Artículo de método

Análisis de inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés tras el desafío bacteriano de las células de mamíferos

9.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/55536

⸱

3 de julio de 2017

 ,  , 
1Unité de Pathogénie Microbienne Moléculaire, INSERM U786, Institut Pasteur, 2Microbiologie et Maladies Infectieuses, Collège de France, 3Laboratory of Intestinal Immunity, Institut Imagine-INSERM UMR 1163, Université Paris Descartes-Sorbonne Paris Cité

En este artículo

Resumen

Describimos un método para el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación de gránulos de estrés en células de mamíferos después de que las células son desafiadas con bacterias y una serie de diferentes tensiones. Este protocolo puede aplicarse para investigar la respuesta de los gránulos de estrés celular en una amplia gama de interacciones huésped-bacteriana.

Resumen

La imagen fluorescente de los componentes celulares es una herramienta eficaz para investigar las interacciones huésped-patógeno. Los patógenos pueden afectar muchas características diferentes de las células infectadas, incluyendo ultraestructura de organelos, organización de la red del citoesqueleto, así como procesos celulares como la formación de gránulos de estrés (SG). La caracterización de cómo los patógenos subvertir procesos de acogida es una parte importante e integral del campo de la patogénesis. Mientras que los fenotipos variables pueden ser fácilmente visibles, el análisis preciso de las diferencias cualitativas y cuantitativas en las estructuras celulares inducidas por el desafío del patógeno es esencial para definir diferencias estadísticamente significativas entre muestras experimentales y de control. La formación de SG es una respuesta de estrés evolutivamente conservada que conduce a respuestas antivirales y se ha investigado durante mucho tiempo utilizando infecciones virales 1 . La formación de SG también afecta a las cascadas de señalización y puede tener otras consecuencias aún desconocidas2 . La caracterización de esta respuesta de estrés a patógenos distintos de los virus, como los patógenos bacterianos, es actualmente un área de investigación emergente 3 . Por ahora, el análisis cuantitativo y cualitativo de la formación de SG aún no se utiliza rutinariamente, incluso en los sistemas virales. Aquí describimos un método sencillo para inducir y caracterizar la formación de SG en células no infectadas y en células infectadas con un patógeno bacteriano citosólico, lo que afecta a la formación de SGs en respuesta a diversas tensiones exógenas. El análisis de la formación y composición de SG se logra utilizando un número de diferentes marcadores SG y el detector de puntos del plug-in ICY, una herramienta de análisis de imágenes de código abierto.

Introducción

La visualización de las interacciones huésped-patógeno a nivel celular es un método poderoso para obtener información sobre las estrategias patógenas y para identificar las vías celulares clave. De hecho, los patógenos pueden utilizarse como herramientas para identificar objetivos o estructuras celulares importantes, ya que los patógenos han evolucionado para subvertir los procesos celulares centrales como una estrategia para su propia supervivencia o propagación. La visualización de componentes celulares puede conseguirse mediante la expresión recombinante de proteínas huésped marcadas fluorescentemente. Aunque esto permite el análisis en tiempo real, la generación de líneas celulares con proteínas huésped marcadas específicamente es muy laboriosa y puede dar lugar a efectos secundarios indeseables. Más conveniente es la detección de factores celulares utilizando anticuerpos específicos, porque múltiples factores del huésped pueden ser analizados simultáneamente y uno no se limita a un tipo de célula particular. Un inconveniente es que sólo se puede captar una vista estática, ya que el análisis de inmunofluorescencia requiere un fijador de células huéspedion. Sin embargo, una ventaja importante de la inmunofluorescencia es que se presta fácilmente al análisis cualitativo y cuantitativo. Esto, a su vez, puede utilizarse para obtener diferencias estadísticamente significativas para proporcionar nuevos conocimientos sobre las interacciones huésped-patógeno.

Los programas de análisis de imágenes fluorescentes son poderosas herramientas analíticas para realizar análisis 3D y 4D. Sin embargo, el alto costo del software y su mantenimiento hacen que los métodos basados ​​en software libre libre sean más atractivos. El análisis cuidadoso de la imagen usando el software del bio-análisis es valioso como substancia el análisis visual y, al asignar significados estadísticos, aumenta confianza en la exactitud de un fenotipo dado. Anteriormente, las SG se analizaron utilizando el software gratuito ImageJ, que requiere la identificación manual de cada SG 4 . Aquí se proporciona un protocolo para la inducción y el análisis de la formación de SG celular en el contexto de bacUtilizando el software gratuito de análisis de bioimágenes de código abierto ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). El software de análisis de imágenes biológicas tiene un programa de detección de manchas integrado que es muy adecuado para el análisis de SG. Permite el ajuste fino del proceso de detección automatizado en regiones de interés especificadas (ROIs). Esto supera la necesidad de un análisis manual de SG individuales y elimina el sesgo de muestreo.

Muchas tensiones ambientales inducen la formación de SGs, que son estructuras citosólicas, no membranosas, de densidad de fase de 0,2 - 5 μm de diámetro 5,6 . Esta respuesta celular se conserva evolutivamente en levaduras, plantas y mamíferos y ocurre cuando se inhibe la traducción global de proteínas. Implica la agregación de complejos de iniciación de traducción estancados en SGs, que se consideran lugares de retención para mRNAs translacionalmente inactivos, permitiendo la traducción selectiva de un subconjunto de mRNAs celulares.Tras la eliminación del estrés, los SG se disuelven y se reanudan las tasas globales de síntesis de proteínas. Las SG se componen de factores de iniciación de la elongación de la traducción, proteínas implicadas en el metabolismo del ARN, proteínas de unión a ARN, así como proteínas de andamio y factores implicados en la señalización de células hospedadoras 2 , aunque la composición exacta puede variar dependiendo de la tensión aplicada. Los factores ambientales que inducen la formación de SG incluyen la inanición de aminoácidos, la irradiación UV, el choque térmico, el choque osmótico, el estrés del retículo endoplásmico, la hipoxia y la infección viral 2 , 7 , 8 . Se ha avanzado mucho en la comprensión de cómo los virus inducir y también subvertir la formación de SG, mientras que todavía poco se sabe acerca de cómo otros patógenos, como patógenos bacterianos, hongos o protozoarios, afectan a esta respuesta al estrés celular 1 , 7 .

ShigeLla flexneri es un patógeno citosólico facultativo gramnegativo de los seres humanos y el agente causante de la diarrea o shigelosis severa. La shigelosis es una importante carga de salud pública y causa 28.000 muertes anuales en niños menores de 5 años 9 , 10 . S. flexneri infecta el epitelio del colon y se extiende célula a célula mediante el secuestro de los componentes del citoesqueleto del huésped [ 11 , 12] . La infección del epitelio apoya la replicación de S. flexneri dentro del citosol, pero los macrófagos infectados mueren a través de un proceso inflamatorio de muerte celular llamado piroptosis. La infección conduce a un reclutamiento masivo de neutrófilos e inflamación severa que es acompañada por calor, estrés oxidativo y destrucción de tejidos. De este modo, mientras que las células infectadas están sujetas a tensiones internas inducidas por la infección, tales como la interrupción de Golgi, estrés genotóxico y reordenamiento citoesqueléticoS, las células infectadas también están sometidas a tensiones ambientales debidas al proceso inflamatorio.

Caracterización del efecto de la infección por S. flexneri sobre la capacidad de las células para responder a las tensiones ambientales utilizando un número de marcadores SG ha demostrado que la infección conduce a diferencias cualitativas y cuantitativas en la composición SG 3 . Sin embargo, se sabe poco sobre otros patógenos bacterianos. Aquí se describe una metodología para la infección de las células huésped con el patógeno citosólico S. flexneri , el estresamiento de las células con diferentes tensiones ambientales, el etiquetado de los componentes SG y el análisis cualitativo y cuantitativo de la formación y composición SG en el contexto de la infección Y células no infectadas. Este método es ampliamente aplicable a otros patógenos bacterianos. Además, el análisis de imagen de la formación de SG puede usarse para infecciones por virus u otros patógenos. Se puede utilizar para analizar SGFormación tras la infección o el efecto de la infección en la formación de SG en respuesta a tensiones exógenas.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Preparación de bacterias y células huésped

  1. Transferir las tapas de cristal de 12 ó 14 mm en placas de 24 ó 12 pocillos, respectivamente, con pinzas estériles, contando un pocillo por condición experimental. Esterilizar estos por tratamiento UV en una campana de cultivo de tejidos durante 15 min.
    NOTA: Incluya pocillos de control para la estimulación bacteriana y para la inducción de SG por estrés exógeno.
  2. Para una placa de 24 pocillos con cubreobjetos de 12 mm, sembrar 1 x 105 células de mamífero ( por ejemplo, células HeLa) sobre cubreobjetos; Presione los cubreobjetos hacia abajo con una punta de pipeta estéril. Dejar que las células se adhieran durante la noche a 37 ° C en una incubadora de cultivo de tejidos de CO 2 al 5% en medio de cultivo apropiado para cada tipo de célula.
    NOTA: Las células de la placa de modo que la confluencia de las células está entre 40 - 60% al día siguiente.
    1. Para las células HeLa, incube en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con aminoácidos no esenciales (NEAA) y suero de ternera fetal (FCS) descompletado al 10%.Descomponga FCS calentando durante 30 min en un baño de agua a 56 ° C, remolino del suero una vez después de 15 min.
  3. Para eliminar las bacterias, use una punta de pipeta estéril para extraer una pequeña cantidad de un stock de glicerol bacteriano (20% de glicerol) almacenado en un congelador de -80 ° C y colocarlo en una placa etiquetada. Utilice un bucle estéril para esparcir las bacterias sobre alrededor del 10% de la placa. Utilice un nuevo bucle estéril y arrástrelo a través del frotis para hacer 3 líneas paralelas, media placa de largo. Traza a través de estas líneas que cubren el resto de la placa. Incubar la placa O / N a 37 ° C.
    1. Seleccione una sola colonia bacteriana ( p. Ej., S. flexneri ) de la placa recién chapada. Evite trabajar con colonias bacterianas mayores de 1 semana.
    2. Para la cepa M90T de S. flexneri , inocular una colonia roja de una placa de agar rojo de agar de soja Tryptic de soja triturada recién listada en placa de agar rojo de Congo al 0,1% en 8 mL de caldo de soja tríptica en un tubo de 15 mL; Apriete la tapa e incube el agitación a 222 rpm O / N a 30ºC6; C.
      PRECAUCIÓN: No utilice grandes colonias blancas, ya que han perdido el plásmido de virulencia y no son infecciosas.

2. Desafío bacteriano de las células huésped

  1. Prepare las bacterias para maximizar el potencial de infección.
    1. Para S. flexneri , subcultivo bacterias mediante la adición de 150 μ l de O / N de cultivo a 8 mL de triptoma de soja Agar e incubar agitando 222 rpm a 37 ° C a la fase exponencial tardía (~ 2 h) para inducir la virulencia de la expresión génica y mejorar la infección.
      1. Cuando el cultivo tiene una densidad óptica entre 0,6 y 0,9 (medida a 600 nm), transfiera 1 ml de cultivo en un tubo de 1,5 ml. Las bacterias de Pellet durante 2 min a 8.000 xg y resuspender en medio de infección (DMEM con NEAA, sin FCS) a OD 600 = 1. Así, si la OD 600 es de 0,85, resuspender en 850 μl.
        NOTA: Para S. flexneri, a OD 600 = 1, habrá 8 x 10 8 bacterias por ml cuandoCultivadas en 8 ml de medio. Una multiplicidad de infección (MOI) de 20 es apropiada. Para otros patógenos, el número de bacterias por ml a una DO 600 y la MOI apropiada deben determinarse empíricamente.
    2. Para potenciar las interacciones bacteriano-huésped, cubra las bacterias con Poly-L-Lysine (PLL).
      NOTA: El tratamiento con PLL de S. flexneri no tuvo efecto sobre la dinámica SG. Otros patógenos necesitan ser evaluados por su facilidad para el tratamiento PLL.
      1. Para cubrir las bacterias con PLL, centrifugar 1 ml de cultivo bacteriano durante 2 min a 8.000 xg y luego resuspender el sedimento en 10 μg / ml de PLL en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a una DO 600 = 1.
      2. Añadir la solución bacteriana a un plato pequeño, como un pocillo dentro de una placa de 12 pocillos, e incubar a RT (~ 20 ° C) durante 10 min con agitación suave en un agitador de placas.
      3. Las bacterias de pellets durante 2 min a 8.000 xg, eliminar el exceso de PLL. Resuspender el sedimento en 1 ml de PBS yD repetir este paso de lavado dos veces. Después del lavado final, resuspender en medio de infección a DO _ { 600 } = 1.
        NOTA: Aquí, el medio de infección para S. flexneri es medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS.
  2. Preparar las células para el desafío bacteriano.
    1. Eliminar el medio de las células HeLa de mamíferos utilizando una bomba de succión. Añadir 500 μl de medio de células RT HeLa para lavar las células, remover el medio con una bomba de succión y reemplazar con 500 μl de medio de infección apropiado para RT ( por ejemplo , medio de célula huésped con HEPES 20 mM sin FCS).
    2. NOTA: Para todos los pasos de lavado, trabaje rápidamente y procese sólo hasta 4 cubreobjetos a la vez para evitar el secado de las células.
  3. Desafío preparado células HeLa con bacterias para infectar 20 - 50% de las células.
    NOTA: El tiempo apropiado y MOI necesitan ser determinados para cada especie bacteriana. Generalmente, un buen inicio es de 30 min a 37° C con una MOI de 10.
    1. Para S. flexneri, desafiar las células celulares HeLa utilizando uno de los dos métodos (paso 2.3.1.1 o 2.3.1.2).
      1. Girar bacterias tratadas sin PLL (20 μL de DO 600 = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) sobre células durante 10 min a 13000 x g.
      2. Añadir bacterias recubiertas de PLL (15 μL de DO 600 = 1 / pocillo de placa de 24 pocillos en 500 μL de medio) durante 15 minutos a RT para permitir que las bacterias se depositen en las células.
    2. Permita que la infección ocurra colocando las células con bacterias asentadas en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C durante 30 min.
      NOTA: Durante períodos de tiempo cortos, sincronice la infección por S. flexneri colocando las placas en un baño de agua a 37 ° C durante 15 min en lugar de en la incubadora de cultivo de tejidos.
  4. Parar la infección lavando las células.
    1. Para lavar las células y eliminar el exceso de bacterias, retire el medio con una bomba de succión, agregue 1 mLMedio de cultivo HeLa recién calentado (37 ° C) (DMEM, FCS al 10%, NEAA). Remueva el medio, remueva y reemplace con un medio fresco. Repetir dos veces y dejar medio fresco en las células.
      1. Para S. flexneri , u otras bacterias intracelulares, después de la infección de las células HeLa y los lavados, reemplazar el medio con medio de cultivo tisular estándar que contiene 50 μg / ml de gentamicina para matar las bacterias extracelulares e impedir la invasión celular.
        NOTA: No agregue antibióticos en el medio para bacterias extracelulares.
  5. Incubar las bacterias con las células durante la cantidad deseada de tiempo en una incubadora de cultivo de tejidos.
    NOTA: Para S. flexneri , la infección puede ser de hasta 6 h dependiendo del tipo de célula. Para las células HeLa, dejar que la infección continúe durante 1,5 - 2 h antes de añadir estrés exógenos para inducir la formación de SG. En el caso de las infecciones por Caco-2, en las que la Shigella se extiende célula a célula, se infecta durante 30 min a 6 h antes de añadir estrés exógeno. CeLls puede fijarse en este punto sin añadir estrés exógeno para evaluar la formación de SGs como resultado de la infección bacteriana (en ese caso, proceda a la sección 4).

3. La inducción de la formación de gránulos de estrés por la adición de estrógenos exógenos

  1. Eliminar el medio de las células HeLa infectadas y no infectadas usando una bomba de succión, reemplazar el medio con 500 μl de medio apropiado con o sin el factor de estrés e incubar.
    NOTA: Las condiciones que inducen el estrés incluyen las siguientes (ver abajo). Para tratamientos adicionales véase Kedersha et al . 13 .
    1. Para el tratamiento de choque térmico, utilice un medio regular que contenga HEPES 20 mM y coloque la placa en un baño de agua a 44 ° C durante 30 min.
    2. Para el tratamiento con clotrimazol (induce estrés mitocondrial), use medio regular sin FCS con 20 μM de clotrimazol e incube en una incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de 20 mM de clotrimazol en dimetilsulfóxido (DMSO) a -20ºC durante hasta 4 meses. Use el vehículo DMSO para las células de control.
    3. Para el tratamiento con arsenito (induce estrés oxidativo), use medio regular con arsenito 0,5 μM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Almacene las alícuotas de un solo uso de arsenito de 0,5 mM a -20 ° C durante un máximo de 6 meses.
      PRECAUCIÓN: El clotrimazol y el arsenito son nocivos y peligrosos para el medio ambiente y deben ser eliminados de manera adecuada.
    4. Para el tratamiento con Des-Metil Des-Amino (DMDA) -pateamina (inhibe la iniciación de la traducción eucariótica), use medio regular con DMPA-pateamina de 50 - 200 nM e incube en incubadora de cultivo de tejidos durante 1 h.
      NOTA: Guarde DMDA-pateamina a -80 ° C. Guarde los reactivos como pequeñas alícuotas para evitar la descongelación por congelación.

4. Análisis de fijación e inmunofluorescencia de la formación de gránulos de estrés

NOTA: Procese el control yExperimental cubreobjetos al mismo tiempo para evitar la tinción de las diferencias que pueden afectar el análisis de imagen en pasos posteriores. Las muestras de control incluyen ninguna infección con y sin tratamiento de inducción de SG, y muestras infectadas con y sin tratamiento de inducción de SG.

  1. Retire completamente el medio con una bomba de succión y fije las muestras añadiendo 0,5 mL RT paraformaldehído al 4% (PFA) en PBS. Incubar durante 30 minutos a TA.
    PRECAUCIÓN: La PFA es perjudicial para el manipulador y el entorno. Tomar la medida adecuada para proteger el manipulador y eliminar con residuos químicos.
    NOTA: Alternativamente, fijar durante 15 minutos y luego reemplazar con metanol pre-enfriado a -20 ° C durante 10 minutos para retener más localización citoplasmática de los marcadores SG 13 .
  2. Retire la PFA con una pipeta y deseche el líquido en un recipiente de residuos apropiado. Lavar la cubreobjetos con 1 ml de solución salina tamponada con Tris (TBS: Tris 25 mM, pH 7,3, NaCl 15 mM). Incubar el cubreobjetos durante 2 min con agitación suaveEn un agitador de placas durante el lavado.
  3. Quitar TBS completamente con una bomba de succión y añadir 500 μ l 0,3% Triton-X100 en TBS durante 10 minutos para permeabilizar las células.
  4. Quitar la solución permeabilizante con una bomba de succión. Reemplazar con 1 mL de TBS, agitar suavemente la placa, eliminar TBS por succión y agregar 1 mL de solución de bloqueo (5% de FCS en TBS) durante 1 h a RT.
  5. Preparar la solución de anticuerpo primario (dilución 1: 300) en FCS al 5% en TBS. Calcule 50 μl por cubreobjetos de 12 mm y haga suficiente para todos los cubreobjetos en un lote.
    NOTA: Los anticuerpos primarios comunes que se usan son G3BP1, eIF3b y TIA1.
  6. Coloque 50 μL de la mezcla de anticuerpos primarios sobre una película de parafina de plástico (parafilm) firmemente adherida sobre el banco o cámara.
    NOTA: En la Tabla de Materiales se proporciona una lista de marcadores SGs canónicos, pero la composición de los SG puede depender de la tensión aplicada. Otros marcadores SG se enumeran en Kedersha et al. 13 Los resultados esperados para una serie de marcadores SG para la infección por S. flexneri se enumeran en la Tabla 1 .
  7. Recoja el cubreobjetos con pinzas, limpie el borde del cubreobjetos sobre el tejido, libere brevemente las pinzas para eliminar el exceso de líquido y coloque suavemente boca abajo sobre la gota. Incubar cubreobjetos durante 1,5 h a RT o durante la noche a 4 ° C en una cámara húmeda.
    NOTA: Para preparar una cámara húmeda, coloque los tejidos humedecidos a lo largo de los bordes de una cámara firmemente cerrada forrada con parafilm plástico.
  8. Transferir cada cubreobjetos con pinzas en un pozo de una nueva placa de 24 pocillos llena de 1 mL de TBS; Incubar con agitación suave en un agitador de placas durante 5 min. Aspirar el TBS en cada pocillo usando una bomba de succión, reemplazar con 1 mL de TBS y colocar de nuevo en el agitador de placas durante 5 min. Repita el lavado una vez más.
    NOTA: Reutilice el parafilm quitando el exceso de líquido con un pañuelo de papel y lavando la superficie con agua. Asegúrese de que la película de parafina esté completamente seca antes de usinG para la siguiente etapa de tinción.
  9. Preparar la solución de anticuerpos secundarios en TBS (dilución 1: 500-1: 2000). Para teñir el núcleo y las bacterias, añadir 2 μ g / mL DAPI a la mezcla. Para teñir actina, añada fluorescentes phalloidin. Pipetear 50 μL de mezcla de anticuerpos secundarios sobre la película de parafina de plástico.
    NOTA: Se recomienda el uso de anticuerpos secundarios de burro de absorción cruzada altamente purificados para estudios de co-localización de diferentes marcadores SG cuando se usa G3BP1 (anticuerpo de cabra). Elija anticuerpos secundarios marcados fluorescentemente con espectros no superpuestos. EIF3b mancha claramente el citoplasma de las células y por lo tanto es un buen marcador para delinear las células. La tinción de actina ayuda además a delinear las células en los sitios de contacto de célula a célula y las áreas de entrada bacteriana.
  10. Recoja el cubreobjetos con pinzas, dab el borde de la cubreobjetos en el tejido, liberando brevemente las pinzas, para eliminar el exceso de líquido. Coloque suavemente el cubreobjeto boca abajo sobre la gota e incube los cubreobjetosEn la oscuridad durante 1 h a TA.
  11. Utilice pinzas para colocar el cubreobjetos de nuevo en las placas de 24 pocillos llenos de 1 ml de PBS fresco. Asegúrese de que el cubreobjetos esté completamente cubierto por el PBS. Lave las células 3 veces con agitación suave durante 5 minutos cada una.
    NOTA: Mantenga la placa durante los lavados bajo una cubierta para protegerla de la luz ya que los fluoróforos del anticuerpo secundario son sensibles a la luz.
  12. Sumergir brevemente el cubreobjetos en agua desionizada para quitar la sal, secar con un paño seco del borde sobre un tejido y montar el cubreobjetos sobre 5 μl de medio de montaje de fluorescencia en un portaobjetos de vidrio. Selle el cubreobjetos antes de hacer imágenes usando esmalte de uñas. Mantenga los portaobjetos a 4 ° C para el corto plazo (semana) oa -20 ° C para el almacenamiento a largo plazo (mes).
    NOTA: Evite las burbujas de aire al sellar, ya que esto dañará la calidad de la imagen.

5. Imágenes de fluorescencia

NOTA: Consulte el manual del usuario del microscopio para optimizar la configuración.

  1. Adquirir imágenes usando un microscopio confocal usando una lente de inmersión de aceite 40 o 63X. Seleccione los canales fluorescentes deseados para la adquisición de imágenes. Cuando utilice varios canales fluorescentes, seleccione el modo de adquisición secuencial.
    NOTA: Comience con las muestras experimentales en las que se han inducido las SG con mayor fuerza para evitar la sobreexposición en las muestras posteriores. Asegúrese de no tener sobreexpuestos SGs a lo largo de toda la profundidad de la celda.
    1. Establezca un tamaño de bit de 12 o superior dentro de la configuración del microscopio para asegurar la precisión del análisis de la imagen.
    2. Establezca las pilas de imagen para cubrir toda la profundidad de la celda. Compruebe en los diferentes canales y para diferentes marcadores SG para asegurarse de que todo el rango está incluido. Establezca el comienzo de la pila en la base de las celdas y la parte superior de las pilas a la altura en la parte superior de las celdas donde no se observan más marcadores SG.
    3. Adquiera la pila. Mantenga la altura de la pila igual para todas las imágenes.
      NOTA: NoCambiar la configuración de adquisición entre el control y muestras experimentales que se utilizarán para la comparación posterior.

6. Análisis de imágenes

NOTA: Aquí se describe el análisis de SG en pilas colapsadas usando freeware ICY. El análisis de imágenes de reconstrucciones 3D también se puede hacer usando otro software especializado. La detección de SG puede realizarse a través de un flujo de trabajo totalmente automatizado establecido para este protocolo (disponible en http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imaging). Para usar este protocolo, los núcleos necesitan ser manchados con una mancha de ADN para que el software encuentre el centro de cada célula, y los bordes de la célula necesitan ser marcados por un marcador citoplasmático (como eIF3b) o tinción de actina para el software Para identificar los límites celulares. El flujo de trabajo automático se puede utilizar para validar manualmente los resultados derivados o directamente para el análisis cuando los límites de las células se detectan con alta confianza, lo que moDependen de la densidad de las células y del marcador utilizado para detectar los límites celulares.

  1. Con ImageJ o Fiji, contraiga las pilas de imágenes (Imagen> Pilas> Proyección Z) y guárdelas como archivos .tiff.
    NOTA: cree una nueva carpeta para cada imagen, ya que el software de análisis de imágenes vinculará sus resultados al sitio de la imagen original.
  2. Cargue una imagen control y experimental de .tiff en la plataforma de análisis de imágenes (Archivo> Abrir). Vaya a la ventana Secuencia. Desplácese hacia abajo en la "Tabla de búsqueda" a los parámetros del canal.
  3. Desactive todos los canales haciendo clic en la casilla de verificación de todas las pestañas del canal. Haga clic en el canal 0 y luego seleccione el color preferido haciendo clic en la barra de colores de arriba. Aumentar la intensidad del canal según sea necesario para ver todas las estructuras haciendo clic y moviendo la línea en el campo de intensidad. Repita esto para todos los canales.
    NOTA: Desactive los canales que no son necesarios para una tarea determinada para minimizar el sesgo en el análisis de la muestra.
  4. VolutaY dentro de la pestaña Canvas, realice un zoom de aproximadamente 10 celdas por campo ajustando la pestaña de zoom.
  5. Utilice las herramientas de funciones de polígono (en la barra superior) para delinear los límites celulares de las celdas de la imagen. Use la mancha de actina o un marcador citosólico para delinear los límites celulares ( por ejemplo, eIF3b).
    1. Haga clic en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI". Comience a delinear haciendo clic en la celda y luego extender la línea haciendo anclas a través de clics repetidos alrededor del límite de la celda. Para finalizar un ROI, haga clic de nuevo en la función de polígono dentro de las herramientas "Archivo & ROI".
      NOTA: Identifique las subpoblaciones de las células delimitadas infectadas. La muestra consiste en una mezcla de células infectadas y no infectadas. Para identificar bacterias, utilice la tinción DAPI o bacterias fluorescentes (como las bacterias que expresan GFP). Aumentar la intensidad para asegurar que todas las bacterias se ven.
    2. Para nombrar un ROI, vaya a la ventana ROI a la derecha y cliCk en la celda de interés en la imagen. Esto resaltará el ROI correspondiente en la pestaña ROI. Haga doble clic en el nombre del ROI y modifique el nombre ( por ejemplo, celda infectada # 1).
      NOTA: Si una imagen debe usarse para analizar células infectadas y no infectadas, es más fácil guardar la imagen en dos carpetas separadas y delinear las células infectadas y no infectadas por separado, generando dos hojas de cálculo diferentes, lo que facilitará el análisis. luego.
  6. Abra la aplicación del detector de puntos en la pestaña "Detección y seguimiento" (barra superior). Dentro de la ficha Entrada, se seleccionará la imagen actual. No cambie nada. En la ficha Preprocesamiento, seleccione el canal que desea analizar.
    NOTA: Sólo se puede analizar un canal en un momento dado. Se puede seleccionar aquí un análisis por lotes si se utiliza la secuencia de análisis completamente automatizada cuyos parámetros se han comprobado para dar resultados satisfactorios.
    1. En la pestaña Detector, seleccione "DeTect las manchas brillantes sobre el fondo oscuro. "Luego seleccione la escala apropiada y la sensibilidad.Por favor, pruebe diferentes configuraciones y la detección cruzada de puntos en el control y las muestras experimentales.
      NOTA: Para una imagen con una resolución de 2,048 x 2,048 y un tamaño de píxel de 0,12 μm 2 , un umbral de nivel 2 con una sensibilidad de 25 a 100 es generalmente apropiado, pero cada marcador de SG tiene que ser probado empíricamente. Configure la detección de manchas para que en la muestra de control no tratada no se detecten manchas, mientras que en la muestra experimental con SGs se cuentan todas las SGs pequeñas y grandes.
    2. En la pestaña ROI, seleccione el ROI de secuencia sugerido. En la ficha Filtrado, seleccione Sin filtrado. En la ficha Salida, elija la salida adecuada.
      NOTA: Elegir Activar archivo específico es útil para guardar diferentes condiciones de detección o canales diferentes. Seleccionar para exportar la imagen binaria y la imagen original con ROIs y detección es helPful para el análisis de control de calidad.
    3. Seleccione "Eliminar puntos anteriores mostrados como ROI". Elija la carpeta para guardar el archivo haciendo clic en el botón "ningún archivo seleccionado". En la ficha Pantalla, seleccione las opciones deseadas. Haga clic en "Iniciar detección".
      NOTA: Se creará una carpeta con el nombre y la ubicación elegida que contiene las opciones de imágenes exportadas. Estas imágenes se sobrescribirán para cada nueva condición probada. Para guardar las imágenes, cambie el nombre de la carpeta para que se cree una nueva carpeta o transfiera las imágenes de la carpeta de guardar a una nueva carpeta. Para el control de calidad de las imágenes, es útil seleccionar la marca de detección de la pantalla, el número de detección de ROI y el número de ROI y el nombre.
  7. Consolide y guarde los datos para los diferentes parámetros usando la hoja de cálculo generada para cada imagen o condición probada.
    NOTA: Los parámetros a analizar incluyen el número de SG por ROI, las áreas de superficie SG y el SG maxIntensidad media y mínima.
  8. Transferir los datos y analizar utilizando un programa de análisis capaz de analizar, representar gráficamente y determinar la significación estadística.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Para explicar y demostrar el protocolo descrito en este manuscrito, se caracterizó la imagen de clotrimazole inducida SGs en células HeLa infectadas o no con el patógeno citosólico S. flexneri . Un esquema del procedimiento se presenta en la Figura 1 , e incluye virulenta y avirulenta S. flexneri rayado en placas de Congo Rojo, preparación de bacterias, infección, adición de estrés ambiental, fijación de muestras y tinción, imagen de muestr...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El protocolo descrito aquí describe la inducción, localización y análisis de SGs en células no infectadas y células infectadas con el patógeno citosólico S. flexneri en presencia o ausencia de estrés exógeno. Usando software de imagen libre, los protocolos permiten el análisis cualitativo y cuantitativo preciso de la formación de SG para identificar y tratar estadísticamente las diferencias en fenotipos dados.

Hay varios pasos críticos dentro del protocolo para la infección, SG-indu...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

PS es un ganador de la Bill y Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV recibió el apoyo de una beca de Postdoc Mobility de la Fundación Nacional de Ciencia de Suiza y una beca postdoctoral Roux-Cantarini. PJS es compatible con una subvención HHMI y ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
eIF3b fuerte (N20), origen cabra Santa Cruzsc-16377Marcador SG robusto y ampliamente utilizado. La tinción citosólica permite la delineación celular. Dilución 1:300
eIF3b (A20), origen cabra Santa Cruzsc-16378Mismo objetivo que eIF3b (N20) y en nuestras manos era idéntico al eIF3b (N20). Dilución 1:300
eIF3A (D51F4), origen conejo (MC: monoclonal)Señalización Celular3411Parte del complejo multiproteico eIF3 con eIF3b. Dilución 1:800
eIF4AI, origen cabra Santa Cruzsc-14211Recomendado por (Ref # 13). Dilución 1:200
eIF4B, origen conejoAbcamab186856Buen marcador de gránulos de estrés en nuestras manos. Dilución 1:300
eIF4B, origen conejoCell Signaling3592Recomendado por Ref # 13. Dilución 1:100
eIF4G, origenconejo Santa Cruzsc-11373Marcador SG ampliamente utilizado. (Ref # 13): puede que no funcione bien en líneas celulares de ratón. Dilución 1:300
G3BP1, origen conejo (MC: monoclonal)BD Biosciences611126Marcador de SG ampliamente utilizado. Dilución 1:300
Tia-1, origen cabra Santa Cruzsc-1751Marcador SG ampliamente utilizado. También se puede encontrar en cuerpos P cuando SG están presentes (Ref # 13). Dilución 1:300
Anticuerpos secundarios conjugados con Alexa
A488 anti-cabra, origen burroThermo FisherA-11055Cross absorbed. Dilución 1:500
A568 anti-cabra, origen burroThermo FisherA-11057De absorción cruzada. Dilución 1:500
A488 anti-ratón, origen burroThermo FisherA-21202Dilución 1:500
A568 anti-ratón, origen burroThermo FisherA10037Dilución 1:500
A647 anti-ratón, origen burroThermo FisherA31571Dilución 1:500
A488 anti-conejo, origen burroThermo FisherA-21206Dilución 1:500
A568 anti-conejo, origen burroThermo FisherA10042Dilución 1:500
Otros reactivos
Shigella flexneriDisponible en varios laboratorios bajo pedido
Caldo de triptona caseína de soja (TCS)BD Biosciences211825Medio de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano
Agar TCSBD Biosciences236950Agar de crecimiento estándar para Shigella, aplicación - crecimiento bacteriano
Congo rojo SERVAElectrophoresis GmbH27215.01Herramienta de descortezación para Shigell que han perdido el plásmido de virulencia, aplicación - crecimiento bacteriano
Poly-L-Lisina (PLL)Sigma-AldrichP1274Útil para recubrir bacterias para aumentar la infección, aplicación - infección
GentamicinaSigma-AldrichG1397Muerte selectiva de bacterias extracelulares pero no citosólicas, aplicación - infección
HEPESLife Technologies15630-056Tampón de PH útil cuando las células se incuban en RT, aplicación - cultivo celular
Medio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM)Life Technologies31885Medio de cultivo estándar para células HeLa, aplicación - cultivo celular
Suero fetal de ternero (FCS)BiowestS1810-100Suplementación al 5% utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular
Aminoácidos no esenciales (NEAA)Life Technologies11140dilución 1:100 utilizada para el medio de cultivo celular HeLa, aplicación - cultivo celular
DMSOSigma-AldrichD2650Diluyente de reactivo, aplicación - cultivo celular
Arsenitode sodioSigma-AldrichS7400Potente inductor de gránulos de estrés (Nota: altamente tóxico, se requiere un manejo y eliminación especiales), aplicación - inductor de estrés
ClotrimazolSigma-AldrichC6019Potente inductor de gránulos de estrés (Nota: peligro para la salud, se requiere manejo y eliminación especiales), aplicación - inductor
de estrés Paraformaldehído (PFAElectron Microscopy Scences15714El PFA al 4% se utiliza para la fijación estándar de células, aplicación - fijación
Triton X-100Sigma-AldrichT8787Se utiliza al 0,03% para la permeabilización de las células huésped antes de la tinción inmunofluorescente, aplicación - permeabilización
A647-faloidinaThermo FisherA22287La dilución es a 1:40, se añade mejor durante la tinción secundaria de anticuerpos, aplicación - tinción
DAPISigma-AldrichD9542Tinción de ácido nucleido utilizada para visualizar tanto el núcleo del huésped como las bacterias, aplicación - tinción
ParafilmSigma-AldrichBR701501Película de parafina útil para la tinción inmunofluorescente de cubreobjetos, aplicación - tinción
Prolong GoldThermo Fisher36930Medio de montaje robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje
MowiolSigma-Aldrich81381Medio de montaje barato y robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje
placa de cultivo celular de 24 pocillosSigma-AldrichCLS3527Placas de cultivo de tejidos estándar, aplicación - cultivo celular
12 mm  cubreobjetos de vidrioNeuVitro1001/12Soporte de cultivo celular para aplicaciones de inmunofluorescencia, aplicación -
pinzaSigma-Aldrich81381Medio de montaje barato y robusto que funciona bien para la mayoría de los fluoróforos, aplicación - montaje
/fuerte>
pruebas estadísticas, aplicación - análisis de datos
adquisición
ImarisBitplaneProfessional programa de análisis de imágenes, aplicación - análisis de datos
ExcelMicrosoftPrograma de análisis y gráficos de datos, aplicación - análisis de datos
de soporte celular Prisma Software GraphPad Programa de análisis de datos y gráficos con sólidas opciones de Leica SP5 Leica Microsystems Microsonda confocal, aplicación - imagen

Referencias

  1. Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
  2. Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
  3. Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
  4. Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
  5. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  6. Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, Pt 16 3227-3234 (2002).
  7. Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
  8. Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
  9. Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
  10. Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788(2013).
  11. Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
  12. Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
  13. Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
  14. Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Solicitar permiso para reutilizar el texto o las figuras de este artículo de JoVE

Solicitar permiso

Etiquetas

Microscop a confocaldetector de puntosmarcador G3BP1marcador EIF3Bc lulas HeLaShigella flexnerian lisis de im genes

Artículos relacionados