Un grano emparejado y arreglo de imán para moldear los micropocillos con geometrías variables cóncavos

Las células cultivadas en forma de esferoide son más similares a real tejido en el cuerpo de un plano bidimensional de la cultura¹. Teniendo en cuenta esta ventaja, el uso de esferoides se ha adoptado para mejorar el estudio de la interacción de célula a célula^2,3, activación inmune⁴,⁵y⁶de la diferenciación de la detección de drogas. Además, esferoides con múltiples tipos de células se han aplicado recientemente a organoides (cerca de-fisiológico tridimensional (3D) el tejido), que son muy útiles para estudiar el desarrollo y la enfermedad humana⁷. Varios métodos se han utilizado para producir esferoides. El método más simple consiste en la utilización de una superficie no adhesiva, que las células se agregan entre sí y esferoides de forma. Un plato de Petri pueden tratarse con albúmina de suero bovino, pluronic F-127 o un polímero hidrofóbico (por ejemplo metacrilato de 2-hydroxyethl de poly) para hacer su superficie no adhesiva⁸⁹. El método de frasco de spinner es otra forma bien conocida de producir grandes cantidades de esferoides^10,11. En este método, las células se llevan a cabo en suspensión agitando para evitar de ser unido al sustrato. Por el contrario, la flotación células agregado esferoides de forma. El método superficie no adhesiva y el método de frasco de spinner pueden producir grandes cantidades de esferoides. Sin embargo, están sujetas a limitaciones incluyendo dificultades en controlar el tamaño del esferoide, así como el seguimiento y monitoreo de cada esferoide. Como un remedio para este tipo de problemas, otro método de producción del esferoide, a saber, el colgante gota método pueden ser empleados¹². Se trata de depositar las gotas de la suspensión de células en la parte inferior de la tapa de una placa de cultivo. Estas gotas son generalmente 15 a 30 μL en tamaño y contienen aproximadamente de 300 a 3000 células¹³. Cuando se invierte la tapa, las gotas se llevan a cabo en lugar por la tensión superficial. El ambiente de microgravedad en cada gota concentra en las células, que entonces forman esferoides solo en la interfase líquido aire libre. Los beneficios de colgar el método de caída son que ofrece una distribución de tamaño bien controlados, si bien es fácil de rastrear y monitorear cada esferoide, en relación con los métodos de matraz superficie y spinner no adhesiva. Sin embargo, este método tiene una desventaja en que la producción masiva de esferoides y el propio proceso de producción es excesivamente trabajo intensivo.

Un conjunto de micropocillo es un plano de la placa con muchos pozos de tamaño micro, cada uno con un diámetro que van desde 100 hasta 1000 μm. El principio de producción del esferoide cuando utilice micropocillos es similar a la del método de superficie no adhesiva. Los beneficios incluyen el hecho de que los micropocillos proporcionan espacios entre los micropocillos para separar las células o esferoides, que es fácil controlar el tamaño del esferoide, mientras que también hace fácil supervisar cada esferoide sola. Con un gran número de los micropocillos, producción de esferoide alto rendimiento también es posible. Otra ventaja de los micropocillos es la opción a los pozos de la forma de diferentes formas (hexaedros, cilíndricos, trigonal prismático) dependiendo de propósitos experimentales únicas de los usuarios. En general, sin embargo, una forma tridimensional (3D) de cóncavo (o hemisférica) se considera el más adecuado para la producción de esferoides solo tamaño uniforme. Por lo tanto, la utilidad de los micropocillos cóncavos se ha divulgado para muchos estudios de Biología de la célula tales como examinar la diferenciación de cardiomiocitos de células madre embrionarias de¹⁴,¹⁵, racimos de la secreción de insulina de la célula del islote la actividad enzimática de los hepatocitos¹⁶y la resistencia a los medicamentos de tumor esferoides¹⁷.

Desafortunadamente, la fabricación de los micropocillos a menudo requiere instalaciones especializadas micropatterning; métodos de fotolitografía convencionales requieren exposición e instalaciones en vías de desarrollo mientras que los reactivos ion-aguafuerte-métodos necesitan equipo de plasma y viga de ion. Ese equipo es costoso que, junto con el proceso de fabricación complicado, presenta una alta barrera de entrada para los biólogos que no tienen acceso a la microtecnología. Para superar estos problemas, otros métodos rentables como hielo litografía¹⁸ (usando las gotas de agua congeladas) y el método de membrana flexible¹⁴ (usando una membrana, sustrato por-agujero y un vacío) se han sugerido. Sin embargo, estos métodos también conllevan graves inconvenientes como que es difícil controlar el tamaño del patrón, el logro de altos cocientes de aspecto y la producción de micropocillos de área más grande.

Para superar estas cuestiones, proponemos un método de fabricación de novela micropocillos cóncavo utilizando un substrato a través del agujero, bolas de acero y una variedad de imán. Usando este método, se pueden fabricar cientos de micropocillos esféricos cóncavos aprovechando el mecanismo de cuentas metálicas autobloqueantes asistida de fuerza magnética (figura 1). El proceso de fabricación implica el uso de muy pocas instalaciones costosas y complicadas y no requiere de muchas habilidades avanzadas. Como tal, personas aún pueden realizar fácilmente este método de fabricación. Para demostrar el método propuesto, humanos-adiposo-derivados de las células madre fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos para producir esferoides.

1. elaboración de matriz de imán y placa de aluminio por-agujero matriz

1. Preparar dos de 50 x 50 mm (o mayor) placas de aluminio. El espesor de cada placa fue 300 μm que es la mitad del diámetro del grano.
2. Forman una matriz de 30 x 30 a través del agujero en una de las placas de aluminio utilizando un CNC grabador rotatorio con una Φ550-μm micro broca de 30 mm/s de tasa de penetración y 8000 RPM de velocidad del huso. La distancia entre cada agujero (de centro a centro) fue de 1 mm (Figura 1a y Figura 2a, ).
3. Formar una matriz de 30 x 30 de Φ750 μm a través de agujeros en la otra placa de aluminio, utilizando el mismo procedimiento que se describe en 1.2 (Figura 1a y Figura 2a, ii).
4. Coloque las dos placas entre sí utilizando una cinta adhesiva y formar los agujeros de alineación de Φ3 mm en cada una de las cuatro esquinas de dos placas de aluminio.
5. Remojar las placas de aluminio en ácido sulfúrico de 15% durante 12 h para limpiar sus superficies. Ya que la fina capa de óxido de aluminio sobre la superficie del aluminio que sea resistente a la corrosión, el diámetro de agujero y el grosor de la placa no cambia este tratamiento con ácido.
6. Forman una matriz de 30 × 30 de 1 x 1 x 1 mm neodimio imanes (con una fuerza magnética de 0.363 N). Asegúrese de que cada imán es la polaridad opuesta a su vecino. Para evitar la ruptura o la dispersión de la matriz de imán, fije una placa de aluminio de 30 x 30 mm en la parte inferior de la matriz de imán usando cinta de doble cara (Figura 2a, la iii y la inserción en figura 2).

2. proceso de captura de grano

1. Alinear y apilar las dos placas de aluminio (top placa: placa de orificio de 750 μm, placa inferior: placa de orificio de 550 μm) usando los orificios de alineación dispuestos en las cuatro esquinas de cada placa (Figura 1b).
2. Traben las dos placas mediante la inserción de los tornillos M3 en los agujeros de alineación y luego fije los tornillos con tuercas (Figura 1b).
3. Coloque el ensamblaje de placa de aluminio en el arreglo de imán preparado (Figura 1b, 2by 2C). Alinee el conjunto de imanes y la matriz de agujeros en la placa de aluminio durante el proceso de apilado. Utilizar una cinta adhesiva para fijar la posición de la matriz de imán.
4. Lugar un número suficiente de acero de Φ600 mm. SUJ2 granos en el conjunto de placa y manipular los granos con un acrílico (o no metálico) de la placa tal que un grano queda atrapado en cada orificio (figura 1C, 1Dy 1e) mientras que al mismo tiempo quitar el exceso granos que no han presentado en los agujeros.
5. Retire con cuidado la placa superior para evitar la dispersión no deseada y la dislocación de los granos atrapados (figura 1f).

3. cóncavo micropocillos fabricación

1. Mover el molde cóncavo micropocillos, producido en pasos 2.1 a 2.5, arriba, a una placa Petri.
2. La mezcla de monómero de polidimetilsiloxano (PDMS) y el agente endurecedor según las instrucciones de los fabricantes¹⁹ con un monómero PDMS: cociente de 10:1 del agente de curado.
3. Gas de la mezcla PDMS utilizando un desecador y una bomba de vacío para eliminar las posibles burbujas en la mezcla PDMS.
4. Vierta la mezcla PDMS en el molde cóncavo micropocillos y gas de nuevo utilizando el mismo procedimiento que se describe en 3.3 (figura 1f).
5. Cueza al horno la mezcla PDMS en la placa caliente a 80 ° C por 2 h para formar un sustrato PDMS integrado de grano (figura 1 g).
6. Quite el sustrato PDMS curado del molde (figura 1 g). En el proceso de extracción, pulverización metanol con botella de lavado para separar el sustrato PDMS del molde.
7. Con un Φ15 x imán de 2 mm, retire los granos de acero atrapados el sustrato PDMS (figura 1 h). Para este proceso, puede utilizarse cualquier imán que es suficientemente fuerte para extraer los granos del substrato de PDMS.

4. cultura de esferoide

1. Corte cóncavo sustrato PDMS micropocillos-patrón utilizando un punzón de biopsia Φ14 mm para montarse en placa de 24 pozos en este estudio.
2. Esterilizar el sustrato resultante de PDMS de mm Φ14 en un esterilizador de la autoclave a 121 ° C y 15 psi.
3. Coloque el sustrato esterilizado de PDMS en una placa bien 24.
4. La capa del sustrato PDMS todo con pluronic F-127 solución al 4% (w/v) durante la noche para evitar la fijación de células a la superficie de los micropocillos. Durante el proceso de capa, eliminar posibles burbujas de aire atrapadas en los micropocillos cóncavos mediante pipeteo o utilizando un limpiador ultrasónico.
5. Descargue la solución de F-127 tres veces mediante el uso de solución salina tamponada con fosfato (PBS).
6. Sembrar 1 mL de solución de medio celular (medio de Eagle modificado de Dulbecco) (que contiene 2 x 10⁶ células) en el sustrato PDMS. Tenga en cuenta que la densidad de siembra puede cambiar según el tamaño del esferoide de destino o tipo de celda de destino. Aquí, se utilizaron células madre procedentes de adiposo (ASC).
7. Aspirar 1 mL del medio usando una pipeta de 1000 μL para quitar cualquier exceso células que no fueron atrapadas en los pocillos (figura 3).
8. Incubar las células en 36,5 ° C, humedad de > 95% y 5% CO₂ condición. En el caso de la ASC en nuestro estudio, las células se agregan a un esferoide en 48 h.

Un molde convexo y un patrón de micropocillos fueron fabricados con éxito siguiendo los pasos 2.1 a 3.7. (Figura 4). Los granos de acero comerciales quedaron atrapados en la matriz por-agujero de 30 x 30. Los granos se mantuvieron firmemente sin espacios entre los granos y los correspondientes agujeros (figura 4a). La forma de micropocillos cóncava fabricado es cóncavo semiesférico, con un diámetro de 600 μm, que es lo mismo que el de las bolas de acero (Figura 4b). Una sección transversal de un pocillo cóncavo (figura 4 c) muestra que la distancia de los micropocillos vecinos era 1 mm (centro a centro), que era el mismo que el de los agujeros. El sustrato de micropocillos mm cóncava de Φ14, que fue colocado en la placa de la pozo 24, contiene más de 120 pocillos (figura 4 d).

Células madre procedentes de adiposo fueron cultivadas en los micropocillos cóncavos. Siembran 2 x 106 células en la matriz de micropocillos cóncava de Φ14 mm. Después de 24 h, las células habían agregado en esferoides, como se muestra en la figura 4. El diámetro promedio de los esferoides en nuestra gama de micropocillos fue 185.68 ± 22.82 μm (día 1, figura 5a, 5C). En día 3, las células habían convertido en más agregadas, con el diámetro promedio de los esferoides a 147.00 ± 17.11 μm (figura 5b, 5 d).

Figura 1 : Esquema del proceso de fabricación de. (a) hacer 30 x 30 Φ550 y 750 μm por-agujero variedad en placas de aluminio con CNC grabador. (b) alineación de los dos a través de placas usando los agujeros de alineación. Posteriormente, las placas alineadas fueron apiladas en el arreglo de imán. (c) una cantidad suficiente de granos de acero sobre las placas de la siembra. (d) raspar los granos usando una placa de acrílico para atrapar los granos de la matriz a través del agujero. (e) los granos quedaron atrapados en la matriz a través del agujero. (f) la placa superior (matriz a través del agujero de Φ750 μm) fue quitada y mezcla PDMS se vierte en el molde. (g) después de que el PDMS fue cocido al horno a 80 ° c por 2 h, el PDMS curado era refractarios sin forma. (h) el PDMS curado agarra las bolas de acero. Los granos entonces se quitan usando un imán de neodimio (Φ15 mm con un espesor de 2 mm). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Proceso de fabricación. (a) preparación de dos platos por-agujero y arreglo de imán. i) placa aluminio 750 μm matriz de por-agujero. II) placa aluminio 550 μm matriz de por-agujero. III) 30 x 30 matriz de 1 x imanes de 1 mm x 1 mm. (b) vista superior de placas apiladas y alineadas. (c) Vista inferior de placas apiladas y alineadas y arreglo de imán. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Eliminar células excesiva por menisco retroceso. Por aspirar el medio, la tensión superficial fue causada por la interfaz aire-líquido y, a continuación, la tensión superficial desechar células excesiva en la superficie del substrato de micropocillos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Molde convexo y matriz de micropocillos fabricado. (a) granos atrapados en placa de aluminio de la matriz a través del agujero. Atrapados los granos actúan como un molde para fabricar los micropocillos cóncavos. El tamaño de grano fue de 600 μm. La barra de escala es 1 mm. (b) y (c) SEM imágenes de micropocillos fabricados. Cada micropocillo fabricado tiene forma semiesférica, 600 μm de diámetro. (d) matriz de micropocillos Φ14-m en placa de 24 pozos. La matriz contiene más de 120 pocillos cóncavas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5 : Cultura esferoides en matriz de micropocillos cóncava. La matriz de pocillos Φ14-mm fue sembrada con 2 x 106 ASCs y cultivada por 3 días. (a) cultos esferoides en 1 día; las células han comenzado a esferoides de forma. La barra de escala es 2 mm. (b) cultivados esferoides en día 3; los esferoides formados se estructuran más firmemente, mientras su diámetro promedio ha descendido de 185.68 ± 22.82 μm, día 1 a 147.00 ± 17.11 μm, día 3. La barra de escala es 2 mm. (c) Ampliación imágenes del esferoide en 1 día. La barra de escala es de 500 μm. (d) aumento las imágenes del esferoide en día 3. La barra de escala es 500 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Resultado de la simulación para el vector de densidad de flujo magnético. La densidad del flujo magnético en el arreglo de imán se calcula utilizando el módulo de la magnetostática. El resultado de la simulación muestra que la densidad de flujo magnético más fuerte es en el centro de cada imán, causando los granos a ser atrapados en el centro de los agujeros donde con seguridad se convirtió en fijo. La barra de escala es 2 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Distribución del campo magnético de matriz imán. Cada imán es de la polaridad opuesta a su vecino. El campo magnético horizontal es dominante en la interfaz entre los imanes vecinos, mientras que el campo magnético vertical es más fuerte en el centro de cada imán. Estas fuerzas direccionales guían una tira para el centro de un imán. (a) campo magnético de la matriz de imán. (b) el vector de campo magnético según lo determinado por simulación de magnetostática. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Limitación usando solo imán grande y de tamaño de grano. (a) a diferencia del caso de la utilización de un conjunto de pequeños imanes, cuando un imán grande se utiliza, casi todos los granos tienden a moverse al borde o centro del imán donde se forma el campo magnético de alta densidad. Además, los granos están conectados para formar una cadena. La barra de escala es 10 mm. (b) imagen de SEM de micropocillos vinculados que se fabricaron utilizando Φ800 μm de 1 mm x 1 mm x matriz de imán de 1 mm. Con una tira que es demasiado grande en tamaño en relación con el tamaño del imán puede crear un pequeño agujero en la pared entre pocillos adyacentes. La barra de escala es 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : La importancia de elegir el tamaño apropiado de la placa superior espesor y agujero en el proceso de captura de cuentas. (a) si la placa superior es demasiado gruesa, se producirá una doble trampa. (b) por el contrario, si la placa superior es demasiado fina, hay una tendencia para los granos que salen. (c) si el tamaño por-agujero es más grande que el diámetro de grano, puede ocurrir dislocación doble trampa tanto grano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen conflictos de interés divulgar.