Los estudios de estructura-función en las células madre embrionarias de ratón Usando mediada por recombinasa Cambio de Cassette

Summary

Las proteínas a menudo contienen varios dominios que pueden ejercer diferentes funciones celulares. Genes knock-out (KO) no tienen en cuenta esta diversidad funcional. Aquí, se presenta un enfoque basado en la estructura-función de intercambio de casete de recombinación mediada (RMCE) en células madre embrionarias de KO que permite la disección molecular de varios dominios funcionales o variantes de una proteína.

Abstract

ingeniería de genes en embriones de ratón o células madre embrionarias (mESCs) permite el estudio de la función de una proteína dada. Las proteínas son los caballos de batalla de la célula y a menudo consisten en varios dominios funcionales, que pueden ser influenciados por modificaciones posteriores a la traducción. El agotamiento de la proteína completa en ratones condicional o constitutiva knock-out (KO) no tiene en cuenta esta diversidad funcional y la regulación. se informó previamente Una línea mESC y un modelo de ratón derivada, en la que se insertó un sitio de acoplamiento para FLPe intercambio casete de recombinación mediada (RMCE) dentro del locus ROSA26 (R26),. Aquí, se presenta en un enfoque de estructura-función que permite la disección molecular de las distintas funcionalidades de una proteína multidominio. Con este fin, los ratones compatible-RMCE deben ser cruzadas con ratones KO y mESCs KO compatibles RMCE-a continuación deben ser aislados. A continuación, un panel de construcciones de rescate putativos se puede introducir en el locus R26 a través de RMCE targeting. Los ADNc de rescate candidatos se pueden insertar fácilmente entre sitios RMCE de los ataques de vectores de clonación que utilizan la recombinación. A continuación, mESCs KO se transfectan con el vector de direccionamiento en combinación con un plásmido de expresión de la recombinasa FLPe. RMCE reactiva el gen de resistencia a neomicina sin promotor en los sitios de acoplamiento ROSA26 y permite la selección del evento orientación correcta. De esta manera, se obtienen altas eficiencias de focalización cercanos al 100%, lo que permite la inserción de múltiples construcciones de rescate putativo de una manera semi-alto rendimiento. Por último, una multitud de construcciones de rescate impulsadas-R26 puede ser probado por su capacidad para rescatar el fenotipo que se observó en mESCs KO parentales. Presentamos un estudio de estructura-función de prueba de principio en la catenina p120 (p120ctn) mESCs KO utilizando la diferenciación del endodermo en cuerpos embrioides (EBS) como la lectura fenotípica. Este enfoque permite la identificación de dominios importantes, las vías aguas abajo putativo, y el punto de enfermedad relevantemutaciones que subyacen fenotipos KO para una determinada proteína.

Introduction

Se estima que los genomas de mamíferos contienen alrededor de 20.000 genes codificadores de proteínas. Splicing alternativo y modificaciones postraduccionales aumentan aún más el repertorio de proteínas. Las proteínas tienen una estructura modular ¹ y a menudo contienen varios dominios de interacción, que permiten su reclutamiento en diferentes complejos de proteínas y su participación en múltiples procesos celulares ^2. Un ejemplo es la proteína multifuncional llamada p120ctn. p120ctn está codificada por el gen Ctnnd1 y consta de un gran dominio central armadillo repetición flanqueado por un N-terminal y una re....

Protocol

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las normas de origen animal institucionales, nacionales y europeas.

1. Aislamiento de mESCs KO compatibles con RMCE

1. Breed ratones KO heterocigóticas con ratones compatible-RMCE, tales como ratones ROSALUC ¹⁰ o ratones ROSA26-iPSC ^21. Ambos ratones compatibles con RMCE se mantuvieron en un / fondo mixto 129 C57BL6 / suizo.
   NOTA: Al cruzar con ratones KO heterocigóticos se recomienda para superar la letalidad embrionaria en ratones KO homocigóticos.
2. Utilice PCR para seleccionar ratones KO heterocigotos que contienen un c....

Results

El procedimiento para aislar líneas KO mESC compatible-RMCE se representa en la Figura 2. Se requieren dos crías consecutivos para obtener blastocistos KO compatible con RMCE. En primer lugar, los ratones KO heterocigóticos se cruzaron con los ratones compatibles con RMCE obtener, ratones KO heterocigóticos compatible con RMCE. Estos ratones se usan entonces para apareamientos programados con otros ratones KO heterocigóticas para obtener 3,5-dpc, compatible-RMCE, blastoc.......

Discussion

Nuestro método de aislamiento mESC es fácil de usar y no requiere de técnicas y equipos avanzados, tales como la microcirugía de los blastocistos. Por lo tanto, esta tecnología se puede acceder a una gran parte de la comunidad científica. Cualquier persona con experiencia básica cultivo celular puede propagarse excrecencias ICM y establecer líneas mESCs. Sin embargo, el enrojecimiento y la manipulación de los blastocistos requiere algo de práctica. Una pipeta boca se utiliza para transferir los blastocistos y se compone.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Ratones	hechos en casa		esperma congelado disponible a pedido
Ratones R26-iPSC	hechos en casa		esperma congelado disponible a pedido
Sonda de vaso	Fine Science Tools	10160-13	para verificar si hay tapones de cópula
M2 medio	Sigma-Aldrich	M7167	hacer alícuotas y almacenar a -20 ° C
Pinzas finas (Dumont #5 Pinzas de punta estándar para estudiantes)	Fine Science Tools	11251-10	rocíe con 70% de EtOH antes de usar (no lo haga en autoclave)
Agujas de 23 G	Jeringas de 1 mL Fine-ject	8697
de grado	Soft-ject	6680
de 60 mm (para enjuagar)	Gosselin	BB60-01
Pipeta bucal	hecha en casa		ver discusión
Fibroblastos embrionarios de ratón (MEFs, TgN (DR4)1 cepa Jae)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Ratones Jae	The Jackson Laboratory	3208
Mitomicina C	Sigma-Aldrich	M0503
Solución salina tamponada con fosfato (PBS) sin calcio ni magnesio	Ratones Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J	JAX	3208	que contienen cuatro genes seleccionables por fármacos y DR4 MEFS confiere resistencia a la neomicina, puromicina, higromicina y 6-tioguanina
0,1% Gelatina	Sigma-Aldrich	G1393	Disolver 0,5 g en 500 mL de agua destilada, esterilizar en autoclave y almacenar a 4 °C.
Tripsina (0,25%)	Gibco	25200-056
2 μ M pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	Colección BCCM/LMBP	LMBP 08870	disponible al público en la colección BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
cRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	disponible al público en la colección BCCM/LMBP (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
choque térmico competente DH5 y alfa; bacterias	hecho en casa
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contiene gen de resistencia a kanamicina
BP clonasa II mezcla	Thermo Fisher	11789-020
LR clonasa II mezcla	Thermo Fisher	11791-020
Caldo Luria (LB)
Ampicilina
Analizador de ADN Applied Biosystems 3730XL Thermo	Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Reactivo de transfección Lipofectamine 2000	Thermo Fisher	11668027
Reactivo de transfección Lipofectamine LTX Reactivo
Effectene	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	vector compatible con la recombinación
monoclonal anti-p120ctn anticuerpo anti-p120ctn	Transduction Laboratories	610134
anticuerpo monoclonal anti-Ecadherina de ratón	BD Transduction Laboratories	610181
Equipo general
		de disección estériles	Tijeras finas y pinzas para diseccionar el útero
Pipetas estériles: 5 mL, 10 mL y 25 mL
Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL y 50 mL
Fondo en forma de V y fondo plano)
Placas de cultivo: 24 pocillos, 12 pocillos y 6 pocillos Pipetas
multicanal (para pipetear 30, 50, 100 y 200 μ L)
Reservorios multicanal estériles
Acceso a un flujo
Acceso a una incubadora a 37 ° C con 5% de CO2
Acceso a un microscopio
Acceso a una centrífuga
Acceso a un microscopio estereoscópico con luz transmitida
Culture media
MEF Medium			almacenado a 4 & grados; C; caliente 30 min a 37 ° C antes de usar
Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM)	Gibco	41965-062
10% suero fetal bovino (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
Piruvato de sodio  (0,4 mM)	Gibco	11360-039
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 y micro; g/mL)	Gibco	15140-122
SR mESC medium			almacenado a 4 & grados; C; caliente 30 min a 37 ° C antes de usar
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mezclado en una proporción 1:1
15% de reemplazo de suero knock-out (SR)	Gibco	10828– 028
L-glutamina (2 mM)	Gibco	25030-024
0,1 mM de aminoácidos no esenciales	Gibco	11140-050
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 y micro; g/mL)	Gibco	15140-122
β-mercaptoetanol (0,1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2.000 U/mL de ratón recombinante LIF	(Instalación de servicio de proteínas IRC/VIB)
FBS (similar al medio mESC basado en SR)			almacenado a 4° C; cálido 30 min a 37 ° C; C antes
de usar Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			almacenado a 4 & grados; C; caliente 30 min a 37 ° C antes
de usar el medio de Dulbecco modificado de Iscove (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hibridoma Medio (1x) líquido	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamina	Gibco	25030-024
0,4 mM 1-tioglicerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μ g/mL de ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A-4544
penicilina (100 U/mL)	Gibco	15140-122
estreptomicina (100 y micro; g/mL)	Gibco	15140-122
2i
1 μ Inhibidor de M Erk PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μ Inhibidor de M Gsk3 CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386