Summary
레이저는 자주 DNA 손상에 대한 세포 반응의 연구에 사용된다. 그러나, 이들은 그 공간, 주파수 및 복제 충돌 포크 거의없는 것을 특징으로 병변을 생성한다. 여기서, 우리는 레이저의 국소 interstrand 가교 이러한 매개 변수의 결정을 가능하게하는 방법을 설명한다.
Abstract
한 DNA 손상 반응 (DDR)는 광범위 생균 마이크로 레이저 빔 조사에 의해 유도 된 이중 가닥 나누기 (DSBs)의 연구에있어서되었다. 동독은 interstrand DNA에 크로스 링크 (ICLS)를 포함하여 DNA의 공유 개조를 왜곡하는 나선뿐만 아니라, 정의되지 않는다. 우리는 살아있는 세포의 핵에, immunotagged psoralens의 레이저 photoactivation 현지화 ICLS에 의해 자극 DDR을 공부했다. 부가 배포 및 복제 포크의 만남에 대한 근본적인 문제를 해결하기 위해, 우리는 두 개의 다른 기술과 레이저 현지화를 결합했다. DNA 섬유는 종종 짧은 펄스 중에 혼입 클레오 사이드 유사체의 면역에 의한 복제 포크의 진행을 표시하기 위해 사용된다. Immunoquantum 점은 널리 단일 분자 이미징을 위해 사용되어왔다. 새로운 방식으로, 레이저 국소 ICLS 운반 세포로부터 DNA 섬유 현미경 슬라이드 상에 확산된다. 태그가 달린 ICLS는 immunoquantum 점 및 일 함께 표시됩니다E 간 거리 병변 결정. ICLS와 복제 포크의 충돌이 가시화 될 수 있으며, 다른 만남 패턴 확인 및 정량.
Introduction
DNA는 또한,도 산화 적 대사에 의해 생성 된 내인성 라디칼 종에 의해 공격 등의 방사선, 자외선, 환경 독소, 연소 생성물과 같은 외래 에이전트로부터 일정한 공격을 받고있다. 이 모든 화학적 또는 물리적으로 DNA 1의 무결성을 방해 할 수있는 잠재력을 가지고있다. 게놈의 교란은 병변 수리에 관여하는 단백질과 마이크로 RNA하지 않을 경우 수천, 수백와 DNA 손상 응답 (DDR), 모집 및 사후 번역 수정 캐스케이드를 활성화 할 수 있습니다, 세포주기, 세포 사멸, 노화 및 염증 경로의 조절 2.
동독에 대한 우리의 정보의 대부분은 DSBs와 연구에서 비롯됩니다. 이는 3 살아있는 세포 게놈 DNA에서 서열 특이 나누기 포함 나누기를 도입하기위한 기술의 유용성에 큰 부분이다. 또한, propensit중단의 예는 면역에 의해 표시 될 수 DDR 단백질의 초점을 유도하는 단계, 및 반응 속도론 단백질의 요구를 식별하는 매우 유용하고있다. 동독 연구를위한 핵심 기술 중 하나는 살아있는 세포 4의 핵에 '관심 지역'에 DSBs의 스트라이프를 직접 (ROI)을 레이저 빔을 사용 보너와 동료에 의해 소개되었다. 실제로, 그들은 DDR의 단백질이 면역 식별 할 수있는 긴 초점을 만들었습니다. 이것은 레이저 노출 된 세포에서 인산화 된 히스톤 H2AX의 강한 스트라이프 (γ-H2AX) 그들의 증명에 의해 설명되었다. 이후 레이저 DSBs 접근법에 의해 유도되는 DDR의 다양한 연구에 이용되어왔다. 강력하고 인기 극적인 면역 형광 이미지의 소스 있지만,이 병변의 정체성에 대한 걱정없이, 관찰 결과를하기 위해 대부분의 실험에서 레이저 강도를 조절 주목해야한다밀도, 또는 간격. 사실, 이러한 추정을하기 어려울 수 있습니다. 따라서 그들은 주로 레이저 (5)에 의해 DNA에 도입 병변의 다양성에도 불구하고, 무시됩니다. 이 문헌 6에있는 많은 모순에 기여한다.
DSBs는 대조적으로, 대부분의 DNA의 화학적 변형은 DDR 단백질 이산 초점의 형성을 자극하지 않는다. 이 병변 주파수의 우리의 현재 이해의 관점에서 중요하다. 인간 배양 세포는 S 단계 7, 8, 9 중 주로 형성된 세포주기 당 50 개 DSBs을 초래한다는 것이 추정된다. 적은 비 증식 세포에서 형성된다. 이것은 세포 / 1 일, 10 당 수만에있는 핵산 염기 손실 또는 수정 이벤트의 수와 대조를 이룬다. 따라서, 우리는 가장에 대해 알고비교적 드문 및 집계에서 훨씬 더 일반적이다 나선 왜곡 병변에 의해 유도 된 사람들에 대해 많은 작은 사건에 의해 유도 된 DDR.
게놈 DNA의 수정을 공유 결합하는 세포 반응에 대한 질문을 해결하기 위해, 우리는 고유의 DDR 유도 활동을했다 나선 왜곡 DNA 부가 물로 작업하고 싶었다. 또한, 실험 설계를 용이하게하고 해석 우리는 누구의 소개 시간에 대한 제어 및 시각화 의무가 있었다 될 수있는 구조에 관심이 있습니다. 따라서, 우리는 소 랄렌에 기초한 전략을 개발했다. 현장에서 : Psoralens 잘 5 'TA를 선호 광활성 DNA에 인터 칼을 특징으로한다. 질소 머스타드 및 마이 토마 이신 C (MMC)들은 장파장 UV (UVA) 광에 노출하지 않는 DNA 반응성 아닌 다른 가교제 달리. 인터 분자 나선 왜곡 interstrand 가교 결합을 생성하기 위해 반대 가닥의 티민 염기 (ICLS 반응) 11. 실험에 사용 된 트리메틸 랄렌 대부분의 제품은 형성되어 있지 않은 비교적 적은 monoadducts가 (10 % 미만) 생성 ICLS, 12, 한 가닥에 인접 염기 간의 intrastrand 가교이다. 그들은 시스 백금과 MMC 등의 복제와 전사, 소 랄렌 등의 가교제, 강력한 블록이기 때문에, 일반적으로 화학 요법에 사용됩니다. 따라서 랄렌 나선 구조의 왜곡으로 DDR의 활성화에 따라, 또한 임상 적 중요성이있는 화합물에 대한 세포 반응에 대한 통찰력을 제공 연구 할 수 있었다.
우리는 트리메틸 랄렌 (파기)를 디곡시 제닌에 링크시킨 시약을 합성 식물성 스테롤은 포유 동물 세포에서 발견 자주 immunotag으로 사용되지. photoactivation 대한 요구는 살아있는 세포의 핵에서 정의 된 ROI에 랄렌 ICLS의 레이저 광 (365 ㎚)으로 현지화를 허용한다. 이들은 IMM를 표시 할 수 있습니다발굴 태그에 대한 unofluorescence. DNA 수리 및 DDR 단백질 ICLS 13, 14 국소 레이저 스트라이프 나타났다.
DSBs을 생산하는 데 사용 높은 레이저 강도에 의해 활성화 된 DDR 절연 또는 클러스터 손상 15, 16 때문일 수 있습니다. 따라서,이 실험 결과의 관련성 자연스럽게 병변 본 훨씬 낮은 농도로 발생하는 불확실하다. DNA의 소 랄렌 부가 주파수 및 간격에 대해 비슷한 질문을 해결하기 위해, 우리는 DNA 섬유 기술 17 immunoquantum 점을 이용했다. 양자점은 형광 염료보다 훨씬 더 밝은 빛에 노출 표백되지 않는다. 따라서 이들은 종종 단일 분자 이미징 (18)에 사용되는, 애플리케이션되는 형광 염료는 충분히 밝다. 개별 DNA 섬유 g에서 신장 될 수있다아가씨 슬라이드는 수확 셀에 앞서 배양 중에 혼입 클레오 사이드 유사체에 대해 면역 형광에 의해 표시 될 수있다. 우리는 땅을 파고 - 소 랄렌과 세포 치료 및 레이저 마이크로 조사에 대한 투자 수익 (ROI)을 노출. 섬유는 immunoquantum 점으로 가시화 될 수있는 셀의 개별 파기 랄렌 - 부가 물로부터 제조되었다. 상대적으로 짧은 시간 (20~60 분)에 대한 뉴 클레오 시드 유사체를 위해 세포를 노출시키는 레이저 국소 ICLS 근방 복제 책자의 표시를 허용한다.
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Protocol
파기 TMP-1의 제조
- 50 mg의 (0.18 밀리몰) 8- trimethylpsoralen 4'- 클로로 -4,5- '및 건식 25 ㎖ 둥근 590 mg의 (2.7 밀리몰) 4,7,10- 트리 옥사 1,13-tridecanedi 아민의 믹스 질소하에 플라스크 -bottom. 12 시간 동안 톨루엔 10ml를 첨가하고 환류를 추가한다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다.
- 실리카겔상에서 플래시 칼럼 크로마토 그래피시킴으로써 잔류 물을 정제 하였다. (1 : 0.5 ~ 9), 클로로포름, 메탄올, 28 % 암모니아 용액으로 컬럼을 용출시켰다. 감압 하 회전 증발기에서 용매를 증발시키고, 회복 순수 -4 '- [N- (13- 아미노 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 메틸 4,5', 8- trimethylpsoralen 점성의 담황색 액체.
- 4 5.5 밀리그램 (0.012 밀리몰)을 혼합 '- [N-를 (13- 아미노 - 4,7,10- trioxatrideca)] 아미노 -4,5-'디곡 NHS 에스테르 5 ㎎ (0.008 밀리몰)의 8-trimethylpsoralen 질소하에 무수 환저 플라스크. 0.5 mL의 무수 디메틸 포름 아미드를 추가 (DMF)를디 트리메틸 3.4 μL와 18 시간 동안 50 ℃에서 교반 하였다.
- 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다.
- 디클로로 메탄 최소량 잔사를 용해. 가로 정지상으로서 실리카겔 분취 박층 판의 하단에 2 μL 스폿의 용액을 적용한다. 메탄올 : 클로로포름에 취용 TLC를 실행하여, 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1).
- 수직 에지를 제외한 판 마스크 단파장 UV 254 nm의 램프 제품의 대역을 식별한다. 주걱 플레이트로부터 생성물을 긁어 클로로포름하여 순수한 생성물을 분리 : 메탄올 : 28 % 수산화 암모늄 (8 : 1 : 0.1) 혼합물.
- 감압 하 회전 증발기에서 용매를 제거한다. 50 % EtOH로 1 mL의 잔류 펠렛을 녹이고 : H 2 O, 모든 용매 (~ 3 시간), 증발 될 때까지 원심 증발기에 1.5 ㎖의 튜브 (~ 20 개 씩) 건조 50 μL 분취 액으로 분배.
- 원심 증발기에서 다시 H 2 O 건조 : 50 %의 EtOH 200 μL의 각 분취 액을 재용. 50 %의 EtOH에 200 μL 분취를 각각 다시 녹이고 : H 2 O, 장기 저장을 위해 -20 ℃에서 원심 증발기 저장 펠렛 건조.
- H 2 O가 1 준비 : H 2 O에 녹인 파기 TMP-100 희석하고 250 nm에서 OD를 측정하는 용도의 경우, 50 %의 EtOH 50 μL의 펠릿을 용해. 파기-TMP의 흡광 계수는 25000이다. -20 ° C에 저장하는 경우이 솔루션은 약 한 달 동안 안정하다. 각각의 사용 이전에 250 nm에서의 OD를 측정하여 농도를 확인한다.
- 스톡 농도를 계산 : ABS × 100 X10 (μM)에서 6 / 25,000 = 농도. 일반적으로 원액은 약 3 mm이다. 이 배지에 첨가의 EtOH 부피를 최소화하기 위해이 범위 인 것이 중요하다.
2. 레이저 지역화 파고-TMP ICLS
- 체육SRS 질소 레이저 (337 ㎚)와 공 초점 현미경 rform 레이저 제이션 365 nm의 라인 발광 0.7 NW의 파워로, 10 Hz에서 3 개 ns의 펄스를 발사 염료 셀을 통해 펌핑.
- 35 밀리미터 유리의면에 수직 마크를 확인은 마킹 펜으로 세포 배양 접시를 바닥. 다이아몬드 펜 배양 표면에 유리의 중앙에서 교차 스크래치 등 접시 측의 블랙 스트라이프를 크로스 한 팔의 상단에있다. 이것은 상기 셀들이 동일한 초점 평면에있을 수 있도록 교차는 유리의 성장 표면 상에 표시된다.
- 70 %의 EtOH 린스와 함께 마킹 후에 멸균 접시. 세포를 도금하기 전에 건조.
- 십자가에서 플레이트 세포 (예 : 헬라 또는 U2OS 표준 실험실 균주)은 하나 또는 두 개의 일전 문화 요리를 표시했다. 셀 적극적으로 나누어 실험 당일 50-70% 합류한다. 균일 라벨 DNA 1 μM 5- 클로로 -2- 데 옥시 우리 딘 (CldU)로 24 시간 동안 인큐베이션.
- 더하다50 % EtOH를 발굴-TMP : 20 μM의 최종 농도까지 세포 배양 배지에 H 2 O. 37 ℃로 매체를 준비한다. 배양기에서 세포 도처 변경 매체 (37 ° C를 5 % CO 2) 30 분 발굴-TMP가 평형을 허용 할.
- 세포가 배양하는 동안, 레이저 활성 인 시야의 X / Y 좌표를 확립한다. 레이저는 수평 및 대각선을 따라 미러 슬라이드 유리를 에칭하기 위해 소프트웨어에 의해 지시 된 제조자의 보정 절차를 수행. 두 라인은 레이저가 표적을 공격 할 수있는 필드의 경계를 정의합니다.
- 현미경 스테이지 제어 CO 2 및 습도와 37 ℃의 환경 챔버 내의 플레이트를 놓고, 십자가의 교차점에 오일 60X 대물 포커스.
- 소프트웨어의 형상 도구 연구자에 의해 설립 된 ROI에 365 nm의 레이저 빔을 지향, 3의 스트라이프를 형성# 181 0.6 μm의 MX. 투자 수익 (ROI)의 개요는 십자가의 교차로 바로 근처에있는 세포의 핵에 커서가 배치됩니다. 핵을 통해 레이저 중도를 타겟팅 Z 초점 평면을 조정한다. 350-370 nm 범위의 레이저를 사용합니다. 405 nm의 레이저는 크로스 링크 (19)를 유도 할 수 없다.
참고 : 우리는 미분 간섭 대비 (DIC) 이미징 핵질 구별 할 수있는 핵소체, 외부 nucleoplasmic 분야에서 투자 수익 (ROI)을 찾습니다. - 셀 (셀 어둡게 한 후 사라진다) 말살 충분한 레벨로 전력 설정을 증가시켜 레이저의 초점과 활동을 확인한다. 이 현미경을 통해 다음 coverslip을 통해 세포에 레이저에 대한 방해받지 않고 빛의 경로에 대한 중요한 진단이다.
- 소 랄렌과 ICL 유도 DDR (이 각 레이저 / 마이크에 대한 경험적으로 결정되어야합니다 활성화에가 충분한 전원 설정을 낮 춥니 다roscope 조합). (γ-H2AX의 형성에 의해 모니터링) 소 랄렌의 부재에 DDR을 활성화하지 않는 레이저 강도 설정 (현재 1.7 %)를 사용합니다.
주 :이 중요한 결정하고 레이저 광원 또는 광 경로의 구성 요소가 변경되는 경우의 설정 조정이 필요할 수있다. GFP 축적이 레이저 랄렌 줄무늬 그러한 빠르게 (초) 모집 둘 또는 XPC FAN1 같은 복구 단백질 태그 따르되 형 레이저에 노출 ROI하지. 몇 분은 다른 사람을 위해 필요할 수 있습니다 동안 DDR의 일부 단백질, 초 이내에 나타납니다. 관심 각각의 단백질을 시간 코스 결정을 수행하는 것이 필요하다. 우리는 또한 레이저에 노출되지 않은 세포에서 응답 단백질의 더 줄무늬가 없음을 확인합니다.
- 소 랄렌과 ICL 유도 DDR (이 각 레이저 / 마이크에 대한 경험적으로 결정되어야합니다 활성화에가 충분한 전원 설정을 낮 춥니 다roscope 조합). (γ-H2AX의 형성에 의해 모니터링) 소 랄렌의 부재에 DDR을 활성화하지 않는 레이저 강도 설정 (현재 1.7 %)를 사용합니다.
- 필드에있는 모든 세포는 십자가의 교차로에 가까운 체류, 이동에 새로운 필드 플레이트를 대상으로 한 후.
- 실험에서 determ하도록 설계병변 간 거리의 분포가 교차 20-25 필드 (4-5 세포 / 필드)에 레이저에 세포를 노출 Ine입니다. 지역화 ICLS 근방에 복제 패턴을 분석하기 위해 레이저 발사 후 10 μM 5- 요오도 -2- 데 옥시 우리 딘 (IDU)와 함께 세포를 배양한다.
참고 : IDU와 배양 시간은 다소 임의적이다. 우리는 20 분으로 짧고 긴 60 분 (아래 참조)로 사용 하였다. 긴 펄스 (몇 시간)는 종종 이렇게 이미지에 단일 포크의 진행을 수있는 기회를 잃고, 유착 여러 복제 책자 초래한다. 일부 실험에서, CES는 복제 소책자 펄스 라벨링 하였다 파기-TMP에 노출하기 전에 라벨 DNA로 균일를 24 시간 동안 CldU으로 표시된다.
3. 세포 수확 및 DNA 섬유의 연신
- 스테이지에서 플레이트를 제거하고 배지를 제거하고 인산 완충 식염수 (PBS)로 세척한다. PBS를 솔루션을 제거합니다. 상업 트립신의 10 μL 드롭 배치/ 유리 표면의 중앙에서의 교차의 교차점에 EDTA 용액.
- 실온 (RT)에서 3-4 분 동안 인큐베이션 한 후 피펫 팁으로 분리 된 세포를 트립신 용액을 그린다. 트립신을 중화 할 필요가 없습니다.
- 실란 처리 유리 현미경 슬라이드의 일단의 세포를 트립신 / EDTA의 드롭을 배치. 를 Lyse 균체 및 건조 할 수있는 풀의 주변부를 허용 0.5 % SDS 용액 10 μL를 첨가하여 DNA를 분리하고, 피펫 끝으로 부드럽게 혼합을 실온에서 3-4 분 동안 배양한다.
- 슬라이드를 기울 20º 액체가 아래로 끝까지 실행할 수 있습니다. DNA는 섬유를 흐르는 액체의 유체 역학적 힘에 의해 연신 / 확장된다. 프레젠테이션 건조 공기 (~ 10 분)하자 3 FIX : 10 분 동안 1 메탄올 / 아세트산. 다시 수정 솔루션 및 건조 공기에서 슬라이드를 제거합니다. 이때 이들은 -20 ° C에서 70 %의 EtOH에 무기한 저장 될 수있다. 70 %의 EtOH로에서 제거에 NE 전에 공기 건조하도록 허용XT 단계.
- PBS에서 슬라이드를 세척 한 후 실온에서 1 시간 동안 2.5 M 염산으로 변성. 이 치료는 DNA 항체에 통합 된 할로겐화 핵산 염기 액세스 할 수 있도록 depurinates.
- 0.4 M 트리스 -HCl, pH 7.4의 슬라이드 중화. PBS로 두 번 씻어 / 0.5 % 트윈 20 (PBST)을 5 분마다.
- 블록 PBS에 5 % 소 혈청 알부민 (BSA)와 10 %의 염소 혈청 슬라이드. 슬라이드 고르게 블로킹 용액을 확산하고 RT에서 1 시간 동안 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버.
- 1 μL 피펫 100 : 마우스 항 - 브로 모데 옥시 우리 딘의 차단 용액 200 희석 각 슬라이드에 1 차 항체 (특히 CldU를 검출한다). RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에 슬라이드 위에 고르게 희석 확산 배양하는 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버. 파라 필름을 제거하고 5 분마다 슬라이드를 PBST에 세 번 씻는다.
- 각 슬라이드 차단 용액에 (100 1) 염소 항 - 쥐 알렉사 형석 647 희석의 100 μL 피펫. 커버파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 및 RT에서 45 분 동안 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오.
- 200 : 희석 (1시 40분) 마우스 항 브로 모데 옥시 우리 딘의 피펫 100 μL 일차 항체 및 토끼 항 DIG 항체 (1 (. LDU 및 CldU이 이중 특이성 래트 종래 배양에서 항 BrdU에 의해 CldU의 차단을 필요로 검출) ) 각 슬라이드 용액을 차단한다. 파라 필름으로 부드럽게 슬라이드 커버와 RT에서 1 시간 동안 습윤 챔버에서 배양한다. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오.
- 각 슬라이드 차단 용액에 염소 항 - 토끼 프로브 (예 Qdot 655) (: 100 1) 염소 항 - 마우스 알렉사 488 andc 형석 (5000 1) 희석의 100 μL 피펫. 부드럽게 파라 필름과 슬라이드를 덮고 실온에서 45 분 동안 품어. 5 분 각각의 슬라이드를 PBST 세 번 씻으십시오.
- 종이 타월로 여분의 PBST를 배출합니다. 각 슬라이드에 장착 antifade 매체의 50 μL를 추가하고, 커버 슬립으로 덮고. 이미지 또는 저장소-20 ° C에서 더 이상 48 이상의 시간.
형광 현미경 4. 섬유 이미징
- FITC, Cy5에 도트와 Q (655)와 연결된 감지 완전히 동력 필터 휠 거꾸로 현미경에 63X 대물 렌즈를 통해 이미지 획득을 수행한다. 상기 여기 필터는 425 ㎚이며, 배출 필터는 발광 피크 (20)를 중심으로 20 개 내지 655 ㎚이다.
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Representative Results
레이저 지역화 파고-TMP (그림 1A) ICLS는 소 랄렌에 연결 발굴 태그에 대한 면역 형광 표시 할 수 있습니다. 레이저 임의 형상의 영역에서 공격 지시 할 수 있지만, 줄무늬 세포 "자연"형상없고, 정당한 신호 용이 의한 일차 또는 이차 항체에 의한 비특이적 결합 아티팩트 구별 될 수있다. 완벽한 특이 이하의 항체를 사용하는 경우이 기능을 사용하면 도움이된다. 파기-TMP ICLS의 스트라이프의 DDR, γ-H2AX의 공지 된 마커의 예는도 1b에 도시된다.
발굴의 면역 형광은 부가의 빈도와 간격과 같은 결론을 허용하지 않습니다 레이저 스트라이프 병변 태그. 확인하기 위해이 판정 세포 전에 ICLS 도입로 24 시간 동안 배양 하였다 CldU. 제 대하여 염색E CldU는 파기의 시각화가 장 섬유에 병변 태그 허용 및 DAPI (4 ', 6-diamidino -2- 페닐 인돌) 또는 YOYO {1,1'직접적인 얼룩보다 명확 섬유 패턴을 수득 - (4,4,8 8- 테트라 메틸 4,8- diazaundecamethylene)는 [4 - [(3- 메틸 벤조 -1,3- 옥사 졸 -2- 일) 메틸 리덴] -1,6- -4- dihydroquinolinium 비스 요오드화}. 레이저 photoactivation에 의해 ICLS의 도입 후, 섬유는 표적 세포에서 확산되었다. 예컨대도 2에 도시 된 것과 같은 섬유의 파기 신호의 분석은 최근의 발행 (21)에 기재된 층간 ICL 거리가보다 큰 160킬로바이트 미만 10킬로바이트로부터 원거리 것으로 나타났다. 클러스터 부가 물에 대한 증거는 없었다. 따라서, 파기 태그 및 스트라이프의 DDR 단백질의 축적의 스트라이프는 확장 DNA 따라 측정 적어도 잘 분리 병변의 존재를 반영. 6으로, 뉴 클레오 배열 형성된 ICLS 경우 셀룰러 염색질의 관점에서 고려확장 DNA 길이 압축 골절, 그들은 여전히 DNA의 약 1.6 KB의 등가물에 의해 분리된다.
레이저에 의한 DNA 손상을 갖춘 실험은 일반적으로 DDR의 유도를 따르십시오. 이 실험은 거의 DNA 복제에 관한 질문과 관련되지 않습니다. 반면에, DNA 섬유 분석은 일반적으로 복제 연구에 사용됩니다. 이들 DNA에 혼입 할로겐화 된 뉴 클레오 시드 유사체 결과의 짧은 펄스에 세포를 노출. DNA 섬유의 면역 형광 분석은 최근 DNA 합성을 나타내는 통합 유사체의 책자를 보여준다. DNA 복제가 ICL 줄무늬 국소 레이저에서 발생한 경우 물어 관심, 그리고 만약 그렇다면, 무엇이 ICLS의 주변에 복제의 패턴 것입니까? 세포는 장 섬유의 표시를 용이하게하기 위해 CldU 24 시간 동안 배양 하였다. 레이저 국소 ICLS는 IDU의 1 H 펄스 다음 세포 내로 도입 하였다. DNA F ibers는 대상 세포에서 준비하고 발굴은 ICLS 및 표시 복제 책자 태그되었습니다. 결과는 소 랄렌의 레이저 활성화가 복제를 종료하거나 복제 패턴의 전체 주파수에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 우리는 최근 21에 도시 한 바와 같이 다수 1 : 복제 4에 양면 패턴 한쪽에 발생하고, 또한 ICLS 양쪽.
그림 1 : 레이저 지역화 파고-TMP ICLS의 세대. 파기 트리메틸 랄렌의 (A)의 구조. 레이저 국소 ICLS (적색 파기 등)를 포함하는 ROI의 γ-H2AX (녹색)의 (B) 축적. 핵은 DAPI (파란색)로 염색한다. 시야의 사진은 다이아몬드 펜에 의한 마크에 부분적으로 셀을 보여줍니다. 핵소체, 그 이외의 투자 수익 (ROI)의 배치를합니다.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 레이저 지역화 발굴-TMP 신호와 DNA 섬유. (A) 세포는 DNA 라벨을 CldU 24 시간 동안 배양 하였다. 이어서 레이저 국소 ICLS 도입하고, (B), 세포를 수확하여 섬유를 분산시켰다. (C, D)를 파기 신호가 immunoquantum 도트 (적색)과 면역 형광 (녹색)에 의해 CldU 표시 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
레이저 현지화 기술은 밝은 필드 현미경에서 볼 수 있습니다 핵에 부착 세포의 사용을 필요로한다. 우리는 리신 또는 콜라겐, 또는 더 복잡한 혼합물로서 세포 접착 제제로 유리 표면에, 예컨대 차 림프구 또는 AD293 느슨하게 접착 배양 된 세포와 같은 비 접착 성 세포를 부착하는 것을 시도했다. 이러한 치료는 표면에 세포를 결합 할 수 있지만, 우리는 그들이 일반적으로 매우 어려운 핵에 집중하고 둥근 머물 것을 찾을 수 있습니다. 또한, 세포들은 성장 배지를 제거한 후, 세척, 초기 생존하지 못한다. 그러나, 접착 세포에 대한 요구 사항 내에서, 우리는 성공적으로이 연구에 대한 표준 셀 라인의 다양한뿐만 아니라 일차 전지를 사용하고 있습니다. 마이코 플라스마 오염에 대한 세포를 테스트하는 데 유용합니다. 우리는 세포 반응은 이러한 감염에 의해 변경되는 것을 찾을 수 있습니다.
레이저의 초점면은 중요하다. 목표는이다핵 내에서 ICLS를 놓습니다. 너무 높은 및 photoactivation는 핵 위에있을 것이다; 너무 낮과는 유리에있을 것입니다. 우리는 유용 세포질과 핵의 교차점에있는 DIC 이미지의 초점을 선명하게 찾을 수 있습니다.
섬유 분석은 어려운 아니지만, 해석 분야가 회복되기 전에 연습을 필요로한다. 적절하게이 기술을 구현하는 것이 중요하다. 레이저 실험으로부터 회수 된 세포의 수는 적고 각각의 샘플은 하나의 슬라이드에서 전체적으로 사용된다. 샘플은 추후 분석을 위해 저장 씩으로 분할 할 수 없으므로 결과적으로는, 각 실험에서 수율을 극대화하는 것이 필수적이다. 그러나 수백 개의 이벤트는 하나의 샘플에서 복구 할 수 있습니다. 절차의 두 가지 기능은 중앙 중요하다. 하나는 슬라이드 아래로 세포 용 해물의 흐름의 속도입니다. 너무 빠른 경우, DNA의 많은 슬라이드를 실행합니다. 유리 슬라이드의 품질도 중요하다. 우리는 때때로 RECE효과가 많이 필자. 따라서 각각의 새로운 많은 사용하기 전에 테스트해야합니다.
등 상업 시약 - 항체, immunoquantum 점의 신뢰성이 모든 실험 조작 마찬가지이므로, 항상 관심사입니다. 이들은 항상 불안정하고 실험 실패는 일반적으로 하나 또는 다른 시약에 문제가 추적된다. immunoquantum 점은 특히 문제가 있고 하나 개 이상의 많은 허용 하나를 식별하기 위해 테스트해야 할 수 있습니다. 비효율적 많은 높은 배경 신호에 의해 표시됩니다. 다음은 섬유와 연관되지 않은 어떠한 DNA가없는 슬라이드의 지역에서 볼 수 있습니다.
그것이 보너 그룹 4에 의해 도입 된 이후 지방의 DNA 손상을 소개하는 레이저의 사용은 매우 인기를 끌고있다. 직접 DDR을 유도 할 수 있도록하는, 가장 이후의 실험에서 레이저 전원 설정이 설정됩니다. 우리는 충분히 낮은 SUC 설정 전원을 사용하고 있습니다동독의 활성화는 레이저와 소 랄렌 모두에 의존하는 시간. 상술 한 바와 같이, 소 랄렌 부가 물 사이의 분리는 우리가 개별 이벤트에 대한 응답을 찾고 있습니다 주장한다. 내생 가교제에 의해 형성된다 ICLS의 수를 알 수없는 동안, 우리는 그들이 6 ~ 8 시간 (게시되지 않은 데이터) 내에 소 랄렌 부가 물을 제거 할 수 있습니다로 소 랄렌 부가 물의 현지화, 세포를 죽일하지 않습니다 및 현재와 건강한 24 시간 이상이다. 따라서이 방법은 훨씬 덜 독성 핵과 미토콘드리아에 걸쳐 DNA 손상을 소개 에이전트에 노출을 요구 프로토콜에 비해 세포이다.
레이저 / 소 랄렌 조합은 DDR을 활성화 나선 왜곡 구조를 소개합니다. 이 점에서이 방법에서 얻은 결과는 ATM / DNAPK / ATR의 활성화에 이어 DDR 계단식 특성상 나선 왜곡 병변의 범위에 적용 할 수있는 22 키나아제.이와 관련하여 여기에 설명 된 DNA 섬유 방법은 형광 표시 할 수있는 면역 학적 또는 화학적 또는 생화학 적 수단에 의해 검출 될 수있는 임의의 DNA 구조로 확장 될 수있다. UV를 포함 할 수있는이 23 부피 알킬화제 (24), G 용 quadruplexes 25 및 산화 병변 5 감광 생성물.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
이 연구는 (Z01 AG000746-08)와 판 코니 빈혈 연구 기금을 노화에 국립 보건원, 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Digoxigenin NHS ester | Sigma-Aldrich | 11333054001 | |
| Chloro-psoralen | Berry and Associates | PS 5000 | |
| diaminoglycol | Sigma-Aldrich | 369519 | 4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine |
| Chloroform | Acros Organics | 423550040 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A4524 | |
| Ammonium solution | Sigma-Aldrich | 5002 | |
| TLC plates | Analtech, Inc. | P02511 | |
| Flass glass column 24/40, 100 mL | Chemglass Life Sciences | CG-1196-02 | |
| Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder | Perkin Elmer | With Volocity Software | |
| Micropoint Galvo | Andor Technologies | with a Nitrogen pulsed laser | |
| dye cell | Andor Technologies | MP-2250-2-365 | |
| 365 dye | Andor Technologies | MP-27-365-DYE | |
| IdU | Sigma-Aldrich | 17125 | |
| 35 mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10 mm glass diameter, uncoated | Matek | P35G-1.5-10-C | |
| microscope slides | New Comer Supply | Part # 5070 | New Silane Slides |
| Mouse anti BrdU antibody (IdU) | BD Biosciences | 347580 | 1 in 40 |
| Rat anti BrdU Antibody (CldU) | Abcam | ab6326 | 1 in 200 |
| Rabbit anti Dig antibody | ThermoFisher Scientific | 710019 | 1 in 200 |
| Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG | ThermoFisher Scientific | Q-11421MP | 1 in 5,000 |
| AF647- goat anti Rat IgG | Jackson Immunoresearch | 112-605-167 | 1 in 100 |
| AF488-goat anti mouse IgG | Jackson Immunoresearch | 115-545-166 | 1 in 100 |
| Zeiss epifluorescent microscope A200 | Zeiss | with Axiovision software | |
| Q-dot 655 filter | Chroma | 39107 |
References
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