tipo de análisis (es decir, un plato de 6 cm para la proteína / marcadores de ARN o un plato de 6 pocillos para la tinción SA-β-gal). Utilizar células de paso de principios que son jóvenes y proliferación (<30 PDL) y la placa de ellos de modo que las células son aproximadamente 50 - 60% de confluencia en el día siguiente.
  2. Retirar el medio de crecimiento utilizando una pipeta de vidrio conectado a un vacío y se lavan las células mediante la adición de solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS). Repita este paso para un total de dos lavados. Añadir una capa delgada de PBS (~ 750 l para un plato de 6 cm) tanto para una condición de "mock" tratado y para una radiación ionizante (IR) tratada.
  3. Use un irradiador gamma para exponer las células a una dosis única de 10 Gray (Gy) de IR; se trata de una exposición típica para la mayoría de las líneas celulares. En una campana, eliminar el PBS y reemplazarlo con medio de crecimiento. Alternativamente, el tratamiento de las células con bleomycin a 20 mg / ml durante 2 h.
  4. Cambiar el medio sobre las células cada 48 -7 2 ​​h y dividir las células si es necesario.
  5. Supervisar las células bajo un microscopio de luz para los cambios morfológicos (véase la Figura 1 para un esquema y la Figura 2 para las imágenes de células representativas) y ensayo para marcadores senescentes 7 - 10 de d después del tratamiento con IR.
    NOTA: Este protocolo describe la senescencia inducida por IR. La senescencia también puede ser inducida por otros factores de estrés, incluyendo bleomicina (ver más arriba para las condiciones), H 2 O 2 22, 23, fármacos quimioterapéuticos 24, el humo del cigarrillo 25, factor de crecimiento transformante (TGF) -β1 26, 27, y otros métodos 21 , 28, 29.

3. La tinción Cells para asociada a senescencia β-galactosidasa

  1. Antes de la tinción, examinar las células bajo un microscopio de luz para monitorear los cambios morfológicos.
    NOTA: senescente células típicamente se agrandan y plana, a diferencia de las células en proliferación, que tienen una morfología de husillo (Véase la Figura 1 para un esquema y la Figura 2 para resultados representativos). Las células proliferantes se pueden utilizar como un control negativo, y las células tratadas con IR u otro agente que daña el ADN (véase la sección 2) se pueden utilizar como controles positivos.
  2. Cuantificar la actividad de SA-β-gal utilizando reactivos de un kit comercial (véase la Tabla de Materiales). Descongelar todos los reactivos y llevarlos a temperatura ambiente por el calentamiento de ellos de hasta 37 ° C.
    1. Calcular la cantidad de solución de tinción y solución de fijación necesario.
      NOTA: Típicamente, un ml de volumen 1 es suficiente para un pocillo de una placa de 6 pocillos. Diferentes tamaños de placas se pueden utilizar, pero un tamaño placa de 6 pocillos es well-adecuado para llevar a cabo un ensayo por triplicado para cada condición. Esta densidad por lo general proporciona un número suficiente de células por campo que contar sin utilizar un exceso de número de células.
    2. Se diluye la solución de tinción 01:10 con agua destilada.
    3. Se diluye la solución de fijación 1:10 con agua destilada.
    4. Preparar una solución 20x social de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido) en N, N-dimetilformamida (DMF; por ejemplo, 20 mg de X-gal en 1 ml de DMF). Para maximizar el uso del kit, mida X-gal a la cantidad necesaria para cada ensayo y luego añadir la cantidad calculada de DMF para disolver. Alternativamente, almacenar la solución madre a -20 ° C en un tubo protegido de la luz durante un mes. Utilice tubos solamente de polipropileno (opaco) para diluir y almacenamiento de soluciones de X-gal.
    5. Preparar solución de tinción β-gal: 930 l de solución de tinción 1x, 10 l de tinción suplemento A, 10 l de tinción suplemento B, y 50 l de 20 mg / ml Xgal en DMF. Hacer una mezcla maestra dependiendo del número de pozos que ser manchado.
  3. Retire cuidadosamente el medio de las células usando una pipeta de transferencia o el equivalente.
  4. lavar suavemente las células una vez con temperatura ambiente 1x PBS.
  5. Añadir 1 ml solución de fijación de 1x a cada pocillo y se incuba durante 10 - 15 min a TA.
  6. Retire la solución de fijación con una pipeta de transferencia.
    NOTA: La solución de fijación (1x) contiene 2% de formaldehído y 0,2% de glutaraldehído y debe desecharse como residuo peligroso de acuerdo con las recomendaciones de la oficina de seguridad en el laboratorio.
  7. lavar suavemente las células dos veces con 1x PBS.
  8. Retire el PBS completamente y añadir solución de tinción β-gal 1x a los pocillos (1 ml / pocillo de una placa de 6 pocillos). Cubrir la placa completamente con papel de aluminio y se incuba durante 24 - 48 h en una incubadora a 37 ° (preferiblemente en ausencia de CO 2, ya que esto puede reducir el pH del tampón y afectar tinción).
    1. Compruebe las células a las 24 h para la tinción, y si la mancha es demasiado clara, se incuba durante otras 24 h.
  9. Después del tiempo de incubación, eliminar la solución de β-gal y reemplazarlo con 1x PBS.
    NOTA: Este paso elimina parte del color de fondo cuando las imágenes y también evita derrames peligrosos de la solución X-gal.
    NOTA: Desechar la solución de β-gal adecuadamente, de acuerdo con las recomendaciones de la oficina de seguridad en el laboratorio.
  10. Se examinan las células en un microscopio de luz con una cámara conectada utilizando un objetivo de 10x o superior; células SA-β-gal-positivas serán azul. Adquirir el número deseado de imágenes para el experimento. Si contando el porcentaje de células SA-β-gal-positivas, adquirir el número adecuado de imágenes (> 5) para la cuantificación por pocillo. Asegúrese de que las imágenes no se solapan de varios campos de visión dentro de cada uno así.
  11. Contar el número de SA-β-gal-positivo (azul) células frente al número de células totalespara calcular el porcentaje de células SA-β-gal-positivas. Contar> 100 células por condición.
    NOTA: Representante imágenes también se pueden utilizar para las figuras. Tenga en cuenta que una confluencia celular es fundamental para que las células de conteo, como demasiadas células hacen que sea difícil diferenciar cada célula y demasiado pocos no puede dar un número suficiente de células para la cuantificación y la estadística. Fotos de las cifras de la publicación están en la mejor resolución si se guardan como archivos .tiff, .jpeg aunque también son adecuados. Las imágenes en color deben ser de 300 dpi.

4. Las células de tinción para γ-H2AX

  1. Placa de las células de las secciones 1 o 2 en cubreobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos.
  2. Al día siguiente, se lavan las células con PBS 1x. Enjuague cuidadosamente, ya que las células senescentes no se adhieren bien a cubreobjetos y se pueden quitar fácilmente durante el lavado. Alternativamente, fijar directamente las células sin lavado.
  3. Retire el PBS y fijar las células con recién preparada formaldehído 3,7% en PBS durante10 min a TA.
  4. Eliminar la solución y permeabilizar las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 10 min.
  5. Eliminar la solución y el bloque en FBS al 5% en PBS durante 2 h a TA.
  6. Incubar con anti-fosfo γ-H2AX (Ser139) y conjugado FITC en 5% de FBS / PBS durante 2 horas a 37 ° C o O / N a 4 ° C. Proteger de la luz.
  7. Lavar 3 - 6x con PBS a 37 ° C durante un total de 30 - 60 min.
  8. Mancha con DAPI (diluido 1: 15.000 en PBS) durante 10 min a TA.
  9. Lavar 3x con PBS.
  10. lavar rápidamente con agua para eliminar las sales y montar el cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio utilizando 3 - 5 l de antifade reactivo. Alternativamente, utilizar una solución de montaje que contiene DAPI.
  11. Deje que se O seco / N y visualizar las células teñidas en un microscopio de fluorescencia o confocal utilizando un objetivo 63X o superior.
  12. Cuantificar los focos γ-H2AX mediante el uso de cualquiera de los dos métodos descritos a continuación. Puntuación para cualquiera de los protocolos por ojo utilizando un microscopio de fluorescencia. Lo ideal sería que nosotros,ea microscopio confocal. Tome secciones Z y se condensan en un solo plano con el fin de visualizar todos los focos detectable (imágenes representativas para la tinción de γ-H2AX en células en proliferación y senescentes se muestra en la Figura 3). Contar los focos por ojo utilizando software de imagen; en general, ~ 100 - 200 núcleos son suficientes para el conteo.
    1. Para cuantificar el porcentaje de células que tienen focos γ-H2AX-positivo, contar cada célula que tiene al menos uno de los focos visibles y se dividen por el número total de núcleos teñidos con DAPI.
    2. Para cuantificar el número de focos γ-H2AX, cuente los focos γ-H2AX por célula.
      NOTA: Los niveles de γ-H2AX pueden variar en función del factor de estrés o daño específico que induce la senectud.

5. Las células de tinción para SAHF marcadores

NOTA: Las células senescentes humanos a menudo tienen regiones nucleares de ADN condensada / cromatina. En las células senescentes, estas regiones heterochromaticse cree que inhiben la expresión de genes de proliferación de promoción, tales como miembros de la familia E2F. SAHF puede ser visualizado por la reorganización de DAPI; por la presencia de marcas de histona heterocromatina asociada, incluyendo los di- y tri-metilación de Lys9 en Histona H3 (H3K9me2 y H3K9me3); y por las proteínas de la cromatina reorganización, incluyendo la proteína heterocromatina HP1 1 (HP1), HIRA (histona represor A), y ASF1a (anti-silenciamiento función-1a) a la cromatina 30. Hemos elegido utilizar un modelo senescencia oncogén inducida (OIS), como SAHF es más prominente en modelos OIS 30. Células IDH4 proliferan en presencia de dexametasona debido a la presencia de antígeno T grande de SV40 pero se vuelven senescentes después de la eliminación de dexametasona a partir del medio 31. SAHF se puede detectar por tinción con DAPI y por tinción con anticuerpos contra los marcadores específicos mencionados anteriormente. A continuación, describimos DAPI y H3K9me2 tinción para la visualization de SAHF en las células 28.

  1. Se cultivan las células IDH4 en DMEM suplementado con 10% de FBS, 1% de penicilina / estreptomicina, y 1 mg / ml de dexametasona. Para inducir la senescencia, retire la dexametasona y cambiar el medio de manera que contiene FBS tratado con carbón vegetal; Después de crecer durante ~ 10 días en este nuevo medio, las células se vuelven senescentes IDH4 31.
  2. células IDH4 placa o células procedentes de las secciones 1 o 2, descritos anteriormente, en cubreobjetos de vidrio en una placa de 24 pocillos.
  3. Al día siguiente, se lavan las células con PBS 1x. Enjuague cuidadosamente, ya que las células senescentes no se adhieren bien a cubreobjetos y se pueden quitar fácilmente durante el lavado. Alternativamente, fijar directamente las células sin lavado.
  4. Retire el PBS y fijar las células con recién preparada formaldehído 3,7% en PBS durante 10 min a TA.
  5. Lavar las células 3 veces con 1x PBS.
  6. Eliminar la solución y permeabilizar las células con 0,2% de Triton X-100 en PBS durante 5 min.
  7. Lavar las células con 1xPBS. Retire el PBS y bloquear los cubreobjetos mediante la adición de tampón de bloqueo que contenía% de BSA 3 (w / v) en PBS durante 5 min a TA. Siempre filtrar soluciones que contienen BSA antes de su uso para eliminar la materia en partículas.
  8. Eliminar el tampón de bloqueo y se incuban las células con anticuerpos primarios contra marcadores SAHF tales como anticuerpos anti-H3KMe2 (Figura 4; véase la Tabla de Materiales para más detalles). Diluir los anticuerpos en tampón de bloqueo y se incuba durante 1 - 2 h a TA.
  9. Retirar la solución de anticuerpo primario y lavar los cubreobjetos 3 veces con 1% (v / v) de Triton X-100 en PBS.
  10. Diluir los anticuerpos secundarios en tampón de bloqueo (Tabla de Materiales) y se incuba durante 1 h a TA. Proteger de la luz.
  11. Lavar las células dos veces con 1x PBS. Mancha con DAPI (diluido 1: 15.000 en PBS; ver la Tabla de Materiales) durante 10 min a RT.
  12. Lavar los cubreobjetos 3 veces con 1x PBS.
    1. lavar rápidamente con agua para eliminar las sales de unand montar cada cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio utilizando 3 - 5 l de antifade reactivo. Alternativamente, utilizar una solución de montaje que contiene DAPI.
    2. Deje O seco / N y visualizar las células teñidas en un microscopio de fluorescencia o confocal utilizando un objetivo 63X o superior (ver los resultados representativos en la Figura 4). Cuantificar el SAHF como se describe en la Sección 4.
      NOTA: anticuerpos primarios de control de isotipo o sin anticuerpo primario (es decir secundario solo) deben utilizarse como un control negativo para la tinción de inmunofluorescencia.

6. Análisis de proteínas asociadas a la senescencia por inmunotransferencia

NOTA: El fenotipo senescente se caracteriza por la regulación al alza de los reguladores del ciclo celular, incluyendo INK4A p16, p21, y p53. Este protocolo describe la cuantificación de los niveles de estas proteínas en los lisados ​​celulares. Estas técnicas se pueden utilizar para evaluar la senescencia inducida usando una variedad demétodos de 21, 28, 29.

  1. Inducir la senescencia celular como se describe en las secciones 1 y 2 o utilizando otro método de 21, 28, 29. Para analizar marcadores de senescencia celular, la placa de las células en placas de 6 cm y analizar tanto la proteína y el ARN de forma simultánea (véase la Sección 7 para obtener instrucciones de aislamiento de ARN).
  2. Retire el medio de cultivo celular. Poner las células en una bandeja de hielo.
    1. Se lavan las células 2 veces con frío 1x PBS. Incline el plato para asegurar que todo el PBS es aspirado de modo que sea lo más precisa en términos de los volúmenes utilizados para el procedimiento.
    2. Después de aspirar el último lavado de PBS, añadir 200 l de frío 1x PBS (para un plato de 6 cm) al plato. Raspar las células utilizando un raspador de células.
    3. Pipetear la mezcla / PBS de células en un tubo de RNasa libre para el aislamiento de ARN. Tome aproximadamente 150 y# 181; L de esta mezcla y la pipeta en un tubo nuevo. Esta alícuota se utilizó para el análisis de proteínas, así que asegúrese de pipetear la misma cantidad de cada tubo.
  3. Lisar las células mediante la adición de 75 a 100! L de tampón de muestra de 2x Laemmli modificado (Tris-HCl 60 mM pH 6,8, 12,5% de glicerol, 2% SDS, 5% β-mercaptoetanol (BME), y azul de bromofenol; se pueden hacer hasta como un lote grande, se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C hasta su uso) o un tampón de muestra equivalente.
    1. Alternativamente, lisar las células en el 75 - 100 l de tampón de lisis y se centrifuga a 15.000 xg durante 10 min a 4 ° C para eliminar los restos celulares. Eliminar el sobrenadante y la pipeta en un tubo limpio. Un ensayo de proteínas de Bradford o un ensayo de proteína equivalente se pueden utilizar en lisados ​​para garantizar la igualdad de la carga de proteína.
      NOTA: los ensayos de proteínas no se pueden realizar en muestras lisadas en tampón de muestra.
    2. Sacar ~ 25 l de lisado y agregarlo a 15! L de tampón de muestra 2x. La pipeta hacia arriba y hacerwn en el tampón de muestra para lisar las células.
      NOTA: Los volúmenes de tampón de lisis o tampón de muestra pueden ajustarse dependiendo de la confluencia celular. Si la muestra es "pegajosa" debido a la lisis nuclear, añadir más tampón de muestra o PBS para diluir. Las muestras se pueden almacenar a -20 ° C hasta su uso.
  4. Hervir las muestras durante 5 min a 95 ° C en un bloque de calor (o equipo equivalente) y la carga ~ 40 l de muestra se lisaron en tampón de muestra en un gel de Tris-glicina al 18%.
    NOTA: un gel de gradiente (4-15%) o un gel de Tris-glicina al 14% también son suficientes para la detección de proteínas de bajo peso molecular. Los diferentes tipos de geles de acrilamida se pueden utilizar también, pero asegurar que los geles y sistema son adecuadas para la detección de proteínas de bajo peso molecular.
    1. Ejecutar utilizando tampón de ejecución 1x a una temperatura constante de 100 V durante 20 min (a través del gel de apilamiento) y ~ 60 min a 180 V. Supervisión de la gel por lo que el frente de colorante sólo se ejecuta fuera o está en el fondo del gel de manera que la baja molecular proteínas de peso no lo hacen rONU fuera del gel.
  5. Transferir el gel de acrilamida a una membrana de PVDF (pre-empapados con 100% de metanol para activar). Si al hacer una transferencia húmeda, sólo se necesita 1 hora para la transferencia (en comparación con el normal de ~ 1,75 h). Ajustar en consecuencia para el sistema de transferencia apropiado; utilizando marcadores de peso molecular teñidos previamente puede ayudar en la evaluación de la eficiencia de transferencia.
  6. Lavar la membrana en agua. Utilice una mancha Ponceau para vigilar para la igualdad de la carga de las muestras. Lavar el Ponceau con agua.
    1. Bloquear la membrana en leche en polvo al 5% sin grasa en TBST (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, y 0,1% de Tween-20) durante 1 h a TA o O / N a 4 ° C con agitación.
  7. Wash borra una vez con TBST y se incuba con el anticuerpo primario diluido en 5% de leche en TBST (véase la Tabla de Materiales para las diluciones y recomendaciones de anticuerpo) durante 1 h a TA.
  8. Realizar dos lavados rápidos con TBST y luego se lava dos veces en un agitador durante total de ~ 30 min (~ 15 min cada uno eramarido).
  9. Incubar con un anticuerpo secundario durante 40 min a RT. Repita el paso 6.10.
  10. Incubar con sustrato de transferencia Western recién hecho y desarrollar la película o leer en un lector de quimioluminiscencia.
  11. Inmunoblot sonda con anticuerpos p16 INK4a primeros (Figura 5). Franja de la membrana por incubación durante 15 min con agua, 15 min con NaOH 0,2 N, y 15 min con agua. Continuar con el paso 6.9 utilizando anticuerpos anti-p21.
  12. Franja de la membrana utilizando Tris-HCL 62,5 mM pH 6,8 y SDS al 2% con 300 l de BME recién añadido por 50 ml de solución de separación.
  13. Incubar a 50 ° C durante 30 min y se lava extensamente con TBS y luego TBST. La sonda con anticuerpos anti-actina o anti-GAPDH para los controles de la proteína de carga (Figura 5 muestra resultados representativos).
    NOTA: los niveles de p53 también pueden ser evaluados en las mismas membranas. Sin embargo, ya que p53 es un peso molecular más alto, es mejor resolvió en un gel de menor porcentaje (por ejemplo,     10% Tris-glicina o un gel de gradiente (4-15%)). Los niveles de proteína de otros marcadores senescentes también se pueden evaluar por lisados ​​de inmunotransferencia, incluyendo marcadores SAHF γ-H2AX y.

7. Análisis de los niveles de mRNA de la senescencia marcadores

NOTA: Cuando el aislamiento de ARN, asegurarse de que las superficies de trabajo se limpian con soluciones de eliminación de RNasa o un equivalente y que los materiales son todos libre de RNasa.

  1. Uso de la mezcla / PBS de células de la Etapa 4.2, añadir 1 ml de solución de extracción de RNA y de vórtice durante 30 s (no debe haber grumos visibles o residuos celulares).
  2. Añadir 200! L de cloroformo y agitar enérgicamente durante 15 s.
  3. Centrifugar a velocidad máxima (> 15.000 xg) durante 15 min a 4 ° C.
  4. Retire ~ 400! L de la capa acuosa ARN parte superior y la pipeta en un tubo de microcentrífuga nuevo.
  5. Añadir 400! L de isopropanol (1: 1 con el volumen total de la capa acuosa con pipeta en el paso anterior) y 4 l de precipitant a la capa de ARN.
  6. Centrifugar durante 15-30 min a la velocidad máxima (> 15.000 xg) y 4 ° C para sedimentar el ARN.
  7. Eliminar el sobrenadante y añadir 1 ml de etanol al 75% enfriado con hielo.
  8. Centrifugar durante 1 min a velocidad máxima (> 15.000 xg) y 4 ° C.
  9. Eliminar el sobrenadante y centrifugar durante 1 min a velocidad máxima (> 15.000 xg) y 4 ° C.
  10. Pipetear a cabo tanto líquido como sea posible y aire seco durante 2 min.
  11. Vuelva a suspender en 10 l de 10x tampón de ADNasa, 85 l de H 2 O, y 5 l de DNasa 1.
  12. Incubar a 37 ° C durante 30 min.
  13. Añadir 200 l de tampón NT2 (50 mM Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, y 0,05% de Nonidet P-40) y añadir 300 l de la capa inferior de ácido fenol-CHCl 2.
  14. Vortex durante 1 min y se centrifuga a temperatura ambiente durante 5 min a la velocidad máxima (> 15.000 xg).
  15. Recoger 250 l de la capa de RNA superior (2 x 125 l), agregar 25l de sodio 3 M de acetato de pH 5,2, 625 l de etanol al 100% enfriado en hielo, y 5 l de precipitante. Mezclar bien y precipitar O / N a -20 ° C.
  16. Al día siguiente, mezclar y centrifugado a la velocidad máxima (> 15.000 xg) y 4 ° C durante 30 min y se descarta el sobrenadante.
  17. Repita los pasos 6.8 a 6.11.
  18. Vuelva a suspender el precipitado en 12 l de agua libre de nucleasa y se almacena a -80 ° C hasta su uso.
    NOTA: Otros procedimientos de aislamiento de ARN y kits se pueden utilizar también.
  19. Realizar la transcripción inversa con hexámeros aleatorios y transcriptasa inversa SSII de acuerdo con el protocolo del fabricante.
    NOTA: Dada la baja cantidad de ARN aislado de células senescentes, lo mejor es utilizar todo el ARN (12 l) para la síntesis de transcripción inversa. Alternativamente, el ARN se puede cuantificar utilizando un espectrofotómetro, y cantidades iguales de RNA puede ser usado para la transcripción inversa.
  20. Analizar los niveles de mRNA en tiempo real mediante qPCR amplific cuantitativa (RT-qPCR)ación y SYBR verde mezcla maestra de PCR con cebadores específicos de genes.
    1. Como en una típica reacción RT-qPCR, diluir el ADNc de una y media (en RNasa agua / libre de DNasa) y añadir 3 l para el tiempo real de placa de 96 pocillos para una mayor precisión de pipeteo. Preparar una mezcla maestra reacción del gen específico de cebadores directo e inverso (concentración 2,5 M, añadir 5 l / reacción), mezcla de PCR SYBR verde (6,25 l / reacción, el uso de menos de la recomendación del fabricante), y 5,75 l de RNasa / agua libre de DNasa para un volumen final de reacción de 20 l (17 l de cebadores / SYBR verde / agua y 3 l de cDNA).
    2. Realizar la amplificación RT-qPCR utilizando una máquina de PCR en tiempo real; siga el protocolo del fabricante.
      NOTA: Una lista de los validado humana cebadores directo e inverso en tiempo real se puede encontrar en la Tabla 1. Estos genes incluyen proteínas SASP y otros marcadores asociados con la senescencia y / o genes. Los resultados representativos de la senescencia IR inducida se muestran en la Figura 6.

8. Cuantificación de los niveles de proteína SASP

  1. Inducir la senescencia usando secciones 1 o 2 o utilizando otro método. Placa de las células en cualquiera de las placas de 6 o 10 cm, como se describe anteriormente (~ 250.000 células / placa de 6 cm o ~ 650.000 / 10 cm de placa).
  2. Ya sea con células 10 d de tratamiento post-IR o con células senescentes replicativas (y células de control apropiadas), se lavan las células tres veces con 1x PBS y añadir medio libre de suero con antibióticos en un pequeño volumen (2,5 mL para 6 cm o 5 mL por 10 cm).
  3. Incubar durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2 en un incubador de cultivo de tejidos. Al día siguiente, recoger el medio y lo puso en un tubo cónico en hielo.
  4. Se lavan las células 2 veces con PBS y después se añade 1 ml de tripsina (para un plato de 6 cm). Contar las células usando un hemocitómetro para ajustar más tarde las concentraciones de acuerdo con el número de células.
  5. Centrifugar el medio durante 5 min a 300 x g.
  6. filter el medio utilizando un filtro de jeringa de 0,45 m.
  7. Alícuota el medio y se congelan a -80 ° C hasta su uso o ensayo directamente usando ELISA o ensayos equivalentes.
  8. Calcular el número de células / ml de concentración mediante la adopción de la célula número / volumen total de medio recogido.
  9. Realizar un ensayo apropiado inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) según las instrucciones del fabricante. Ver la Tabla de Materiales para kits de ELISA recomendados para el ensayo de IL-6, IL-8, GRO, y otras citocinas / quimiocinas (Figura 6B).
  10. Para asegurarse de que los factores que se miden están dentro del rango lineal del kit ELISA, hacer diluciones del medio de células senescentes en comparación con el medio de células en proliferación. Cuenta de estas diluciones y el volumen en el cálculo de la cantidad de IL-6. Para adquirir la cantidad de IL-6 secretada por célula por día, calcular el valor de IL-6 obtenido a partir del kit (en pg) por la concentración de células diluida por ml (frpaso om 7,8).
    NOTA: Otros métodos, tales como matrices de citoquinas, se puede utilizar para detectar los niveles de proteína SASP y puede ser adecuado para el cribado de un gran número de factores SASP. Los niveles de proteína de factores SASP pueden variar en función del tiempo después de la inducción de senescencia, el tipo de célula, o el tipo de la senescencia inducida.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las figuras 2 - 6 muestran resultados representativos de tinción SA-β-gal; tinción de γ-H2AX y SAHF; evaluación de los niveles de proteína de p16 INK4a, p21, y p53; y el ARNm y los niveles de proteína de moléculas-senescentes asociado. Aumento de la tinción SA-β-gal se produce con replicativa y daño en el DNA inducido por senescencia. También, observar los cambios morfológicos que se producen con la senescencia. Las células se agrandan y plana en comparación c...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, hemos descrito métodos para replicativa y daño de ADN inducido por senescencia utilizando fibroblastos diploides humanos. Además, las técnicas para la cuantificación de proteínas y niveles de ARNm de varias proteínas de la senescencia asociado se incluyen, así como tinción para SA-β-gal y para el marcador de daño de ADN γ-H2AX. Estos protocolos pueden ser ampliamente utilizados para evaluar fenotipos senescentes tanto in vitro como in vivo, aunque existen muchas advertencias para la caracterizaci...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional sobre el Envejecimiento. Los autores desean agradecer a Myriam Gorospe y Kotb Abdelmohsen útil para muchos debates sobre la senescencia y Kotb Abdelmohsen para también la lectura crítica del manuscrito. Agradecemos también a los miembros de nuestro laboratorio, especialmente Douglas Dluzen para la lectura crítica del manuscrito.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
16% Tris-glicina gelesInvitrogenXP00160BOX
Acid-Phenol ChCl3AmbionAM9720
Alexa-Fluor 568 cabra anticuerpo anti-ratónInvitrogenA11031dilución 1:300
Elevadores celularesCorning Inc.3008Raspador de células
ECL anti-ratón anticuerpo ligado a HRPAmershamNA931V
ECL Plus Western BlottingSubstrate Pierce32132ECL
DAPISondas molecularesMP01306stock 5 mg/mL en dH2O
Anticuerpo GAPDHSanta Cruzsc-322331:1.000 - 5.000 dilución
GlycoBlueAmbionAM9515
Histona H3 dimetil K9 anticuerpo monoclonalAbcam1220dilución 1:500
IL-6 humano Quantikine ensayo ELISAR& D systemsD6050
Humano IL-8 Quantikine ELISA ensayoR& D systemsD8000C
Human GROa Quantikine ELISA ensayoR& Sistemas DDRG00
N-N-dimetilformamida SigmaD4551DMF
p16 anticuerpo monoclonalBD Biosciences51-1325grdilución 1:500
anticuerpo monoclonal p21Millipore05-345dilución 1:750
anticuerpo monoclonal p53Santa Cruzsc-1261:500 clon de dilución DO-1
phospho-H2AX (Ser139) FITC anticuerpo conjugadoCell Signaling97191:2.000 dilución
POWER mezcla maestra de PCR verde SYBR Applied Biosystems4367659
Marcadores de peso molecular preteñidosBiorad161-0374
ProLong Gold Antifade Membrana de PVDF InvitrogenP36930
 Thermo Scientific88518
Senescencia β-galactosidasa Kit de tinciónSeñalización celular9860
TRIzolAmbion/Life Tech10296028

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
  2. van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
  3. Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F. Cellular senescence: when bad things happen to good cells. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (9), 729-740 (2007).
  4. Dimri, G., et al. A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 9363-9367 (1995).
  5. Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. The essence of senescence. Genes Dev. 24 (22), 2463-2479 (2010).
  6. Pospelova, T. V., et al. Pseudo-DNA damage response in senescent cells. Cell Cycle. 8 (24), 4112-4118 (2009).
  7. Narita, M., et al. Rb-mediated heterochromatin formation and silencing of E2F target genes during cellular senescence. Cell. 113 (6), 703-716 (2003).
  8. Ben-Porath, I., Weinberg, R. A. The signals and pathways activating cellular senescence. Int J Biochem Cell Biol. 37 (5), 961-976 (2005).
  9. Campisi, J. Senescent cells, tumor suppression, and organismal aging: good citizens, bad neighbors. Cell. 120 (4), 513-522 (2005).
  10. Coppe, J. P., et al. Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor. PLoS Biol. 6 (12), 2853-2868 (2008).
  11. Tominaga-Yamanaka, K., et al. NF90 coordinately represses the senescence-associated secretory phenotype. Aging (Albany NY). 4 (10), 695-708 (2012).
  12. Wiley, C. D., et al. Mitochondrial Dysfunction Induces Senescence with a Distinct Secretory Phenotype. Cell Metab. 23 (2), 303-314 (2016).
  13. Hoare, M., et al. NOTCH1 mediates a switch between two distinct secretomes during senescence. Nat Cell Biol. 18 (9), 979-992 (2016).
  14. Rodier, F. Detection of the senescence-associated secretory phenotype (SASP). Methods Mol Biol. 965, 165-173 (2013).
  15. Srikantan, S., Marasa, B. S., Becker, K. G., Gorospe, M., Abdelmohsen, K. Paradoxical microRNAs: individual gene repressors, global translation enhancers. Cell Cycle. 10 (5), 751-759 (2011).
  16. Abdelmohsen, K., Gorospe, M. Noncoding RNA control of cellular senescence. Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. , (2015).
  17. Bhaumik, D., et al. MicroRNAs miR-146a/b negatively modulate the senescence-associated inflammatory mediators IL-6 and IL-8. Aging. 1 (4), 402-411 (2009).
  18. Rodier, F., et al. DNA-SCARS: distinct nuclear structures that sustain damage-induced senescence growth arrest and inflammatory cytokine secretion. J Cell Sci. 124 (PT 1), 68-81 (2011).
  19. Bernardes de Jesus, B., Blasco, M. A. Assessing cell and organ senescence biomarkers. Circ Res. 111 (1), 97-109 (2012).
  20. Sharpless, N. E., Sherr, C. J. Forging a signature of in vivo senescence. Nat Rev Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).
  21. Rubio, M. A., Kim, S. -H., Campisi, J. Reversible Manipulation of Telomerase Expression and Telomere Length: implications for the ionizing radiation response and replicative senescence of human cells. J Biol Chem. 277 (32), 28609-28617 (2002).
  22. Chen, Q. M., Prowse, K. R., Tu, V. C., Purdom, S., Linskens, M. H. K. Uncoupling the Senescent Phenotype from Telomere Shortening in Hydrogen Peroxide-Treated Fibroblasts. Experimental Cell Research. 265 (2), 294-303 (2001).
  23. Dumont, P., et al. Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast. Free Radic Biol Med. 28 (3), 361-373 (2000).
  24. Roninson, I. B. Tumor Cell Senescence in Cancer Treatment. Cancer Research. 63 (11), 2705-2715 (2003).
  25. Nyunoya, T., et al. Cigarette Smoke Induces Cellular Senescence. J Respir Cell Mol Biol. 35 (6), 681-688 (2006).
  26. Bai, H., Gao, Y., Hoyle, D. L., Cheng, T., Wang, Z. Z. Suppression of Transforming Growth Factor-β Signaling Delays Cellular Senescence and Preserves the Function of Endothelial Cells Derived From Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells Transl Med. , (2016).
  27. Senturk, S., et al. Transforming growth factor-beta induces senescence in hepatocellular carcinoma cells and inhibits tumor growth. Hepatology. 52 (3), 966-974 (2010).
  28. Aird, K. M., Zhang, R. Detection of senescence-associated heterochromatin foci (SAHF). Methods Mol Biol. 965, 185-196 (2013).
  29. Pospelova, T. V., Chitikova, Z. V., Pospelov, V. A. An integrated approach for monitoring cell senescence. Methods Mol Biol. 965, 383-408 (2013).
  30. Di Micco, R., et al. Interplay between oncogene-induced DNA damage response and heterochromatin in senescence and cancer. Nat Cell Biol. 13 (3), 292-302 (2011).
  31. Wright, W. E., Pereira-Smith, O. M., Shay, J. W. Reversible cellular senescence: implications for immortalization of normal human diploid fibroblasts. Mol Cell Biol. 9 (7), 3088-3092 (1989).
  32. Bursuker, I., Rhodes, J. M., Goldman, R. Beta-galactosidase--an indicator of the maturational stage of mouse and human mononuclear phagocytes. J Cell Physiol. 112 (3), 385-390 (1982).
  33. Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall. Histol Histopathol. 22 (9), 971-976 (2007).
  34. Witkiewicz, A. K., Knudsen, K. E., Dicker, A. P., Knudsen, E. S. The meaning of p16(ink4a) expression in tumors: functional significance, clinical associations and future developments. Cell Cycle. 10 (15), 2497-2503 (2011).
  35. Baker, D. J., et al. Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan. Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).
  36. Baker, D. J., et al. Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders. Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).
  37. Demaria, M., et al. An Essential Role for Senescent Cells in Optimal Wound Healing through Secretion of PDGF-AA. Dev Cell. 31 (6), 722-733 (2014).
  38. Noren Hooten, N., et al. Metformin-mediated increase in DICER1 regulates microRNA expression and cellular senescence. Aging Cell. 15 (3), 572-581 (2016).
  39. Barzilai, N., Crandall, J. P., Kritchevsky, S. B., Espeland, M. A. Metformin as a Tool to Target Aging. Cell Metab. 23 (6), 1060-1065 (2016).
  40. Foretz, M., Guigas, B., Bertrand, L., Pollak, M., Viollet, B. Metformin: from mechanisms of action to therapies. Cell Metab. 20 (6), 953-966 (2014).
  41. Cahu, J., Sola, B. A sensitive method to quantify senescent cancer cells. J Vis Exp. (78), (2013).
  42. Debacq-Chainiaux, F., Erusalimsky, J. D., Campisi, J., Toussaint, O. Protocols to detect senescence-associated beta-galactosidase (SA-betagal) activity, a biomarker of senescent cells in culture and in vivo. Nat Protoc. 4 (12), 1798-1806 (2009).
  43. Noppe, G., et al. Rapid flow cytometric method for measuring senescence associated beta-galactosidase activity in human fibroblasts. Cytometry A. 75 (11), 910-916 (2009).
  44. Bassaneze, V., Miyakawa, A. A., Krieger, J. E. Chemiluminescent detection of senescence-associated beta galactosidase. Methods Mol Biol. 965, 157-163 (2013).
  45. Redon, C. E., et al. gamma-H2AX detection in peripheral blood lymphocytes, splenocytes, bone marrow, xenografts, and skin. Methods Mol Biol. 682, 249-270 (2011).
  46. Kosar, M., et al. Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a). Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).
  47. Kennedy, A. L., et al. Senescent mouse cells fail to overtly regulate the HIRA histone chaperone and do not form robust Senescence Associated Heterochromatin Foci. Cell Div. 5, 16(2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cellular SenescenceSenescence InductionSA gal StainingGamma IrradiationDNA DamageSASP QuantificationRT qPCR AnalysisELISA DetectionSenescence MarkersCell Cycle Arrest

Related Articles