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Artículo de método

Repetida Medición de la actividad muscular respiratoria y ventilación en el ratón modelos de enfermedad neuromuscular

13.1K vistas

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DOI:

10.3791/55599

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17 de abril de 2017

 ,  ,  , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Cincinnati, 2Department of Biological Sciences, Wright State University, 3Division of Neurosurgery, Cincinnati Children's Hospital Medical Center

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este documento presenta un método para mediciones repetidas de la ventilación y la actividad de los músculos respiratorios en un modelo de ratón libremente comportarse esclerosis lateral amiotrófica (ALS) a lo largo de progresión de la enfermedad con pletismografía de cuerpo entero y electromiografía través de un dispositivo de telemetría implantado.

Resumen

músculos respiratorios accesorios ayudan a mantener la ventilación cuando se deteriora la función del diafragma. El siguiente protocolo describe un método para mediciones repetidas durante semanas o meses de actividad de los músculos respiratorios accesorio mientras que mide simultáneamente la ventilación en un ratón no anestesiados, comportarse libremente. La técnica incluye la implantación quirúrgica de un transmisor de radio y la inserción de electrodo conduce a los músculos escalenos y trapecio para medir la actividad electromiograma de estos músculos inspiratorios. La ventilación se midió por pletismografía de cuerpo entero, y el movimiento de los animales se evalúa por vídeo y se sincroniza con la actividad electromiograma. Las mediciones de la actividad muscular y la ventilación en un modelo de ratón de la esclerosis lateral amiotrófica se presentan para mostrar cómo esta herramienta se puede utilizar para investigar cómo respiratoria cambios en la actividad muscular en el tiempo y para evaluar el impacto de la actividad muscular en la ventilación. Los métodos descritos pueden enviarasily ser adaptado para medir la actividad de otros músculos o para evaluar la actividad de los músculos respiratorios accesorio en modelos adicionales ratón de la enfermedad o lesión.

Introducción

Músculos respiratorios accesorios (ARMs) aumentar la ventilación durante los momentos de alta demanda (por ejemplo, ejercicio) y ayudan a mantener la ventilación cuando la función de diafragma se ve comprometida después de una lesión o enfermedad 1, 2. Aunque los cambios en la función del diafragma han sido bien descritos en pacientes esclerosis lateral amiotrófica (ALS) y modelos de ratón 3, 4, 5, 6, se sabe mucho menos acerca de la actividad o función de las armas en la ELA. Sin embargo, un estudio sugiere que los pacientes con ELA que reclutan ARM tienen un mejor pronóstico que aquellos con disfunción del diafragma similar que no lo hacen 7. Además, la actividad ARM es suficiente para la respiración en casos de parálisis diafragma 8. Estos estudios indican que las estrategias para aumentar la función del brazo pueden mejorar breathing en pacientes que sufren de enfermedad neuromuscular, lesión de la médula espinal, o de otras condiciones en las que se altera la función del diafragma. Sin embargo, los mecanismos que controlan el reclutamiento ARM para la respiración son en gran parte desconocidos. Los métodos para medir la función respiratoria y cambios en la actividad ARM en el tiempo en los modelos animales de la enfermedad o lesión se necesitan para estudiar cómo se reclutan ARMs, así como para evaluar terapias para mejorar el reclutamiento ARM y ventilación. Por otra parte, el aumento de la actividad de armas coincidiendo con la pérdida progresiva de la función del diafragma puede ser un biomarcador útil para progresión de la enfermedad en las enfermedades neuromusculares tales como ALS 7, 9, 10.

Este protocolo describe un método para no invasiva (después de la cirugía inicial) y repetidamente medir la actividad de los músculos respiratorios y la ventilación en, ratones comportándose despierto. grabaciones sincronizadas de electromiógrafoy (EMG), pletismografía de cuerpo entero (WBP), y de vídeo permiten que el investigador para evaluar cómo los cambios en la actividad de ARM ventilación impacto y para determinar cuando el sujeto está en reposo o en movimiento. Una ventaja importante de este método es que puede ser realizado en ratones, comportándose despierto, mientras que algunos métodos alternativos para medir EMG requiere anestesia y / o son procedimientos de terminal 11, 12, 13. El registro de la actividad EMG en ratones despiertos con el tiempo también se puede lograr a través de la implantación crónica de EMG conduce, en el que el ratón está atado por cables al sistema de adquisición 14, 15. Debido a la inmovilización de un ratón podría interferir con el movimiento o comportamiento normal y puede no ser compatible con una cámara de pletismografía estándar, el método descrito utiliza dispositivos de telemetría para transmitir de forma inalámbrica la señal EMG al sistema de adquisición. El transmisor puedeser encendido o apagado con un imán para ahorrar energía de la batería y permite mediciones repetidas de la actividad EMG durante varios meses. Este protocolo puede ser fácilmente adaptado para medir la actividad de los músculos respiratorios o no respiratorias adicionales mediante la inserción de la EMG conduce en diferentes músculos. Alternativamente, uno de los dos conductores se pueden usar para medir la actividad EEG para evaluar el estado de sueño o para identificar la actividad convulsiva 16. Esta técnica se ha utilizado con éxito para medir cambios en la actividad de ARM en reposo a lo largo de progresión de la enfermedad en un modelo de ratón de ELA y para identificar las neuronas clave que impulsan la actividad de ARM en ratones sanos 10.

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Protocolo

Los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Niños de Cincinnati Hospital Medical Center Institucional Animal y llevaron a cabo en cumplimiento de la Guía del NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación para la cirugía de implante de dispositivos de telemetría

  1. Use equipo de protección personal (es decir, exfoliantes, cubiertas para zapatos, vestido, red de pelo, mascarilla y guantes quirúrgicos).
    NOTA: Esta cirugía requiere un campo estéril.
  2. A su vez en la incubadora (servo-controlado incubador humidificador / bebé ajustado a 29 ° C) y la línea con toallas secas, blanco para permitir el calentamiento adecuado para la recuperación.
  3. Antes de la cirugía, esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con óxido de etileno y esterilizar el transmisor con un detergente enzimático y esterilizante químico (o según lo especificado por el fabricante) antes de su uso.
    NOTA: Los instrumentos quirúrgicos deben incluir # 2 fórceps laminectomía (estándar tips / recta / 12 cm) (4 veces), estrechofórceps patrón (dentada / curvada / 12 cm), tijeras separar tejido (recto / romo romo / 11,5 cm), y un soporte de escalpelo y la cuchilla. Se recomienda tener un conjunto separado de instrumentos esterilizados (dos # 2 pinzas y tijeras) reservadas exclusivamente para el manejo de los hilos del transmisor para mantener las herramientas quirúrgicas en buenas condiciones.
  4. Esterilizar todas las superficies dentro del campo quirúrgico con un desinfectante aceptable. Coloque un microscopio de disección estéreo, máquina de isoflurano anestésico, herramientas quirúrgicas, y máquinas de cortar en el campo quirúrgico (véase la Tabla de Materiales).
  5. Para mantener la temperatura del cuerpo del ratón mientras bajo anestesia, coloque una almohadilla de calefacción o manta de agua debajo de la toalla estéril frente al microscopio de disección estéreo.
  6. Asegúrese de que el transmisor es completamente funcional antes de su uso.
    NOTA: Un pequeño imán colocado dentro de 2 en del transmisor a su vez, el dispositivo de encendido y apagado. Cuando el transmisor está activado y se mantuvo cerca de un raDio fijado en 500 Hz de frecuencia AM, emitirá un ruido continuo, agudo zumbido. Para ahorrar batería, gire la batería antes de implantarlo en el animal.
  7. Prepare el electrodo conduce antes de la cirugía por el recorte de los cables distales con las tijeras reservados para el manejo de cables de modo que no es de aproximadamente 3 cm de plomo (suficiente para alcanzar el músculo de la blanco) (Figura 1A). Alternativamente, la bobina los cables proximal al dispositivo y atarlos juntos con suturas de modo que no es de aproximadamente 3 cm de plomo desenrollada.
    Nota: Guarde la parte recortada-off del electrodo conduce a fin de preparar "topes de plomo" (plástico carcasa aislada), tal como se describe en el paso 1.9. En el paso 3, los cables de transmisor se insertan a través del músculo, de modo y la parte distal, expuesta de los alambres deben ser mantenidos en su sitio y aislados usando tapones de plomo.
  8. Utilice un bisturí para cortar 0,5 cm de la cubierta de plástico sin necesidad de cortar el alambre en sí. Utilice las herramientas reservados fomanipulación de cable r para estirar los extremos de los cables 4 - 5 veces su longitud original para que se ajusten fácilmente dentro de una aguja de calibre 25 (Figura 1B-B ''). Recorte el cable expuesto de los cables de forma que son de 0,5 cm de longitud.
  9. Preparar capuchones de plomo (tubos de plástico para cubrir los extremos del cable) antes de la cirugía. Utilice un bisturí para cortar tubos de 0,25 cm de largo de la carcasa de plástico que rodea los segmentos de electrodo leads salvado de paso 1.7.
    NOTA: Se requieren cuatro tapas de plomo para cada ratón que serán sometidos a la implantación, pero lo mejor es para preparar el doble de la cantidad requerida de tapas. Después de haber preparado estéril adicional plomo CAPS es útil en caso de obtención una ventaja de la tapa no tiene éxito en el primer intento.
  10. Registre el número de serie del transmisor insertado y guardar el embalaje original con la información de calibrado. Cada transmisor tiene diferentes calibraciones de frecuencia para la grabación EMG; introducirlos en el software de adquisición para obtener EMG aceptablesgrabaciones.

2. Preparación del ratón para la cirugía

  1. Elige el ratón deseada para la implantación (es decir, SOD1 (G93A) o control) y pesar el animal.
    NOTA: La edad recomendada y el peso para un ratón (macho o hembra) sometidos a esta cirugía es P56 - P120 y ≥ 24 g, respectivamente.
  2. Anestesiar al ratón bajo 3,5% de isoflurano con una tasa de 2 L / min de oxígeno de flujo. Realizar una pizca dedo del pie y una pizca de cola para asegurarse de que el ratón está totalmente anestesiado.
  3. Una vez anestesiados, retire el ratón en el cuadro desplegable y mantener la anestesia a través de un cono de la nariz estableciendo el nivel de isoflurano al 1,5% y la tasa de flujo de oxígeno a 1 L / min. Realizar una pizca dedo del pie y / o pellizcar la cola para asegurarse de que la anestesia se mantiene.
  4. Aplicar pomada oftálmica lubricante para evitar que los ojos se sequen durante la cirugía.
  5. Afeitar el ratón para exponer un sitio quirúrgico entre la oreja y el hombro (Figura 1C).
  6. clip de las uñas de los pies ipsilateral al sitio quirúrgico para reducir la posibilidad de que el ratón tirando de los cables o causar heridas al rascarse durante el proceso de curación.
  7. Alternate limpiando el sitio quirúrgico, primero con desinfectante y luego con isopropanol. Repetir 2 veces más.

3. La implantación del dispositivo de telemetría al Registro escaleno y trapecio EMG Actividad

  1. Colocar el animal debajo de un microscopio de disección, en su lado en la parte superior de una almohadilla estéril que cubre una almohadilla de calefacción, y asegurar el cono de la nariz en su lugar con cinta adhesiva. Tenga en cuenta que es mejor para implantar el lado derecho de reducir la señal de ECG se origina en el corazón.
    NOTA: Controlar la respiración y ajustar los niveles de isoflurano, si es necesario, para mantener una tasa de respiración regular y plano quirúrgico apropiado de anestesia.
  2. Tirar de la extremidad anterior hacia el pie ipsilateral a lo largo del torso.
    NOTA: Esta posición desplaza la escápula en sentido caudal, proporcionando acceso quirúrgico a los sCalene y trapecio músculos.
    1. Tome las pinzas curvas romos, contener la pata delantera ipsilateral al sitio quirúrgico, y la cinta de la pata en su lugar (Figura 1C). Utilice cinta adhesiva fuerte adhesivo quirúrgico para asegurarse de que la pata es seguro para la duración del procedimiento.
  3. Póngase un par de guantes quirúrgicos. Utilice el bisturí para realizar una incisión oblicua, aproximadamente 2 cm de largo, entre el hombro y la oreja (línea roja en la Figura 1C).
  4. El uso de dos # 2 fórceps laminectomía, una en cada mano, tire hacia atrás la almohadilla de grasa y se extendió aparte los músculos trapecios y platisma para exponer la fascia que cubre los músculos esternocleidomastoideo y escaleno (Figura 1D y E).
  5. Utilizar el músculo esternocleidomastoideo pálido y nervio frénico como puntos de referencia para identificar los músculos escalenos. Tenga en cuenta que el nervio frénico corre paralela a los músculos escalenos, mientras que el esternocleidomastoideo se encuentra inferior. Los músculos escalenos corren oblicuamente desde las vértebras cervicales a las costillas bajo el músculo trapecio. Cables biopotenciales serán insertados en el músculo escaleno anterior, que puede ser identificado como el músculo que va adyacente al nervio frénico (Figura 1F y G).
    NOTA: Precaución. Esta zona es muy vascularizado, y se debe tener cuidado para evitar el corte de la arteria subclavia. Evitar daños en el nervio frénico y el plexo braquial.
  6. Una vez que los músculos escalenos y trapecio se han identificado (Figura 1G), hacer un bolsillo subcutáneo para el transmisor en la parte posterior del animal, entre las escápulas.
    1. Utilice la tijera de separación de tejido, insertar las puntas romas de las tijeras justo debajo de la piel y se extendió hasta que la apertura de un bolsillo que es de aproximadamente 1,25x la anchura del transmisor se forma (Figura 1H).
      NOTA: El transmisor debe insertarse con mínima resistencia, pero la viruelay no debe ser tan grande que el transmisor puede moverse por sí mismo. Si el bolsillo es demasiado pequeño, el transmisor podría roce contra la piel, causando irritación que puede llevar al animal para arañar la piel y / o tirar de los cables fuera. Si el bolsillo es demasiado grande, seromas podrían forman, o el transmisor podrían migrar a una posición desfavorable.
  7. Enjuague con agua tibia solución salina, estéril e inserte el transmisor con el lado más plano contra el músculo. Coloque el transmisor de modo que quede plana y los cables emergen del bolsillo, paralelos entre sí en lugar de trenzado (Figura 1I). Curl cualquier exceso de longitud de cable por debajo del dispositivo y ponerla plana.
  8. Ejecutar los cables del transmisor a los músculos escalenos y trapecio de manera que los dos juegos de cables bipotenciales queden planas y paralelas entre sí.
  9. Usa los fórceps laminectomía para separar el escaleno anterior de los músculos que rodean e insertar una aguja de calibre 25 a través de la mus escalenoCLE, perpendicular a las fibras musculares.
    1. Inserte un plomo en la punta de la aguja y luego tirar de la aguja hacia fuera del músculo, dejando atrás el plomo insertado en el músculo hasta el aislamiento del cable (Figura 1J y K). Registro que conductores de color se insertan en la cual el músculo.
  10. Coloque una pequeña gota de adhesivo de cianoacrilato en el extremo expuesto del alambre, cerca del músculo donde se inserta el plomo, y deslice rápidamente la tapa de plomo sobre el alambre de modo que no hay ningún cable está expuesto entre la tapa de plomo y el músculo (Figura 2A y B).
    NOTA: Aunque es una práctica aceptada para garantizar EMG conduce con cianoacrilato 17, 18, un método alternativo es para asegurar la tapa de plomo en su lugar mediante un nudo de sutura de seda alrededor de ella.
  11. Recorte el exceso distal de alambre a la tapa y aplicar una gota de adhesivo de cianoacrilato para el extremo del conductor de la tapa / alambre. Dará el pegamentotiempo para polimerizar antes de la liberación (Figura 2C y D).
  12. Siga los mismos pasos (pasos 03/10 a 03/12) para insertar la opuesta polaridad de los cables en paralelo a la primera en el mismo músculo, 1 - 2 mm de distancia de la primera plomo.
  13. Repetir los pasos 03/10 a 03/12 para insertar cables en el músculo trapecio, ubicadas justo anterior al músculo escaleno (Figura 1L y M).
  14. Asegúrese de que los conductores de cables se fijan en su lugar y que sólo hay suficiente holgura en los cables para el animal para llevar a cabo los movimientos del cuerpo sin tirar de los cables. Asegúrese de que cualquier exceso de longitud de plomo no empuja contra la piel, ya que esto podría causar irritación que puede incitar al animal a cero o tirar de los cables fuera. Volver a colocar los cables, si es necesario, para evitar las posibles molestias.
  15. Retire con cuidado la cinta manteniendo pulsada la extremidad anterior. Tire de la almohadilla de grasa de la espalda sobre el músculo y lo utilizan para cubrir los cables insertados. Cerrar la incisión con adhesivo de cianoacrilato por burlaslos colgajos de piel de nuevo juntos de modo que las líneas de incisión hacia arriba. Pellizcar una porción de los colgajos de piel junto con las pinzas curvas y aplicar una pequeña línea de adhesivo de cianoacrilato a lo largo de esta línea.
  16. Inyectar por vía subcutánea 0,1 ml de carprofeno para aliviar el dolor post-operatorio mientras el animal está todavía bajo anestesia.
    NOTA: Continuar para administrar 0,1 ml de carprofeno vez al día durante 1 - 2 días después de la cirugía y, a continuación, según sea necesario después de eso.
  17. Retire el animal de la ojiva y colocarlo en una jaula limpia en la incubadora pre-calentado hasta que el animal está despierto y moviéndose alrededor de la jaula voluntariamente. Mantenga el animal en la incubadora durante al menos 15 min después, el seguimiento de sus movimientos y estado de alerta.

4. Cuidado posoperatorio

  1. animales de la casa después de la cirugía por separado. Proporcionar animales de curación con gel de dieta y una botella de agua.
  2. Monitorear el animal para el primero 30 min después de la cirugía. Compruebe en el animal al menos cada hora fo 5 h después de la cirugía. En los días siguientes a la cirugía, marcar al menos dos veces al día.
  3. Mira para la necrosis, la infección a lo largo de la incisión y dentro de la cavidad del cuerpo que contiene el implante (es decir, calor, hinchazón y enrojecimiento), y la formación de seroma.
    NOTA: Estas señales se producen en la primera semana después de la cirugía. Un saludable curado animales un mes después de la cirugía se muestra en la figura 1N. Aunque registros de EMG pueden realizarse inmediatamente después de la implantación, los animales se les da al menos una semana para curar antes de grabar EMG y la pletismografía, como señales de ECG pueden ser altos inmediatamente después de la implantación.

5. La adquisición de señales simultáneas electromiografía y la pletismografía

  1. Encienda todos los equipos de adquisición, incluyendo el flujo de sesgo.
    NOTA: La velocidad de flujo para los ratones se establece típicamente a 1,0 L / min.
  2. Calibre la cámara (s) pletismografía utilizando un medidor de flujo.
    NOTA: Compruebe periódicamente el chambe pletismografíaRS para asegurar que los sellos no están agrietadas o rotas. Escudo una semana las juntas de goma con un lubricante tal como grasa de vacío una vez para mantener su buen estado.
  3. calibración del transmisor de entrada según lo especificado por el fabricante.
  4. Coloque el ratón en la cámara de pletismografía durante al menos 1 h para aclimatarse que antes de la grabación de EMG y la pletismografía. El uso de múltiples cámaras, es posible grabar de un ratón mientras que el siguiente ratón se aclimatando en una segunda cámara. No encienda el transmisor durante el periodo de aclimatación, a fin de conservar la energía de la batería (Figura 1O).
  5. Antes de la grabación (pero después de la calibración), gire en el transmisor mediante la colocación de un imán fuerte dentro de 1 en del animal implantado; una luz roja en la parte frontal del receptor indicará cuando el transmisor está encendido.
  6. Comience la adquisición usando el menú desplegable con la etiqueta "Adquisición" y elegir la opción "iniciar la adquisición." Aunque la duración de la grabación puedevariar de experimento, una pletismografía típico y grabación de EMG dura de 1 - 3 h.
    NOTA: El transmisor tiene una velocidad de muestreo intrínseca de 240 Hz. Un ritmo más rápido de 500 Hz se encuentra en el software para interpolar entre los puntos y para proporcionar una forma de onda suave. El filtro de paso bajo (que sirve como un filtro anti-alias) y el filtro de paso alto en el implante especifican el ancho de banda de 1 a 50 Hz para este dispositivo de telemetría. 60-Hz A / C interferencia no contribuye a un exceso de ruido en la señal EMG debido a que los implantes son alimentado por batería y el animal protege el implante y conduce de campos eléctricos. Pletismografía, EMG, y el vídeo se sincronizan automáticamente en tiempo real a través del software de adquisición.
  7. Cuando se termina la adquisición, apagar el transmisor con un imán y eliminar el animal de la cámara.
  8. Si iniciar otra grabación, limpiar la cámara, introduzca en las nuevas calibraciones del transmisor de la siguiente animal, y comenzar la segunda grabación. Si la aletaISHED con adquisición para el día, apagar el transmisor, limpiar la cámara de la pletismografía, y apague todos los equipos de adquisición y el flujo de sesgo.

figure-protocol-1
Figura 1. Implantación de telemetría Dispositivo para Medir EMG músculos respiratorios. Transmisores (A) de telemetría con dos pares de biopotencial conduce a medir EMG. Leads pueden recortarse a la longitud deseada (parte inferior) o enrolladas y metidas debajo del transmisor (parte superior). (B) del transmisor conduce. (B') conduce con aislamiento de plástico recortada para exponer los cables y para hacer tapones de plomo (recuadro). (B '') conduce con alambres estirados 4 - 5 veces su longitud original. Leads deben ser recortadas de manera que son de 0,5 cm de largo (no mostrado). (C) de ratón preparado para la cirugía, con el sitio quirúrgico afeitado y correctamentepata posicionado. La línea de puntos rojo indica el sitio de la incisión. (D) los músculos superficiales situadas por debajo de la almohadilla de grasa y la fascia, visto después de la incisión inicial. T = trapecio. S = esternocleidomastoideo. P = platisma. Flecha amarilla = nervio frénico. Diagrama (E) de la historieta de los músculos y del nervio frénico se muestran en (D). Fórceps deben utilizarse para difundir aparte los músculos trapecios y platisma para alcanzar el músculo profundo escaleno, mostrada en (F) y (G). (F) Señales utiliza para identificar la ubicación de la escaleno y el trapecio. Esta imagen muestra la arteria subclavia (flecha blanca), el plexo nervioso / braquial frénico (flecha negro), y el músculo esternocleidomastoideo pálido (flecha amarilla). (G) la historieta que representa la ubicación de los músculos más profundos (es decir, escaleno medio, escaleno anterior, y SCM), la arteria subclavia, y el nervio frénico. El escaleno posterior no es visible. Se puede acceder sólo cuando la superficiAL músculos (en D y E) se separan. (H) Hacer un bolsillo para el transmisor con las tijeras de punta roma. (I) transmisor insertado en la cavidad subcutánea, con los cables en paralelo posicionado emergentes del bolsillo. (J) La inserción de la aguja de calibre 25 en el escaleno, perpendicular a las fibras musculares, para hacer un túnel para el conductor de cable. (K) Ambos cables insertados en el músculo escaleno. tapas de plomo son posicionados en el extremo y pegadas en su lugar. (L) de inserción de la aguja de calibre 25 en el trapecio, perpendicular a las fibras musculares, para hacer un túnel para el conductor de cable. (M) Todos los cuatro conductores insertados en los músculos trapecios y escalenos y en posición plana antes del cierre de la incisión. (N) se recuperaron completamente de ratón, con la vía subcutánea transmisor colocado en la parte posterior. (O) pletismografía grabar simultáneamente, la actividad EMG del músculo, unand vídeo utilizando una cámara de pletismografía (flecha amarilla), telemetría almohadilla de recepción (flecha roja), y la cámara (flecha negro), respectivamente. Un flujo de sesgo multifunción está conectada a la cámara de pletismografía a través de un tubo de plástico (flecha azul) para suministrar oxígeno al ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-protocol-2
Figura 2. Asegurando Caps de plomo con cianoacrilato adhesivo. (A) Aplicar una pequeña gota de cianoacrilato (círculo púrpura) al cable expuesta de la proximal de alambre de electrodos y cables (E) al músculo. (B) rápidamente deslice la tapa de plomo preparada (LC) en el cable expuesto sobre el adhesivo de cianoacrilato de manera que la tapa de plomo se sitúa directamente adyacente al músculo. (C) Se quita una pequeña porción del extremo distal de la tapa de plomo y alambre de modo que no hay electrodo expuesta presente que no está aislado con plástico. (D) Aplicar una pequeña gota de adhesivo de cianoacrilato para el extremo de la tapa de plomo. Retire el extremo distal recortado-off de la tapa de plomo del animal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Análisis de ARM EMG y la pletismografía

  1. Abra el software de análisis y revisar el archivo de interés (ir a "Archivo" y seleccionar "Abrir archivo de revisión"). Filtrar las señales EMG utilizando un filtro de paso alto de 30 Hz con un clic derecho en el trazado EMG, la elección de "Analizar Atributos", destacando la "Atributos avanzados 1" ficha y cambiar el filtro de paso alto de 30 Hz.
    NOTA: Este paso filtrado elimina no discriminatoria, información de baja frecuencia.
  2. Localizar áreas de inactividad ratón mediante inspección visual basado en la falta de movimiento en el archivo de video sincronizado y la falta de cambios grandes e irregulares de presión debido al movimiento en la traza pletismografía (cuadro rojo en la Figura 3A); la inactividad se produce cuando el ratón está dormido o despierto, pero todavía.
  3. Identificar combates EMG independientemente para cada músculo.
    1. Rectificar e integrar la señal de EMG se filtró sobre 30 ms (Figura 4).
      Nota: debido a ratones respiran a una velocidad de 3 Hz, cada respiración está representada por aproximadamente 11 valores integrados.
    2. Determinar la amplitud de línea de base EMG promediando los valores rectificados y integrados asociados con la señal de EMG durante un período de 3 s cuando el ratón está inactivo y la traza pletismografía muestra eupnea (respiración normal) (Figura 4).
    3. Identificar "episodios" de actividad definido por al menos 3 valores rectificados e integrados consecutivos que son al menos un 5aumento 0% por encima de la señal de línea de base EMG (determinado en la etapa 6.3.2).
      NOTA: tres valores consecutivos representan una ventana de 90 ms, pero algunos episodios contendrán más de 3 valores por encima del umbral y tendrán una duración de más de 90 ms.
    4. Utiliza el vídeo y la pletismografía traza sincronizada para excluir episodios que se producen durante suspiros (Figura 3B); sniffing (Figura 3C); o los movimientos del ratón volitivas, tales como giro de la cabeza o de la preparación.
    5. Repita los pasos 6.3.1 - 6.3.4 para el segundo muscular.
  4. Calcular la frecuencia de combate para cada músculo. Record a) el tiempo de tiempo y extremo de comienzo de cada periodo inactivo y b) el tiempo de cada combate se produjo usando los criterios anteriores. Suma el tiempo de inactividad total. Se divide el número total de episodios por el total de minutos de tiempo inactivo en el transcurso de la sesión de grabación para calcular la frecuencia de combate.
  5. Determinar si los cambios en la ventilación se asocian con la activación de la m grabadauscles.
    1. Seleccionar los parámetros de respiración que se desea medir (por ejemplo, el pico de flujo inspiratorio, el volumen corriente, el volumen minuto, y respiraciones por min).
      NOTA: Todas las selecciones posibles se pueden encontrar en el menú desplegable de configuración P3 en "parámetros derivados."
    2. Identificar las respiraciones que se producen durante la actividad EMG combate y de las respiraciones que se producen durante la actividad de referencia EMG (Figura 4).
    3. Crear segmentos que abarcan analizador respiraciones pletismografía que se asocian con la actividad EMG combate y crean segmentos analizador independientes que están asociados con la actividad EMG basal. Asegúrese de establecer el tipo de análisis a "Analizador Seg."
      NOTA: Esta selección se encuentra en el menú desplegable de configuración P3 en "Configuración de reducción de datos."
    4. Marcar el comienzo de cada segmento analizador con un evento haciendo clic derecho en la traza de pletismografía. Especificar un combate que contiene segmentos analizador como "Evento 1" en el menú desplegable y specify los segmentos de analizador de línea de base como "Evento 2" para distinguir las dos clases de segmentos.
    5. En el menú "Funciones", salvo la "Sección de Marcas" y "marcas derivadas de datos." Bajo el menú Datos Analizador, salvar el "Archivo Analizada opinión" y "Analizada Derivado de datos."
      NOTA: Los parámetros de respiración seleccionados para cada respiración individuales se encuentran en la hoja de datos derivado marcas en la pestaña "derivaciones".
    6. Comparación de los parámetros respiratorios para las respiraciones que se producen durante los episodios brazo (marcados como Evento 1) frente a respiraciones que se producen durante la actividad de línea de base (marcado como Evento 2) para determinar si la actividad muscular se asocia con cambios en la ventilación.

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Resultados

El protocolo descrito se usó para implantar un dispositivo de telemetría y para grabar escaleno y trapecio EMG, WBP, y el vídeo de un ratón SOD1 (G93A) modelo ALS. Períodos en los que el animal es inactivo (por ejemplo, no se mueve) se identificaron utilizando la grabación de vídeo y confirmados por la falta de actividad de movimiento relacionada en la traza WBP (Figura 3A). Períodos inactivos incluyen tiempo pasado en REM o no REM del sueño, así como el tiempo ...

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Discusión

El procedimiento ha demostrado aquí permite la medición no invasiva (después de la implantación quirúrgica inicial del transmisor) de la actividad de los músculos respiratorios y la ventilación durante muchos meses en el mismo animal. Esta técnica tiene varias ventajas sobre técnicas estándar EMG en ratones anestesiados: 1) los experimentos requieren un menor número de ratones y proporcionan la capacidad de grabar datos del mismo sitio en un solo ratón a través de etapas de la enfermedad (en lugar de utilizar varios rat...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

El apoyo a este trabajo fue proporcionado por el administrador Premio Hospital Medical Center de Niños de Cincinnati a SAC y una beca de formación de los NIH (T32NS007453) a VNJ

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
B6.Cg-Tg (SOD1*G93A)1 Gur/JJackson Laboratory4435
Cámara de PletismografíaBuxco Productos Respiratorios/ Data Sciences International601-1425-001
Receptores de Telemetría (Modelo RPC-1)Data Sciences International272-6001-001
Bomba de Flujo de Polarización (Modelo BFL0500)Data Sciences International601-2201-001
ACQ-7000 USBData Sciences InternationalPNM-P3P-7002XS
Dataquest A.R.T. Data Exchange MatrixData Sciences International271-0117-001
Nuevo sistema de análisis de PonemahData Sciences InternationalPNM-POST-CFG
Ponemah Physiology Platform Acacquisitionn software v5.20Data Sciences InternationalPNM-P3P-520
Paquete de análisis de pletismografía de respiración completa sin restricciones de Ponemah v5.20Ciencias de Datos InternacionalPNM-URP100W
Sistema de software Ponemah configuradode Datos InternacionalPNM-P3P-CFG
Módulo de análisis (URP)Ciencias de datos InternacionalPNM-URP100W
Amplificador universalde Datos Internacional13-7715-59
Placa de sincronizaciónCiencias de Datos Internacional271-0401-001
Cable de sincronizaciónCiencias de Datos Internacional274-0030-001
Transductor de presión BuxcoData Sciences International600-1114-001
Medidor de flujoData Sciences International600-1260-001
Imán y radio incluidos en el kitde inicio F20-EETData Sciences International276-0400-001
Cámara de video Axis P1363   Data Sciences International275-0201-001
Terg-A-ZymeFisher Scientific50-821-785Detergente enzimático
ActrilMinntech Corporation78337-000
Microscopio de disección estéreo esterilizante químico (modelo MEB126)Leica10-450-508
Humidificador servocontrolado/incubadora infantilOHMEDA Ohio Care Plus6600-0506-803
TL11M2-F20-EET TransmisoresSciences International270-0124-001
Dumont #2 Pinzas de laminectomía - Puntas estándar/rectas/12 cm (x2) Fine Scientific Instruments11223-20Para la manipulación de alambres
Dumont #2 Pinzas de laminectomía - Puntas estándar/Rectas/12 cm (x2)Fine Scientific Instruments11223-20Para cirugía
Pinzas de patrón estrecho - Dentadas/curvas/12 cmFine Scientific Instruments17003-12
Tijeras de resorte - Corte resistente/Rectas/Afiladas/12,5 cm/6 mm FiloInstrumentos científicos finos15124-12
Tijeras separadoras de tejidos - Rectas/Romanas-Romanas/11,5 cmFine Scientific Instruments14072-10
Tijeras finas - Corte resistente/Curvas/Afiladas-afiladas/9 cm Fine Scientific Instruments14058-11Para cortar alambres y recortar clavos
Mango de bisturí #3World Precision Instruments500236
Hoja de bisturíFine Scientific Instruments10010-00Para la preparación de tapas de plomo
Polysorb Trenzado Sutura absorbibleCovidenD4G1532XPara enrollar cables de transmisor
Gluture Zoetis Inc.6606-65-1Adhesivo de cianoacrilato
Punta deslizante de jeringa de 3 mL - SoftVitality Medical118030055
Aguja de 25 g (x2)Becton Dickinson and Co.305-145
Aplicadores con punta de algodónHenry Schein Animal Health100-9175
Andis Juego de cortadoras de pelo de corte fácilAndis049-06-0271Maquinilla de afeitar eléctrica vendida en Target
IsofluranoHenry Schein Animal Health29404Anestésico 
Alcohol isopropílico 70%Priority Care 1MS070PC
Dermachlor 2% Exfoliante médico (clorohexidina 2%)Butler Schein55482
Lágrimas artificialesHenry Schein Animal Health48272Lubricante Pomada oftálmica
Grasa al vacíoDow Corning Corporation1597418
Manta de aguaJorVetJOR784BN
Ciencias Ciencias Data

Referencias

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