Ensayo novedoso para la nocicepción en frío Drosophila Las larvas

Summary

Aquí se demuestra un nuevo ensayo para estudiar la nocicepción frío en larvas de Drosophila. Este ensayo utiliza una sonda Peltier hecha a la medida capaz de aplicar un estímulo frío nocivo focal y da lugar a comportamientos específicos de frío cuantificables. Esta técnica permitirá además disección celular y molecular de la nocicepción frío.

Abstract

Cómo los organismos detectar y responder a las temperaturas nocivas aún es poco conocido. Además, los mecanismos de sensibilización de la maquinaria sensorial, tal como en los pacientes que experimentan la neuropatía periférica o sensibilización inducida por la lesión subyacentes, no están bien caracterizados. El modelo de Drosophila genéticamente tratables se ha utilizado para estudiar las células y los genes necesarios para la detección de calor nocivo, que ha dado múltiples genes conservados de interés. Poco se sabe sin embargo sobre las células y los receptores importantes para la detección frío nocivo. Aunque, Drosophila no sobrevive a la exposición prolongada a temperaturas frías (≤10 ºC), y evitará fresco, prefiriendo las temperaturas más cálidas en ensayos de preferencias de comportamiento, cómo se detectan y, posiblemente, evitar estímulos de frío nocivos sólo recientemente ha sido investigado.

Aquí se describen y caracterizan los primeros fríos nocivo (≤10 ºC) en el ensayo de conductaDrosophila. El uso de esta herramienta y el ensayo, se muestra un investigador cómo evaluar cualitativa y cuantitativamente comportamientos nociceptivos fríos. Esto puede hacerse en condiciones de cultivo normales / sanos, o presumiblemente en el contexto de una enfermedad, lesión o sensibilización. Además, este ensayo puede ser aplicado a larvas seleccionadas para los genotipos deseados, lo que podría impactar thermosensation, dolor, o sensibilización nociceptiva. Dado que el dolor es un proceso altamente conservada, utilizando este ensayo para estudiar más a fondo la nocicepción térmica es probable que recoger importante comprensión de los procesos de dolor en otras especies, incluyendo vertebrados.

Introduction

Drosophila ha demostrado ser de gran utilidad para la identificación de nuevos genes conservados y circuitos neuronales que subyacen a los comportamientos complejos. Moscas proporcionan un conjunto de herramientas genético sofisticado y un sistema nervioso simplificado, que permiten la manipulación precisa genética y neuronal ^{1, 2, 3, 4} para diseccionar las bases celulares y moleculares de la nocicepción ^{5, 6, 7.} Las larvas son particularm....

Protocol

1. Preparación de las larvas

1. Elevar acciones o cruces genéticos en una incubadora a 25 ºC.
   1. Si el cultivo de una cruz, utilizar 20-25 hembras vírgenes y 15-20 varones por cada vial que contiene medios de comunicación regular de mosca harina de maíz. Permitir que las hembras ponen huevos a aproximadamente 48 h antes de transferirlos a un nuevo vial de alimentos.
2. 4-5 días después de la puesta de huevos, recoger 3 ^rd instar larvas del genotipo deseado por chorros suavemente una corriente de agua en la comida blanda y larvas, y verter el contenido en una, placa de Petri limpia de tamaño mediano (60 mm x 15 mm).
3. ....

Results

Drosophila larvas se mueven con un movimiento peristáltico que incluye pausas ocasionales, cabeza vueltas, y los cambios de dirección ^22. En respuesta a la aplicación focal de un estímulo nocivo frío sin embargo, las larvas presentan un conjunto de comportamientos únicos, a diferencia del rodillo lateral aversivo al calor nocivo y estímulos mecánicos. Estos comportamientos también son diferentes de las respuestas al toque suave ^8,

Discussion

El ensayo descrito aquí se puede utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente la nocicepción o sensibilización nociceptiva en larvas de varios fondos genéticos, influencias ambientales, y / o condiciones de avería inducida. Dado que este ensayo permite la aplicación focal de un estímulo frío, con esta herramienta se puede evaluar la función de un subconjunto de neuronas sensoriales periféricas específicamente en respuesta a las temperaturas frías. Curiosamente, estos comportamientos evocados fríos parecen utili.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sonda de frío	Pro-Dev Engineering	Hecho a medida bajo demanda Los números de	pieza y los detalles de construcción se pueden proporcionar a pedido
Unidad de control térmico	Tecnología TE	Gabinete personalizado	números de pieza y los detalles de construcción se pueden proporcionar a pedido
Microscopio Zeiss Stemi 2000	Zeiss	NT55-605
Fiber-Lite MI-150 Iluminador	de alta intensidadIndustrias Dolan-Jenner.	A20500
Schott Doble cuello de cisne de 23 pulgadas Guía de luz de fibra óptica	Schott North America, Inc.	Pinza Schott A08575
FST		FS-1670	Se utiliza para clasificar y manipular larvas. Asegúrese de alisar y desafilar ligeramente las puntas de las pinzas para reducir el riesgo de perforar o lesionar accidentalmente las larvas
Pincel	Dick Blick Art Materials	06762-1002	Se utiliza para clasificar y manipular larvas. Es útil si el pincel está húmedo durante el uso.
35 mm x 10 mm Placa de Petri de poliestireno	Falcon	351008
60mm x 10 mm Placa de Petri de poliestireno	Falcon	351007
Pieza de vinilo negro (al menos 2 pulgadas x 2 pulgadas)			Se utiliza para proporcionar contraste y orientar las larvas a la sonda fría
Fisherbrand Scoopula Espátula	Fisher Scientific	14-357Q	Se utiliza para mover alimentos
Kimtech Science Kimwipes	Fisher Scientific	06-666A	Se utiliza para secar las larvas y sondear en frío si hay exceso de humedad