La ablación quirúrgica de ensayo para estudio de la regeneración de los ojos en planarias

Resumen

Este protocolo se muestra cómo extirpar consistentemente ojos planarias (tazas óptica) sin molestar a los tejidos circundantes. Usando una aguja de insulina y la jeringa, ya sea uno o ambos ojos pueden ser ablacionada para facilitar las investigaciones sobre los mecanismos que regulan la regeneración ojo, la evolución de la regeneración visual, y la base neural de la conducta inducida por la luz.

Resumen

En el estudio de células madre adultas y mecanismos regenerativos, gusanos planos planarian son un elemento básico en el sistema de modelo in vivo. Esto se debe en gran parte a su abundante población de células madre pluripotentes y capacidad de regenerar todos los tipos de células y tejidos después de las lesiones que serían catastróficas para la mayoría de los animales. Recientemente, las planarias han ganado popularidad como un modelo para la regeneración de los ojos. Su capacidad para regenerar todo el ojo (compuesto de dos tipos de tejidos: células de pigmento y fotorreceptores) permite la disección de los mecanismos que regulan la regeneración del sistema visual. ablación Eye tiene varias ventajas sobre otras técnicas (tales como la decapitación o perforadora) para examinar vías y mecanismos de ojo específico, el más importante de los cuales es que la regeneración se limita en gran parte a los tejidos del ojo solo. El propósito de este artículo de vídeo es demostrar cómo eliminar de forma fiable la copa óptica planaria sin perturbar el cerebro o en los tejidos circundantes.También se describe la manipulación de los gusanos y de mantenimiento de una colonia establecida. Esta técnica utiliza un 31 G, aguja de insulina 5/16 pulgadas para sacar quirúrgicamente a cabo la copa óptica de planarias inmovilizados en un plato frío. Este método abarca tanto la ablación simple y doble ojo, con los ojos en regeneración dentro de 1-2 semanas, lo que permite una amplia gama de aplicaciones. En particular, esta técnica de ablación se puede combinar fácilmente con pantallas farmacológicos y genéticos (ARN de interferencia) para una mejor comprensión de los mecanismos regenerativos y su evolución, las células madre del ojo y su mantenimiento, y las respuestas de comportamiento phototaxic y su base neurológica.

Introducción

Las planarias son una poderosa organismo modelo para el estudio de madre adultas regeneración mediada por células. Estos gusanos planos de agua dulce no parasitarias poseen la capacidad de regenerar cualquier y todos los tejidos perdidos, incluyendo su sistema nervioso central y el cerebro ^1. Estudió tan atrás como la década de 1700 ^2, los avances tecnológicos en el campo planaria durante los últimos 10-15 años (como un genoma secuenciado, hibridación in situ, inmunohistoquímica, RNA de interferencia (RNAi), y transcriptómica) han actualizado este organismo modelo histórico . En concreto, las planarias reciente....

Protocolo

1. Cultura Animal y Manejo

NOTA: Este protocolo utiliza mediterranea Schmidtea, una especie planarian diploides con un genoma secuenciado ^{16, 17} que se utiliza comúnmente para la investigación de regeneración. Sin embargo, el ensayo es el mismo éxito con otras especies, tales como Girardia tigrina y dorotocephala Girardia (que están disponibles en el comercio).

1. Mantener gusanos en "agua gusano" hecho a partir de sales / L de mar 0,5 g en ultrapura (o filtrada desionizada) agua. Utilice recipientes de polipropileno o de vidrio estériles....

Resultados

Para el primero después de la cirugía 1-2 h, los animales pueden muestran una disminución de movimiento en comparación con gusanos intactos (sin embargo, todavía se moverán). Si se desea, los gusanos se comerán dentro de las 24 h de la cirugía (por ejemplo, para la alimentación de RNAi). Cuando después de la regeneración ojo en los mismos individuos en el tiempo, asegúrese de tomar una fotografía de cada gusano tanto antes de la cirugía (intacto) y en 1 h post ablación (hpa). A los 4 día.......

Discusión

Esta técnica de ablación ojo mejora sobre los métodos actuales (tales como perforadora) por exclusión de los tejidos del cerebro y la restricción de escisión principalmente a los tejidos del ojo. Con la práctica, esta técnica puede ser realizada por la mayoría de los individuos, de los técnicos con experiencia en microcirugía a los estudiantes universitarios sin experiencia, sino de conciencia. Se recomienda que esta técnica puede practicar muchas veces antes de usar ablaciones en experimentos, incluyendo (cuando sea po.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Sales marinas oceánicas instantáneas	Spectrum Brands	SS15-10	"Caja de 10 galones"  (peso neto 3 libras)
Toallita tisúa sin pelusa Kimwipes EX-L	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Papel de filtro Whatman #2	Sigma	WHA1002125	Círculos, 125 mm de diámetro, blanco
Jeringa de insulina Easy Touch (con aguja)	Pet Health Market	17175-04	U-100 Jeringa de 1 cc, aguja de 31 G 5/16 pulgadas Placa de
Petri de 100 mm	VWR	25384-342	100 mm x 15 mm
Placa de Petri de 60 mm	VWR	25384-092	60 mm x 15 mm
Dumont #5  pinzas	Fine Science Tools	11254-20	Inox, punta recta, 11 cm
Pipetas de transferencia	Samco Scientific	225	Graduado, bulbo grande, 7,5 mL, no estéril
Película de parafina Parafilm M	Marca	701606	Rollo de 4 pulgadas x 125 pies
Placa de cultivo de tejidos sin tratar de 12 pocillos	VWR	15705-059	Sin tratar, fondo plano, estéril, marca Falcon
Recipientes de plástico para alimentos (para colonias)	Ziploc	Rectángulo grande	de 2.25 cuartos (2.12 L), 10" x 6 -3/4" x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Vendida como Planaria "marrón"; la mayoría de las veces son G. tigrina (también conocida como Dugesia tigrina), pero a veces son G. dorotocephala (también conocida como Dugesia dorotocephala); cualquiera de las dos funcionará.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea no están disponibles comercialmente. En este momento, los animales solo se pueden obtener de laboratorios que los usan y tienen animales adicionales.
Toallas de papel marrones	Grainger	2U229	Toalla de papel plegable de 1 capa de 9-3/16 x 9-3/8", SIN BLANQUEAR
Botella de lavado (para agua de gusano), opcional	VWR	16650-275	Botellas de lavado, polietileno de baja densidad, boca ancha, 500 mL
Anticuerpo antisinapsina, opcional	Estudios del desarrollo Banco de Hibridoma	3C11	Sobrenadante
Anticuerpo antiarrestina, opcional	n/a	n/a	No está disponible comercialmente. Amable regalo de Michael Levin, Universidad de Tufts
Nalgene Lowboy garrafa con grifo (para almacenar agua de gusano), opcional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polipropileno, el perfil bajo facilita el llenado de contenedores de colonias de plástico
Placa Peltier personalizada,	máquina Williams opcional, Foxboro, MA	n/a	Detalles del diseño cortesía de Junji Morokuma, Tufts University:  La placa Peltier está construida con una bomba de calor termoeléctrica estándar (por ejemplo, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  La bomba de calor cuadrada se cubre con una fina superficie espejada y, a continuación, se coloca dentro de un orificio cuadrado de 30 mm2 en forma de plexiglás circular (~50 mm de diámetro). Esta forma es de un grosor similar al de la bomba de calor y encaja al ras en un pozo mecanizado en el centro de un disipador de calor redondo (~115 mm de diámetro). La forma/bomba de calor es  "Anclado" al fregadero con compuesto de disipador de calor a base de silicona. Los cables se enroscan a través de orificios perforados tanto en la forma como en el disipador de calor. La mitad inferior del disipador de calor está formada por un "pie" que encaja en la abertura de la placa base del microscopio.
Fuente de alimentación de CC (para placa Peltier), opcional	B & K Precision	1665	Fuente de alimentación de CC de bajo voltaje regulada, 1-18 V (CC), 1-10 amperios.
Otros suministros
Guantes
, cuchilla de afeitar
Tijeras
Visor de disección con iluminación
Soportes para palillos, opcional

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