La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

Las planarias son una poderosa organismo modelo para el estudio de madre adultas regeneración mediada por células. Estos gusanos planos de agua dulce no parasitarias poseen la capacidad de regenerar cualquier y todos los tejidos perdidos, incluyendo su sistema nervioso central y el cerebro ^1. Estudió tan atrás como la década de 1700 ^2, los avances tecnológicos en el campo planaria durante los últimos 10-15 años (como un genoma secuenciado, hibridación in situ, inmunohistoquímica, RNA de interferencia (RNAi), y transcriptómica) han actualizado este organismo modelo histórico . En concreto, las planarias recientemente han ganado popularidad como un modelo emergente para la investigación del ojo ^3.

Planarias tienen ojos prototípicos con sólo dos tipos de tejido, las neuronas fotorreceptoras y las células de pigmento; esto ha permitido la caracterización de la población de células madre del ojo y demostrado que muchos de los mismos genes que regulan vertebrado ojo desarrollo se conservan en planarias ^{4, 5.} Las copas óptica están situados dorsalmente y compuestas de los blancos, las dendritas no pigmentados de las neuronas fotorreceptoras y las células de pigmento negro semi-lunares, y los ojos inervan el cerebro a través de un quiasma óptico. Además de ser un modelo para elucidar los procesos regenerativos ^6, el ojo planaria es muy adecuado para el estudio de la evolución de los mecanismos visuales ^7, las respuestas de comportamiento a la luz (planarias muestran fototaxis negativo) ^8, y las bases neurológicas del comportamiento ^9.

La regeneración de los ojos en planarias se ha estudiado en gran parte en dos contextos principales: como parte de regeneración de la cabeza después de la decapitación ^{4, 10,} y después de la escisión de sólo los tejidos del ojo ^{11, 12 13, 14,} aunque algunos estudios también han realizado amputaciones justo detrás de los ojos (decapitación parcial) ^15. Sin embargo, todos estos métodos implican la pérdida de muchos tejidos que no sean sólo el ojo (tales como el cerebro, los intestinos y nefridios), complicando potencialmente la interpretación de los resultados. El protocolo de ablación ojo que aquí se presenta restringe la escisión de los tejidos del ojo (específicamente con exclusión de cerebro), resultando en datos que son más específicos para el ojo. Además, a diferencia de los gusanos decapitados que tienen 7-14 días para iniciar la alimentación, gusanos oculares ablación se alimentarán dentro de 24 h de ablación ^12, lo que permite experimentos de RNAi (donde RNAi se entrega a través de los alimentos) para ser performed simultáneamente.

A pesar de que la ablación del ojo es técnicamente más difícil de realizar con éxito de la decapitación, los estudios actuales que implican la extirpación del ojo no han incluido instrucciones detalladas sobre sus procedimientos. El objetivo de este artículo de vídeo es permitir a los investigadores para eliminar sistemáticamente la copa óptica planaria sin molestar a los tejidos cerebrales subyacentes y eliminar la menor cantidad de otros tejidos como sea posible. Este método puede ser utilizado tanto para la ablación simple y doble ojo y es aplicable a una amplia gama de investigaciones. Como la mayoría de los ensayos de regeneración, la ablación del ojo es muy adecuado para la combinación con las dos pantallas farmacológicos y genéticos (RNAi), así como los estudios de comportamiento. Aquí se describen los métodos para la manipulación de los gusanos, el mantenimiento de una colonia planaria, y la técnica de ablación ojo mismo.

1. Cultura Animal y Manejo

NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, una especie planarian diploides con un genoma secuenciado ^{16, 17} que se utiliza comúnmente para la investigación de regeneración. Sin embargo, el ensayo es el mismo éxito con otras especies, tales como Girardia tigrina y dorotocephala Girardia (que están disponibles en el comercio).

1. Mantener gusanos en "agua gusano" hecho a partir de sales / L de mar 0,5 g en ultrapura (o filtrada desionizada) agua. Utilice recipientes de polipropileno o de vidrio estériles para contener el agua gusano. Ver Archivo 1 para más detalles sobre la preparación de agua gusano.
   NOTA: Nunca use jabón para limpiar los contenedores (u otros suministros) como jabón es tóxico para los gusanos; en lugar limpie con etanol al 70% y dejar secar al aire. <ol>
2. Use guantes cuando se trabaja con planaria para protegerlos de la contaminación.
   NOTA: Los gusanos son muy sensibles a las toxinas y productos químicos ambientales, incluyendo el jabón, lejía, champú, acondicionador y crema para las manos.

2. Preparación

1. Dejar de alimentar a los gusanos al menos una semana antes de los experimentos.
   1. Seleccionar gusanos que no han sido criados durante ≥1 semana y al menos 5-7 mm de longitud. La transferencia de los gusanos a una placa de Petri 2/3 lleno de agua gusano, y confirmar la longitud del gusano deslizando una regla debajo del plato. medir wORMS mientras completamente extendidos y en movimiento.
      NOTA: Mientras más pequeño (5-7 mm) gusanos funcionan mejor cuando se realiza inmunofluorescencia posterior y en los análisis de hibridación in situ, gusanos más grandes (8-10 mm) son más fáciles de trabajar con - especialmente cuando aprender a realizar la ablación.
   2. Asegúrese de que los gusanos son entera, sin daños, y no recientemente regeneración.
      NOTA: La regeneración de los gusanos tendrán mucho más ligero pigmento (o no) en la cabeza y / o región de la cola en comparación con gusanos normales.
   3. Si se realiza la ARNi o tratamientos farmacológicos en gusanos, hacerlo en este momento. Si gusanos fueron alimentados como parte del tratamiento (como por RNAi), esperar al menos 7 días después de la última alimentación antes de continuar con el paso 2.2.
2. Limpiar la base del microscopio espacio de trabajo y de disección con 70% de etanol y permita que se seque por completo. Coloque el plato de gusanos seleccionados a la izquierda de la mira telescópica. A la derecha del alcance, colocar un par de # 5 fórceps, un 31 G 5 aguja de insulina / 16 pulgadas con una 1jeringa ml, y una pipeta de transferencia limpia.
   1. Asegúrese de que los instrumentos se mantienen de tocar el banco (que podría introducir contaminantes). Utilizar un elemento rígido (como por ejemplo un resto del palillo) para mantener el fórceps, agujas, y la pipeta limpia. Alternativamente, el lugar instrumentos en la parte superior de un color marrón (no blanqueada) toalla de papel limpia.
      NOTA: Estos y posteriores instrucciones están escritas, ya que pertenecen a los individuos diestros. individuos zurdos deben invertir las direcciones derecha / izquierda.
3. Junto a la zona de trabajo, colocar una caja de toallitas paño libre de pelusa, una fuente de agua fresca del gusano, y algunas pipetas de transferencia adicionales (protegido de la mesa de trabajo). Abertura agua gusano en una botella de lavado de plástico para facilitar la dispensación. También colocar una placa de marcado de 12 pocillos (o 100 mm placa de Petri) a la derecha del alcance de recogida de animales ablación.
4. Si se utiliza una placa Peltier hechos a medida para inmovilizar gusanos, coloque la placa Peltier en la depresión en tél base del microscopio de disección y ajustar la salida de la fuente de alimentación de CC hasta que la superficie de trabajo de la placa Peltier es lo suficientemente frío (normalmente ~ 5 V) .Alternatively, hacer una placa fría llenando un plato de 100 mm Petri ½ completo con agua y congelar durante al menos 24 h. Descartar la tapa y coloque la parte inferior de la placa de 100 mm en la base del microscopio de disección, a continuación, colocar la tapa de una placa de Petri de 60 mm al revés directamente en la superficie del hielo (Figura 1A).
   1. Después de que el agua ha congelado en el plato de 100 mm, un "volcán" de hielo puede aparecer en el centro de la placa. Si esto sucede, utilice una hoja de afeitar para raspar el hielo plana, para eliminar las irregularidades de la superficie.
      NOTA: Durante las cirugías el hielo se derrite, haciendo ablaciones mucho más difícil. Preparar varios platos de hielo con antelación, y reemplazar los congelados para la fusión queridos durante el ensayo tan pronto como la tapa de la placa de 60 mm comienza flotante.
5. Prepara lasuperficie de la cirugía. Cortar una pieza de 5 cm x 10 cm de película de parafina de plástico (4 cm ² si se utiliza la placa de Petri placa fría) y colocarlo en el centro del dispositivo de inmovilización. Doble un paño libre de pelusa limpie en un cuadrado de aproximadamente 2 cm ² y colocarlo en la parte superior de la película. Cortar una pieza de filtro de papel blanco 1,5-2 cm ² y colocarlo en la parte superior de la toallita. Véase la Figura 1B-1E.
   1. Mantenga la toallita plegada en su lugar con un dedo enguantado, y el uso de agua para humedecer ligeramente gusano de la toallita para asegurarse de que permanece plegada. Utilice el lado de una pipeta de transferencia para rodar la toallita plana.
      NOTA: La temperatura fría ayuda a mantener los gusanos se mueva. Trabajar "en seco" también ayuda en la inmovilización. El tejido limpie actos para absorber agua a través del papel de filtro, manteniendo el gusano húmedo durante la cirugía sin permitir que los gusanos se sequen por completo (que es letal).

3. La ablación quirúrgica

1. Utilice una pipeta de transferencia para colocar enlado e gusano dorsal arriba sobre el papel de filtro. Encienda la fuente de luz y dirigir los cuellos de cisne para que la luz se centra en el gusano. Ajustar el enfoque disección alcance y la ampliación de manera que los ojos son claramente visibles (todo el gusano no tiene que estar a la vista); 5 aumentos es un buen punto de partida. Oriente el gusano mediante la rotación de la película de parafina de manera que la cabeza está orientado hacia el investigador (hacia la parte frontal del microscopio), en ángulo de 30-40 grados a la derecha.
   1. Evitar el uso de una luz brillante para evitar el exceso de movimiento de gusano. Las planarias muestran fototaxis negativos y tratarán de evadir la luz brillante.
   2. Si el gusano se coloca lado ventral hacia arriba (con la apertura visible faríngea), utilice el lado opaco del fórceps para volver a colocar suavemente el lado gusano dorsal hacia arriba (con los ojos visibles). Evitar acercarse al animal con la punta afilada de la pinza para minimizar la posibilidad de romper a través de los tejidos blandos cuando el reposicionamiento del animal.
2. Mantenga una aguja / jeringa fresca en la mano derecha como si se tratara de una pluma (entre el pulgar y el dedo índice). Brace el pulgar izquierdo contra la placa Peltier (o placa de Petri placa fría), y utilizar el pulgar izquierdo como punto de apoyo sobre la que descansará la parte inferior de la jeringa (Figura 2A). Mire a través del microscopio, y asegúrese de que el bisel de la aguja es visible.
   NOTA: Las agujas son muy afiladas. Tenga cuidado al manipularlos. El uso de guantes de látex o nitrilo puede ofrecer alguna protección.
   1. Utilice el pulgar izquierdo para ayudar a mantener la aguja / jeringa constante durante todo el procedimiento y evitar dar la mano.
   2. Hacer un ángulo de aproximadamente 40 ° con el pulgar izquierdo y el dedo índice izquierdo (con el dedo índice en la superficie de la cirugía) para ayudar a mantener la stabile superficie de la cirugía.
3. Conel bisel de la aguja orientada hacia arriba (como una cuchara), la posición de la aguja en ángulo recto con el ojo (Figura 2B). Utilice la punta de la aguja para penetrar suavemente la capa delgada de tejido que cubre la copa óptica (blanco, región sin pigmentar) del ojo, recogiendo de derecha a izquierda. Muy retire con cuidado el tejido pigmentado situado dentro de la copa óptica, teniendo cuidado de no perforar el fondo o destruir los bordes de la copa óptica.
   1. Si el gusano ha estado en el papel de filtro para> 1-2 min en cualquier punto durante el procedimiento, añadir una gota de agua gusano para rehidratar el gusano.
      NOTA: La deshidratación aumenta la susceptibilidad del gusano de lesiones que rasga.
4. Repita el paso 3.3 hasta que todos los tejidos pigmentados de negro (células de pigmento), así como todos los tejidos blancos de la copa óptica (dendritas de las células fotorreceptoras), se eliminan. Eliminar tejidos extirpados pegados al extremo de la aguja limpiando cuidadosamente con un pañuelo de papel toallita. Si abla doble ojose desea ción, la ablación del segundo ojo en este punto.
   NOTA: Para evitar lesiones, agujas puede ser limpiado sujetando la aguja con un pañuelo de papel limpio toallita celebrada con el pulgar y el índice, a continuación, utilizando la otra mano para tirar de la aguja a través de la toallita de distancia del pulgar y el índice. Alternativamente, la aguja se puede limpiar en la superficie de un tejido toallita húmeda y se examina para la limpieza.
5. Cuando haya terminado, utilizar una pipeta de transferencia para mover el gusano a un plato de marcado que contiene agua gusano fresco. Si el análisis de datos de grupo, colocar hasta 20 gusanos en un solo 100 mm placa de Petri. Si el seguimiento de la regeneración en los mismos individuos con el tiempo, colocar 1 gusano en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Una vez que todos los gusanos se transfieren, enjuague gusanos mediante la eliminación de toda el agua gusano de los platos / pozos y la sustitución con más agua dulce gusano.
   1. Para eliminar gusanos del filtro, recargues la pipeta con una pequeña cantidad de agua sin fin y liberar el agua sobre el gusano. Esto debe levantar tél gusano fuera el papel de filtro, para ser aspirado inmediatamente en la pipeta para la transferencia.
6. Incubar experimentos a ~ 20 ° C (temperatura ambiente) protegidos de la luz y siga el proceso regenerativo.
   NOTA: Los gusanos pueden ser almacenados en una incubadora de temperatura controlada para mantener una temperatura constante, pero esto no es estrictamente necesario. La mayoría de las temperaturas ambiente variando únicamente por la 5 ° C, lo cual no afectará la capacidad del gusano de regenerarse.
7. Si se desea, fijar gusanos para inmunohistoquímica (véase las figuras 3-4) y / o en los análisis de hibridación in situ de la expresión génica. Existen diferentes métodos de fijación para inmunohistoquímica planaria ^{18, 19, 20} y la hibridación in situ ^{21, 22, 23} protocolos.
8. Cuando los experimentos se llegó a la conclusión, sacrifice viven gusanos mediante la eliminación de agua gusano de la cápsula y su sustitución con 70% de etanol. Incubar gusanos durante 3-5 min, la comprobación de los gusanos para lisar y gire grisáceo.
9. Coloque gusanos no tratados en la corriente de residuos normal una vez sacrificado. Evitar la introducción de gusanos vivos en el medio ambiente, en particular las especies no autóctonas.

Para el primero después de la cirugía 1-2 h, los animales pueden muestran una disminución de movimiento en comparación con gusanos intactos (sin embargo, todavía se moverán). Si se desea, los gusanos se comerán dentro de las 24 h de la cirugía (por ejemplo, para la alimentación de RNAi). Cuando después de la regeneración ojo en los mismos individuos en el tiempo, asegúrese de tomar una fotografía de cada gusano tanto antes de la cirugía (intacto) y en 1 h post ablación (hpa). A los 4 días después de la ablación (dpa) regenerar las células de pigmento deben ser visibles, y por 14 dpa todo el ojo se habrá completamente regenerado (Figura 3A-B). Esto incluye las neuronas fotorreceptoras y su inervación al cerebro (Figura 3C), así como la recuperación funcional del sistema visual (Figura 4A-C). Ablaciones de éxito no perturbarán los tejidos subyacentes del cerebro (Figura 4D-E), ni introducir otras lesiones al animal (Figura 5A). ablaciones fallidosincluir animales con: un excesivamente grande escisión que conecta los dos ojos (figura 5B), las lágrimas al margen lateral del animal (Figura 5C), sitios y / o una herida que asoman a través de la epidermis ventral (Figura 5D). Además, ablaciones sin éxito incluyen la eliminación incompleta de toda la cúpula óptica, compuesta tanto de los tejidos no pigmentadas blancas y las células de pigmento negro (Figura 5E-F).

Figura 1: Preparación de la cirugía. (A) Diagrama de construcción de la placa fría, utilizando la parte inferior de una placa de Petri de 100 mm (lleno de hielo) y la tapa de una placa de Petri de 60 mm (colocado boca abajo sobre la superficie de hielo). (B) Esquema de la superficie de la cirugía, a partir de una pila de (de arriba abajo) de papel de filtro blanco, un pañuelo de papel plegada húmedo limpie, y un trozo de película de parafina.(C) La cirugía configurado (por la derecha). A: microscopio de disección, B: iluminación de cuello de cisne, C: superficie de la cirugía, D: placa Peltier, E: plato de gusanos de 5-7 mm listo para la ablación, F: botella de lavado de agua gusano, G: palillo resto celebración de pipeta de transferencia limpia, H: palillo resto sustentador de la aguja / jeringa, I: palillo resto pinzas de sujeción, J: recipiente de pipetas de transferencia adicionales. Configuración de la placa (D) Peltier personalizado. Plato de configuración de la placa fría (E) Petri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Posición de las manos y la aguja / jeringa durante la ablación. (A) La colocación de las manos (para los diestros). Tenga en cuenta que el pulgar izquierdo se utiliza para apoyar la jeringa (celebradaen la mano derecha) para minimizar el movimiento. (B) colocación de la aguja en relación con el ojo del gusano. Tenga en cuenta que la superficie biselada de la aguja orientada hacia arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: separada por ablación ojos planarian regeneran. Morfología de Schmidtea mediterranea planarias regrowing ojos siguiente (A) de ablación doble ojo y (B) solo ablación ojo. (C) La inmunohistoquímica que muestra la regeneración de las neuronas fotorreceptoras (anti-arrestina) siguientes ablación ojo individual. gusanos intactos se muestran antes de la cirugía, y regenera se muestran en los días 4 y 14 después de la ablación. Para ablaciones solo ojo, el ojo izquierdo era unablated y el ojo derecho sirve como un control interno (no lesionado). puntas de flechas rojas: ojos ablación. Barras de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: La recuperación funcional del sistema visual después de la ablación. (A - C) Ensayo funcional para poner a prueba fotofobia planaria. (A) gusanos intactos evitar viajar a través de zonas de luz, como un lugar de un puntero láser verde. (B) a las 24 h post ablación, "ciegos" gusanos ablación doble ojo viajan a través de puntos de luz. (C) A los 7 días después de la ablación, gusanos ojo doble ablación han regenerado su sistema visual suficientemente para recuperar evitación luz. punta de flecha amarilla: comportamiento aberranterespuesta al. (D - E) de ablación del ojo está restringida a los tejidos de la cúpula óptica, y no perturba los tejidos cerebrales subyacentes. (D) La inmunohistoquímica que muestra la arquitectura del cerebro (anti-sinapsina) es sin cambios desde antes de la ablación a 1 h después de la ablación. (E) con hematoxilina y eosina (H & E) tinción en 1 h post ablación en una sección transversal que muestra el daño se limita en gran medida al sitio de la copa óptica separada por ablación. ojo derecho (con células de pigmento negro) sirve como control interno. puntas de flechas rojas: ojos ablación. Barras de escala = 1 mm en (AC) 1 mm, 100 m de (DE). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Los sellos de ablaciones exitosos y no exitosos. (A) ablaciones exitosos individuales y dobles oculares (en 5 minutos después de la ablación) tiene heridas que son más o menos similar en tamaño a la copa óptica originales. (B - E) ablaciones sin éxito: (b) un exceso de tejido se elimina o la herida conecta los dos ojos, (C) las lágrimas sitio de la herida y se extiende hasta el margen, (D) la herida es demasiado profunda y toques a través de la dorsal (D) a la ventral (D') lateral, y (e - F) no todos los tejidos copa óptica se eliminan, visualizado tanto morfológica (e) y por la tinción de anti-arrestina de las neuronas fotorreceptoras (F). puntas de flechas amarillas: ablaciones aberrantes. círculos de color amarillo: punto de ablación. Barras de escala = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no tienen nada que revelar.