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Artículo de método

Un

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DOI:

10.3791/55559

8 de mayo de 2017

En este artículo

Resumen

En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.

Resumen

La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados ​​por otras enfermedades.

Introducción

El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o "persistentes". 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra.

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Protocolo

Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3).

1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección

  1. Infect Nueva Zelanda conejos blancos con M. tuberculosis usando un sistema de exposición a aerosol sólo para la nariz como se describió anteriormente. 12,

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Resultados

Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a .......

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Discusión

lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de este .......

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Divulgaciones

No hay intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

Deseamos agradecer a Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento co....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Conejos blancos de Nueva Zelanda
Mycobacterium tuberculosisBEI ResourcesNR-13647 
Ketathesis (Ketamina) 100 mg/mL C3NHenry Schein Animal Health56344
Anased (xilacina) 100 mg/mLHenry Schein Animal Health33198
Euthasol (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) Solución Virbac710101
línea celular monocítica THP-1ATCCATCC TIB-202
175 cm² Matraz tratado con TC (T175)Fisher ScientificT-3400-175
RPMI 1640 medios sin glutaminaFisher ScientificMT-15-040-CV
Hyclone Suero bovino fetal, irradiado con rayos gamma Fisher ScientificSH3091003IR
Hypclona L-glutamina, 200 mMPlato Fisher ScientificSH3003401
Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventiladoFisher ScientificT-2881-1
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Fisher ScientificBP685-1
Ácido etilendiaminotetraacéticoSigmaE6758
Ácido oleico Fisher ScientificICN15178101
Pierce RED Dispositivo Placa base reutilizableFisher ScientificPI-89811
Pierce RED Insertos de dispositivo, 50/caja Fisher ScientificPI-89809
Pierce RED herramienta de extracción de plaquitas Fisher Scientific89812
Sello de placa adhesivaFisher Scientific08-408-240
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) Tecnologías de la Vida 10010-049
DMSOSigma 472301
AcetonitriloSigma34998
MetanolSigma34860
Clorhidrato de verapamiloSigmaV4629
Sal sódica de diclofenacoSigma93484
Solución de azul de tripano, 0.4%Fisher Scientific15-250-061
Etanol, 200 pruebasFisher Scientific04-355-451
2010 Geno/GrinderSPEX SamplePrep2010
de bolas Homogeneizador Accesorio, perlas de metal a granelFisher Scientific15-340-158
484R Cobalto 60 IrradiadorJL Shepard7810-484-1
INCYTO  Hemacitómetros desechables C-ChipFisher Scientific22-600-100
Sistema de cromatografía líquida binaria
AB Sciex4000
Covance-HN878 Molino Microscopio óptico vertical Leica DM1000 Espectrómetro de masas multicomponente Agilent 1260

Referencias

  1. Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
  2. Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....

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