En este artículo se describe un método de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a caseum de lesiones y cavidades de tuberculosis pulmonar. El protocolo también se utiliza con una matriz espumosa derivada de macrófagos que es un sustituto efectivo del caseo.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
En este artículo
Resumen
Resumen
La erradicación de la enfermedad de la tuberculosis requiere regímenes farmacológicos que pueden penetrar las múltiples capas de lesiones pulmonares complejas. La distribución de fármacos en los núcleos caseosos de cavidades y lesiones es especialmente crucial porque albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a fármacos también comúnmente denominadas persisters. Los métodos existentes para la medición de la penetración del fármaco en lesiones de tuberculosis implican costosos y largos estudios farmacocinéticos in vivo acoplados a técnicas bioanalíticas o de formación de imágenes. La medida in vitro de la unión de fármacos a macromoléculas de caseo se propuso como una alternativa a tales técnicas ya que esta unión dificulta la difusión pasiva de moléculas de fármaco a través de caseo. La diálisis de equilibrio rápido es un sistema rápido y fiable para realizar estudios de unión a proteínas plasmáticas y tejidos. En este protocolo, se utilizó un dispositivo de diálisis de equilibrio rápido (RED) para medir la unión de fármacos a homogenados de caseo que es excised de las lesiones y de las cavidades de los conejos de tuberculosis infectados. El protocolo también se describe cómo generar una matriz sustituta de lípido cargado macrófagos THP-1 para utilizar en lugar de caseosa. Este / ensayo de unión sustituto caseosa es una herramienta importante en el descubrimiento de fármacos tuberculosis y se puede adaptar para ayudar a estudiar la distribución del fármaco en las lesiones o abscesos causados por otras enfermedades.
Introducción
El tratamiento de la tuberculosis pulmonar requiere una distribución eficaz de fármacos en diferentes tipos de lesiones. Las lesiones necróticas y las cavidades contienen centros caseosos que albergan subpoblaciones de bacterias tolerantes a los fármacos o "persistentes". 1 , 2 La enfermedad cavitaria se asocia con tasas de curación inferiores y mal pronóstico. 3 , 4 Estudios previos han demostrado, usando técnicas cuantitativas y de imágenes, que la capacidad de penetrar el caseo varía significativamente de una clase de fármaco a otra.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Todos los estudios con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de los Institutos Nacionales de Salud, con la aprobación del Comité Institucional Animal Cuidado y Uso del NIAID (NIH), Bethesda, MD. Se realizaron todos los estudios con M. tuberculosis en un laboratorio con nivel de bioseguridad de contención 3 (BSL-3).
1. Conejo Modelo de infección y caseosa Colección
- Infect Nueva Zelanda conejos blancos con M. tuberculosis usando un sistema de exposición a aerosol sólo para la nariz como se describió anteriormente. 12,
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Usando este protocolo, hemos probado cientos de compuestos de desarrollo de fármacos para la tuberculosis para su eficacia pronosticada en el caso de penetración. La figura 1 visualiza los conceptos básicos del ensayo RED. La membrana de diálisis de los insertos ROJO permite que pequeñas moléculas no unidas se difundan desde el pozo del donante hasta el pozo receptor, logrando finalmente un equilibrio entre ambos compartimentos. Las moléculas pequeñas que están unidas a .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
lesiones necróticas pulmonares y cavidades en los pacientes de tuberculosis infectados contienen subpoblaciones de bacterias que son recalcitrantes al tratamiento farmacológico. Los núcleos caseosos de estas estructuras son particularmente responsable de albergar estos persisters en un entorno extracelular. 16 distribución favorable de agentes antibacterianos en estos lugares remotos se cree que es un determinante importante de la eficacia del fármaco tuberculosis. Antes de la validación de este .......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
No hay intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Deseamos agradecer a Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X y Trius Therapeutics por proporcionar bedaquiline, PA-824 (pretomanida), AZD5847, radezolid y tedizolid, respectivamente. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li y Danielle Weiner apoyaron el análisis MALDI, los métodos bioanalíticos, la preparación del sustituto del caseo, la síntesis química y el aislamiento del caseo de conejo. Este trabajo se llevó a cabo con fondos de la Fundación Bill y Melinda Gates, el premio # OPP1044966 y OPP1024050 a V. Dartois, la Subvención de Instrumentación Compartida NIH S10OD018072, así como el financiamiento co....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Conejos blancos de Nueva Zelanda | |||
| Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesis (Ketamina) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (xilacina) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sódico y fenitoína sódica) Solución | Virbac | 710101 | |
| línea celular monocítica THP-1 | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² Matraz tratado con TC (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 medios sin glutamina | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Suero bovino fetal, irradiado con rayos gamma | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hypclona L-glutamina, 200 mM | Plato Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC, 145 mm x 20 mm, ventilado | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ácido etilendiaminotetraacético | Sigma | E6758 | |
| Ácido oleico | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Dispositivo Placa base reutilizable | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Insertos de dispositivo, 50/caja | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED herramienta de extracción de plaquitas | Fisher Scientific | 89812 | |
| Sello de placa adhesiva | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Tecnologías de la Vida | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma 472301 | ||
| Acetonitrilo | Sigma | 34998 | |
| Metanol | Sigma | 34860 | |
| Clorhidrato de verapamilo | Sigma | V4629 | |
| Sal sódica de diclofenaco | Sigma | 93484 | |
| Solución de azul de tripano, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Etanol, 200 pruebas | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| de bolas Homogeneizador Accesorio, perlas de metal a granel | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalto 60 Irradiador | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO Hemacitómetros desechables C-Chip | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Sistema de cromatografía líquida binaria | |||
| AB Sciex | 4000 | ||
Referencias
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Fron....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
