Este artículo describe espectral citometría, un nuevo enfoque en la citometría de flujo que utiliza las formas de los espectros de emisión para distinguir fluorocromos. Un algoritmo reemplaza compensaciones y puede tratar autofluorescencia como un parámetro independiente. Este nuevo enfoque permite el análisis adecuado de células aisladas de órganos sólidos.
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Artículo de método
Análisis de suspensiones celulares aisladas de tejidos sólidos por Spectral Citometría de Flujo
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Resumen
Resumen
La citometría de flujo se ha utilizado durante los últimos 40 años para definir y analizar el fenotipo de linfoide y otras células hematopoyéticas. Inicialmente restringida al análisis de unos fluorocromos, actualmente hay de diferentes colorantes fluorescentes decenas, y hasta 14-18 colorantes diferentes se pueden combinar a la vez. Sin embargo, varias limitaciones todavía en menoscabo de las capacidades analíticas. Debido a la multiplicidad de sondas fluorescentes, análisis de datos se ha vuelto cada vez más compleja debido a la necesidad de matrices, de compensación multi-paramétricos grandes. Además, los modelos de ratones mutantes que llevan las proteínas fluorescentes para detectar y rastrear tipos específicos de células en diferentes tejidos han estén disponibles, así se requiere el análisis (por citometría de flujo) de las suspensiones celulares de auto-fluorescente obtenidos a partir de órganos sólidos. Espectral citometría de flujo, que distingue las formas de los espectros de emisión a lo largo de una amplia gama de longitudes de onda continuas, aborda algunos de estos problemas. Los datos se analizan wITH un algoritmo que reemplaza matrices de compensación y trata la auto-fluorescencia como un parámetro independiente. Por lo tanto, espectral citometría de flujo debe ser capaz de discriminar fluorocromos con picos de emisión similares y puede proporcionar un análisis multi-paramétrico sin requisitos de compensación.
Este protocolo describe el flujo espectral citometría de análisis, lo que permite un parámetro 21 (19 sondas fluorescentes) caracterización y la gestión de una señal de auto-fluorescente, proporcionando alta resolución en la detección de la población menor. Los resultados presentados aquí muestran que el flujo espectral presenta citometría de ventajas en el análisis de las poblaciones de células a partir de tejidos difíciles de caracterizar en citometría de flujo convencional, tales como el corazón y el intestino. Espectral citometría de flujo por lo tanto demuestra la capacidad de análisis multi-paramétrico de gestión de alto rendimiento citometría de flujo convencional sin el requisito para la compensación y permite auto-fluorescencia.
Introducción
En las últimas décadas, la citometría de flujo (FCM) se convirtió en un método analítico ampliamente disponible esencial para los estudios de fenotipo celular. Ha habido un aumento sustancial en los colorantes fluorescentes disponibles, particularmente fluorocromos excitada por el láser violeta (405 nm) (por ejemplo, violeta brillante y nuevos colorantes Q-punto). Sin embargo, el crecimiento de colorantes fluorescentes disponibles aumenta el riesgo de emisiones superpuestas y requiere matrices de compensación de trabajo intensivo. FCM se hizo ampliamente utilizados para analizar las suspensiones de células a partir de tejido sólido, pero la presencia de célu....
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Protocolo
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con el Instituto Pasteur Carta ética y las directrices de la CEE y fueron aprobados por el Ministerio de Agricultura de Francia.
1. Cell Suspension Preparación a partir de ratón adulto Órganos
- Aislamiento de esplenocitos
- La eutanasia a los ratones adultos por dislocación cervical. Hacer una incisión en la línea media del abdomen y abrir la piel con unas tijeras. Se recoge el bazo con fórceps.
- Crush el bazo entre 2 microscopio de vidrio se desliza para disociar las células y diluirlas en 5 ml de solución Salado equilibrada de Hank (HBSS) que cont....
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Resultados
21-parámetro panel de FCM espectral para analizar esplenocitos
La Figura 1 muestra los resultados obtenidos con el panel 19 fluorescente-anticuerpo aplicado a células esplénicas que comprenden diferentes anticuerpos que reconocen subconjuntos de T, B, NK, dendríticas, y células mieloides, mientras que CD45 etiquetas de todas las células nucleadas hematopoyéticas. El panel también incluye un colorante de viabilida.......
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Discusión
FCM convencional se basa en la detección de fotones emitidos después de la excitación de las sondas fluorescentes. La emisión de fluorescencia de uno fluorocromo detectado en un detector diseñado para medir la señal de otro fluorocromo induce solapamiento físico. Este desbordamiento entre los espectros de emisión debe ser corregido por compensaciones.
FCM espectral y de procesamiento de datos por el algoritmo de desmezcla deconvolución permite la combinación de fluorocromos con picos de emis.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos las contribuciones técnicas y teóricas en citometría espectral de K. Futamura, que también revisión crítica del manuscrito. También estamos en deuda con C-Ait Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira, y P. Pereira para la lectura crítica del manuscrito y de asesoramiento técnico y el apoyo sin fin. Agradecemos también a P. Pereira por el don de las Vγ7-APC y Vδ4-Biotina anticuerpos anti etiquetados. Nos aknowledge el Centre d'Enseignements del Instituto Pasteur de la acogida y el apoyo a la logística de filmación. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); la Fundación Ciencia y Pa....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Ratones | Janvier Labs | CD45.2 | Fuente de células |
| Etanol 70% | VWR | 83801.36 | Esterilización |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Colección de embriones |
| Solución salina equilibrada de Hanks (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Soluciones de disociación, digestión y tinción |
| Solución salina equilibrada de Hanks (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Soluciones de disociación, digestión y tinción |
| Suero fetal de ternero (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Soluciones de disociación, digestión y tinción |
| Colagenasa | Sigma | C2139 | Solución enzimática |
| 90 x 15 mm, placas de Petri de cultivo de tejidos plásticos . | TPP | T93100 | Colección de embriones y corazones |
| 35 x 15 mm, placas de Petri de cultivo de tejidos plásticos. | TPP | T9340 | Colección Hearts |
| Tijera de iris fina | Fine Science Tools | 14090-09 | Herramientas de disección |
| Pinzas gruesas (pinzas de patrón estrecho, curvadas 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Herramientas de disección |
| Pinzas finas (pinzas Dumont n.º 7) | Fine Science Tools | 11272-30 Herramientas de | disección |
| Bisturí | VWR | 21909-668 Herramientas de | disección |
| LEICA MZ6 Microscopio de disección | LEICA | MZ6 | 10445111 Muestreo; Occular W-PL10x/23 |
| Fuente de lámpara fría | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Dos fibras de cuello de cisne adaptadas |
| Tubos FACS | VWR | 60819-310 | Celdas de digestión |
| Placa de 96 pocillos (fondo redondo) | VWR | 10861-564 | Celdas de tinción Tela |
| de pernos de malla de nailon esterilizada, piezas de 50/50 mm. | SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Filtración celular |
| UltrasComp eBeads | |||
| Anticuerpos marcados con fluorescencia | Biolegend | ver tabla a continuación | Células de tinción |
Referencias
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
- Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S.
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