Evaluación del procedimiento para realizar cistometría despierta en un modelo de ratón

Summary

Este estudio describe los procedimientos quirúrgicos y técnicas experimentales para realizar cistometría despierta en un ratón que se mueve libremente. Además, proporciona evidencia experimental para apoyar su optimización y estandarización.

Abstract

La cistometría de llenado despierto se ha utilizado durante mucho tiempo para evaluar la función de la vejiga en ratones que se mueven libremente, sin embargo, los métodos específicos utilizados varían entre los laboratorios. El objetivo de este estudio fue describir el procedimiento microquirúrgico utilizado para implantar un tubo intravesical y la técnica experimental para registrar la presión de la vejiga urinaria en un ratón despierto y de movimiento libre. Además, los datos experimentales se presentan para mostrar cómo la cirugía, así como el tipo de tubo y el tamaño, afectan la función del tracto urinario inferior y la sensibilidad de grabación. El efecto del diámetro del tubo sobre el registro de presión se evaluó tanto en tubos de polietileno como de poliuretano con diferentes diámetros internos. Posteriormente, el tubo de mejor rendimiento de ambos materiales se implantó quirúrgicamente en la cúpula de la vejiga urinaria de ratones C57BL / 6 macho. Se registró una frecuencia de micturación de doce horas durante toda la noche en animales sanos e intactos 2, 3, 5 y 7 días después de la cirugía. En la cosecha, vejigas wSe evaluaron los signos de hinchamiento utilizando la observación bruta y se procesaron posteriormente para el análisis patológico. La mayor extensión de hinchazón de la vejiga se observó en los días 2 y 3, que se correlacionó con los datos de micción conductual que muestran una función vesical significativamente deteriorada. Al día 5, la histología de la vejiga y la frecuencia de micción se habían normalizado. Basado en la literatura y la evidencia proporcionada por nuestros estudios, proponemos los siguientes pasos para el registro in vivo de la presión intravesical y el volumen de vacío en un ratón despierto: 1) Realizar la cirugía con un microscopio operativo y herramientas microquirúrgicas, 2) Utilizar polietileno-10 Tubería para minimizar los artefactos de movimiento, y 3) realizar cistometría en el día 5 postoperatorio, cuando se disuelve la hinchazón de la vejiga.

Introduction

La cistometría de llenado (FC) es un método de diagnóstico que consiste en colocar un catéter en la vejiga urinaria para registrar la presión durante el llenado lento de la vejiga. Introducido por primera vez en 1927 como un método de diagnóstico clínico para evaluar la función del tracto urinario inferior, se ha mantenido ampliamente utilizado. ¹ En aplicaciones de investigación, el FC puede usarse para probar la función de la vejiga en modelos animales sanos y enfermos y para estudiar los efectos de los agentes farmacológicos. Modelos animales de roedores se utilizan comúnmente para investigar la función del tracto urinario inferior. ² En este grupo de mamíferos, FC se desarrolló por primera vez para su uso en ratas. ³ Aquí, la metodología para implantar un tubo en la vejiga urinaria y realizar CF ha sido bien descrita y utilizada por muchos investigadores con un nivel aceptable de reproducibilidad. La disponibilidad de cepas transgénicas y knock out hace de los ratones una especie valiosa para numerosas áreas de investigación,Incluyendo el campo de la disfunción del tracto urinario inferior. La metodología utilizada para realizar la cistometría del ratón varía apreciablemente entre los laboratorios, lo que dificulta la comparación de los resultados. ⁵

En comparación con los modelos ex vivo , FC preserva la anatomía del tracto urinario inferior, permitiendo evaluar la función coordinada entre la vejiga y su salida durante las fases de almacenamiento y micción del ciclo miccional. La investigación anterior demuestra que los anestésicos numerosos, de uso general suprimen la contracción de la micción. Los agentes que preservan la contracción del músculo liso de la vejiga urinaria (uretano, α-cloralosa, ketamina y xilazina), permitiendo al animal miccionarte, todavía reducen significativamente la capacidad funcional de la vejiga y suprimen la neurotransmisión. ^{6 , 7 , 8 , 9} Aunque técnicamente más desafiante, el FC realizado en awLos animales ambulantes preservan la integridad funcional del reflejo de la micción.

La función del tracto urinario inferior está influenciada por múltiples factores, incluyendo el hinchamiento post-operatorio de la pared de la vejiga, el estrés debido al dolor y la incomodidad, y las influencias ambientales. El uso de una técnica quirúrgica que minimiza el daño tisular durante la implantación del tubo y los métodos de registro que reducen el movimiento del tubo, mientras que simultáneamente permite que el animal se mueva libremente, son esenciales para obtener grabaciones precisas y reproducibles.

Si se realiza adecuadamente, in vivo FC en animales que se mueven libremente puede proporcionar datos que reflejen fiablemente la función fisiológica de la vejiga. ¹⁰ FC en animales en movimiento libre puede proporcionar datos sobre los siguientes parámetros; Presión basal o basal: Presión mínima entre dos micciones. Presión de la intermitencia: Presión media entre dos micciones. Presión umbral: Presión intravesical immAntes de la micción. Presión máxima: Presión máxima de la vejiga durante un ciclo de micción. Actividad espontánea (o media oscilatoria de la intermitución): Presión de la interfunción menos presión basal. Contracciones no votivas: Aumento de la presión intravesical durante la fase de llenado, no asociado con la liberación de líquido. Cumplimiento de la vejiga: Capacidad de la vejiga dividida por la presión umbral menos la presión basal. Frecuencia de micción: Número de micciones por unidad de tiempo. Intervalo de intermitencia: Período entre dos presiones de vacío máximas. Capacidad de la vejiga: Volumen infundido dividido por el número de micciones. Se ha publicado previamente una descripción detallada de estos parámetros y una terminología estandarizada. ¹¹

FC se puede realizar utilizando un método de infusión intravesical de ciclo único o continuo. La cistometría continua permite registrar múltiples ciclos de micción y seleccionar datos representativos basados ​​enSobre la reproducibilidad. Su precisión en la medición de la capacidad de la vejiga está limitada debido al volumen residual desconocido. Además, es difícil recolectar pequeños volúmenes anidados (que basados ​​en la tensión y el sexo varían entre 30 y 184 μL) en ratones que se desplazan libremente. El uso de este método para registrar el volumen anulado es menos preciso en comparación con una preparación anestesiada, pero es superior en cuanto que evita los efectos supresores de los anestésicos sobre la función de la vejiga. Se debe usar cistometría de ciclo único para evaluar la capacidad de la vejiga. En este método, la vejiga se vacía por aspiración antes de la infusión y la capacidad se calcula como una función de la velocidad de infusión multiplicada por el tiempo hasta la presión máxima.

Aunque se ha publicado la técnica de realizar cistometría en roedores pequeños, describió la cirugía realizada en una rata y recomendó que la cistometría del ratón se realizara bajo anestesia con uretano. ¹⁰ El objetivo de esta comunicación esO describir las técnicas microquirúrgicas utilizadas para implantar un tubo intravesical en la cúpula de la vejiga urinaria y la configuración experimental utilizada para registrar la función del tracto urinario inferior, in vivo , durante el llenado continuo de la vejiga y la micción en un ratón despierto que se mueve libremente. Además, se realizaron experimentos para determinar cómo la longitud, el diámetro y el material de los tubos, así como la metodología para realizar FC in vivo , afectan a la grabación. Este protocolo experimental resume técnicas previamente publicadas y propone una serie de modificaciones basadas en resultados experimentales.

Protocol

Los animales fueron alojados en la Universidad de Vermont Animal Care Facility de acuerdo con las directrices institucionales. Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con la guía de los Institutos Nacionales de Salud para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Implante de tubo intravesical

1. Preparación de tubos e instrumentos para el procedimiento quirúrgico
   1. Corte una pieza de 7 cm de tubo PE10 para hacer el catéter para la implantación.
   2. Crear una llamarada en un extremo del tubo PE10 por avanzar lentamente el extremo hacia una llama abierta.
      NOTA: Retire rápidamente el tubo tan pronto como se desarrolle la llamarada.
   3. Aplique tres gotas de pegamento caliente para todos los fines, usando el ajuste de calor bajo en una pistola de pegamento, a 4,5, 5 y 5,5 cm del extremo ensanchado en el exterior del tubo PE10. Esto ayudará a asegurar el tubo en la espalda del animal. ( Figura 1 )
   4. Esterilizar la tubería remojándola en 70%Etanol y luego enjuagar con NaCl estéril al 0,9% antes de su uso. Deje el tubo lleno para evitar la introducción de burbujas de aire en el sistema.
   5. Crear un enchufe de calibre 30 para sellar el extremo del catéter PE10 separando una aguja de calibre 30 del cubo manualmente manipulando el extremo proximal de lado a lado. Aplique una gota de pegamento caliente al final. Asegúrese de que el sello esté hermético. ( Figura 2 )
   6. Utilice los siguientes instrumentos microquirúrgicos: Dos pares de microforceps curvos de Dumont # 7, dos pares de microforceps curvos Dumont # 5, una aguja 21 G, hemostato recto ultrafino, micro tijeras, pequeñas tijeras de disección y un porta agujas micro.
   7. Esterilizar todos los instrumentos antes de comenzar el procedimiento.
2. Preparación del animal
   1. Después de anestesiar al animal, afeitarse primero la parte inferior del abdomen, luego girar el animal hacia afuera y afeitarse y limpiar el área en la parte superior de la espalda con alcohol al 70% seguido de betadina. Aplique el ungüento del veterinario a los ojos para prevenir sequedad. A continuación, utilice un par de tijeras rectas y romas y un par de microforzadas curvas de Dumont # 7 para realizar una incisión cutánea de 1,5 cm de longitud entre las escápulas y colocar el animal en decúbito supino sobre una almohadilla térmica (37 ° C) cubierta con cortinas estériles.
   2. Finalmente, limpie el abdomen con alcohol y betadine.
3. Procedimiento quirúrgico
   NOTA: Realizar todos los procedimientos quirúrgicos bajo un microscopio de operación con una ampliación que varía de 3.15X a 20X. Después de colocar el animal en las cortinas estériles, ponerse guantes estériles. Continúe usando procedimientos estériles durante toda la cirugía.
   1. Colocar el animal en una caja de inducción y anestesiar usando isoflurano inhalado al 2% con un portador de oxígeno (1 L / min). Mantenga la anestesia durante todo el procedimiento colocando la cabeza del animal en un cono de la nariz y usando isoflurano inhalado al 2% con un portador de oxígeno (1 L / min). Comience la cirugía después de recibir un negativoDe la prueba de pinzamiento de la punta.
   2. Use un par de tijeras rectas y romas y un par de microforzadas curvas de Dumont # 7 para hacer una incisión abdominal de 1,5 cm más bajo, a través de la piel. Posteriormente, crear una incisión a juego a través de la fascia a lo largo de la línea alba y el músculo para exponer la cúpula y la mitad superior de la vejiga urinaria. Evite herir la vejiga aplicando tracción hacia arriba a cada capa de tejido usando un par de microforzadas curvas Dumont # 7. Mantenga las vísceras abdominales de la desecación añadiendo gotas de solución salina fisiológica tibia.
   3. Gire el animal sobre su lado para acceder a la incisión en la nuca. Empuje un hemostato estrecho por vía subcutánea a través de la incisión. El canal subcutáneo debe comenzar en la parte posterior, y continuar a lo largo del lado.
   4. Una vez que la punta del instrumento llegue al fondo de la caja torácica, gire la punta hacia la línea media y el interior del abdomen (habrá un leve estallido al perforar los músculos de la pared abdominal). Continúe avanzando el hemostato hasta que la punta se expone en la incisión abdominal debajo de la capa muscular. ( Figura 3 )
   5. Sujete el extremo "no acampanado" del tubo con el hemostato y retraiga lentamente la herramienta, sacando el extremo del tubo a través de la incisión en la parte posterior del cuello. Ajuste el extremo ensanchado de la tubería de manera que quede directamente por encima de la cúpula de la vejiga.
   6. Hacer un lazo suelto de 6-0 sutura de monofilamento (no absorbible) y colocarlo en la parte superior de la cúpula de la vejiga. Esta corbata se utilizará más tarde para asegurar el tubo en la vejiga.
   7. Coloque un pequeño rollo de tejido sin pelusa en el abdomen y detrás de la vejiga para ayudar a estabilizarlo y elevarlo.
   8. Prepárese para insertar el extremo ensanchado del catéter PE10 en la vejiga.
      1. En la mano no dominante, sostenga la cúpula de la vejiga con Dumont # 7 curvo microforceps y mantener este agarre hasta que el catéter se coloca en la vejiga.
      2. Utilice una aguja de calibre 21O hacer una cistotomía en el ápice de la cúpula. Suavemente sonda la cistotomía con un par cerrado de # 5 curvo microforceps para asegurarse de que el catéter puede pasar fácilmente a través del agujero.
      3. Mientras todavía sostiene la cúpula de la vejiga en la mano no dominante, coloque el extremo ensanchado del catéter PE10 en la vejiga (empuje la llamarada hacia abajo hasta el cuello de la vejiga para que no se resbale mientras se asegura).
      4. Ate la sutura monofilamento 6-0 alrededor de la cúpula de la vejiga y el tubo con la corbata situada antes de la tubería. Asegúrese de atar la sutura tan alto en la vejiga como sea posible para evitar reducir artificialmente la capacidad de la vejiga. ( Figura 4 )
      5. Alternativamente, asegure el catéter usando una sutura de cadena de monedero como sigue. Hacer una sutura suelta cadena de bolsa en la cúpula de la vejiga utilizando monofilamento 6-0. Siga los pasos 1.3.8.1 - 1.3.8.3 para realizar la cistotomía e insertar el catéter. Asegure el tubo atando la sutura de la correa del bolso. ( Figura 5 )
   9. Prueba de la permeabilidad y sellado del tubo en la vejiga mediante la fijación de una jeringa de 0,5 ml de insulina con una aguja de calibre 30 hasta el extremo distal del tubo. Llenen lentamente la vejiga con 0,1 - 0,2 ml de NaCl al 0,9% hasta que aparezca una gota en el orificio uretral, luego vacíe la vejiga por aspiración. Es importante que la vejiga se pueda llenar y vaciar.
   10. Si no se producen fugas en la cúpula, abrazadera de la vejiga con un par de microfuerzas curvadas y tire suavemente de la tubería hasta que la llamarada se apoye contra el interior de la cúpula de la vejiga.
   11. Antes de cerrar, retire el pequeño rollo de tejido y asegúrese de que la vejiga esté en su posición normal.
   12. Cierre la pared abdominal en dos capas (músculo y piel) con sutura 6-0. Es preferible aproximar el músculo recto abdominal suturando sólo los bordes de la fascia abdominal anterior (pared anterior de la vaina del recto).
   13. Para asegurar el tubo en los animales,El animal sobre su abdomen. Inserte la porción subcutánea del anclaje metálico en la incisión interescapular. ( Figura 12 ) Utilice una sutura de 6-0 para asegurar el tubo y el anclaje, rodeándolos con una sutura de colchón vertical.
   14. Asegúrese de que una burbuja de pegamento permanezca por encima y por debajo de la piel para evitar que el tubo se retire. Corte el tubo aproximadamente 2 cm por encima de la piel.
   15. Inserte suavemente el tapón de calibre 30 (paso 1.1.5) en el extremo del tubo para evitar que la orina salga.
4. Inyectar 0,5 ml de NaCl al 0,9% por vía subcutánea para hidratación. Administre analgesia postoperatoria inmediatamente después de la cirugía y mantenga durante 48 h.
   1. Coloque el animal de nuevo en su jaula situada debajo de una lámpara infrarroja. Mantenga una observación constante hasta que el animal se mueva libremente alrededor de la jaula.
5. Vigilar el animal diariamente y permitir que se recupere durante 5 días antes de la grabación.

2. Cisto despiertoOmetry Grabación

1. Preparación del programa de grabación, transductor de presión y bomba de infusión.
   1. Antes de anestesiar al animal, conecte la bomba de infusión, el transductor de presión y el giro 22 G con tubo PE50. ( Figura 6 )
   2. Abra el programa de grabación (ver tabla de materiales para un ejemplo), en un ordenador para calibrar la presión del sistema y preparar la grabación. Asegúrese de utilizar los mismos ajustes durante la calibración y la grabación.
      1. Llenar una jeringa de 20 ml con 10 - 15 ml de NaCl al 0,9% a temperatura ambiente y cargar en la bomba de infusión. Programe la bomba para infundir a una velocidad de 0,6 ml / h.
      2. Asegure el transductor de presión a la misma altura que la vejiga del animal o la parte inferior de la caja de registro.
      3. Sujete el eslabón giratorio de calibre 22 al extremo del transductor de presión (PE50 - tubo - transductor de presión para girar)
         NOTA: El eslabón giratorio se utiliza para evitar que el tubo se tuerza oS el animal se mueve.
      4. Avance la bomba de la jeringa para limpiar el NaCl al 0.9% a través del sistema. Asegúrese de retirar todas las burbujas de aire antes de calibrar.
      5. Con el programa de grabación en ejecución, utilice una regla para calibrar la presión (cm / H ₂ O). Mueva lentamente el extremo de la abrazadera PE50 de 0 a 30 cm. Ajuste el cero si es necesario.
         NOTA: La marca de 0 cm debe estar a la misma altura que el piso de la caja de registro y el transductor de presión.
   3. Suspender el giro de calibre 22 por encima del centro de la caja de registro. Asegúrese de que el fondo de la jaula permita que la orina caiga sobre el dispositivo colector de la balanza situada debajo de la jaula. Ajuste la altura de la atadura para que el ratón pueda moverse libremente alrededor de la jaula sin forzar o estirar la tubería. ( Figura 7 )
   4. Cuando termine, compruebe que el sistema y el tubo PE50 externo estén llenos de NaCl al 0,9% y que se hayan eliminado todas las burbujas de aire.
2. DeberesAción del animal para su registro
   1. Anestesiar al animal con isoflurano inhalado al 2% y colocarlo sobre su abdomen. Retire el tapón de calibre 30 y deslice el tubo PE10 (catéter de la vejiga) en el extremo de la abrazadera PE50. Utilice pegamento caliente para formar un sello hermético.
   2. Apague la anestesia y coloque el animal en la caja de registro con un piso de alambre paralelo, lo que permitirá que la orina caiga directamente sobre un dispositivo colector colocado encima de una balanza analítica. ( Figura 7 )
   3. Comience la grabación una vez que el animal está en la jaula, pero no comience a infundir. Monitoree al animal hasta que se recupere completamente de la anestesia. Una vez que la presión de la vejiga se estabilice, empiece a infundir NaCl al 0,9% a una velocidad de 0,6 ml / h.
      NOTA: Anote una nota en el programa de grabación cuando se realicen cambios. Es importante tener un registro de cuándo comienza la infusión, se producen paradas o irregularidades.
   4. Revise el sistema para ver si hay fugas y asegúrese de que el animal tenga accAlimentos y agua.
   5. Continúe la grabación en una habitación tranquila hasta que se obtengan tres ciclos de micción reproducibles.
      NOTA: El animal debe permanecer completamente inalterado durante toda la grabación. De preferencia, utilice la monitorización remota de vídeo para observar el comportamiento.

Results

No hubo diferencias significativas entre los materiales de la tubería y los diámetros en la consistencia de la subida y caída de la presión dentro del sistema durante la oclusión del tubo. El aumento de la pared de la vejiga después de la implantación del tubo intravesical fue significativo tanto para los materiales de polietileno (PE) como para los materiales de poliuretano (PU). El día 2, se desarrolló una hinchazón submucosa severa. Se ocupó de la mitad de la sección transversal de la...

Discussion

Material óptimo y tamaño de la tubería intravesical

Para determinar el efecto del diámetro del tubo en las grabaciones de presión, hemos probado diferentes tubos microfluídicos; PE50 (0,58 mm ID), poliuretano PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) y PE10 (0,28 mm ID). Para cada tubo, se registró presión con la bomba de infusión funcionando a 1 ml / h, mientras que se desplazaba rápidamente el tubo verticalmente de 0 a 30 cm. Los ensayos iniciales in vivo intentaron usar la tubería PE50, pero no t...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tubo de polietileno (PE) 10	Instech	BTPE-10	Se adapta a conectores/enchufes de 30G Tubo
polietileno (PE) 50	Instech	BTPE-50	Se adapta a conectores/enchufes de 22G
Giratorio de acero inoxidable de un solo canal de 22 G	Resorte	375/22
(9/64" OD)	Grainger	1NAH1	protege la tubería PE50 - Cortado a medida
Conector de 22 G	Instech	SP22/12
Yutaoz Pistola de pegamento adhesivo de fusión en caliente profesional	Yutaoz		Use el ajuste de baja temperatura (100 & grados; C) - Cualquier pistola de pegamento termofusible con un rango de temperatura ajustable funcionará
Surebonder DT-2010 barra de pegamento multiusos	Surebonder		Cualquier pegamento caliente para todo uso funcionará
Micropinzas curvas Dumont #5	World Precision Instruments	500232
Micropinzas curvas Dumont #7	World Precision Instruments	14188
Mini tijeras de disección - rectas	World Precision Instruments	503240
Micro pinzas antimosquitos (12,5 cm)	World Precision Instruments	500451
Tijeras de disección - rectas	World Precision Instruments	14393
Castroviejo Portaagujas	World Precision Instruments	503258
Isoflurano, USP	Phoenix		2%, caudal de 1 L/min
Buprenorfina			0,05 mg/kg
0,9% Irrigación con cloruro de sodio, USP	Baxter
6-0 Monofilamento negro de Ethilon, sutura no absorbible	Ethicon		Brida de vejiga
6-0 Vicryl violeta trenzado, sutura absorbible	Ethicon		Sutura muscular, running
6-0 Monofilamento azul Prolene, sutura no absorbible	Ethicon		Sutura cutánea, colchón vertical, enterrado interrumpido
KD Legato 210 bomba de infusión/extracción	KD Scientific		1,5 mL/h
Transductor de presión desechable	Digitimer	NL108T2
amplificador de presión	Digitimer	NL108A
Power1401-3 interfaz de adquisición de datos	Digitimer
Spike2	Cambridge Electronic Design Limited		Software de registro de presión para PC
Microscopio quirúrgico Leica MZ6 (3.2 - 20X)	Aumento de Leica Microsystems