Un método para preparar las células de insectos y las infectan con el baculovirus con el propósito de la producción de proteínas recombinantes proteinand mCD1d generar tetrámeros mCD1d.
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Artículo de método
Un método para la producción de proteínas recombinantes en células de insecto mCD1d.
En este artículo
Resumen
Resumen
CD1 proteínas constituyen una tercera clase de moléculas presentadoras de antígeno. Son glicoproteínas de superficie celular, expresado en aproximadamente 50 kDa glicosilada cadenas pesadas que son covalentemente asociados con beta2-microglobulina. Se unen los lípidos en lugar de péptidos. A pesar de su estructura confirma la similitud de las proteínas CD1 a MHC de clase I y clase II que presentan las moléculas de antígeno, la ranura mCD1d es relativamente estrecha, profunda y altamente hidrofóbica y tiene dos bolsillos vinculante en lugar de los bolsillos de varios superficiales descritas para las clásicas MHC- codifican moléculas presentadoras de antígeno. Con base en sus secuencias de aminoácidos, como un surco hydrobphobic proporciona un ambiente ideal para la unión de antígenos lipídicos.
El T asesinas naturales (NKT), las células utilizan su TCR de reconocer glicolípidos obligado o presentados por CD1d. Las células T reactivas a los lípidos presentados por CD1 han estado involucrados en la protección contra las enfermedades infecciosas y autoinmunes y el rechazo del tumor. Por lo tanto, la capacidad de identificar, purificar y hacer un seguimiento de la respuesta de CD1-reactiva de células NKT es de gran importancia. La generación de tetrámeros de alfa galactosil ceramida (a-GalCer) con CD1d tiene una visión significativa sobre la biología de las células NKT. Tetrámeros construido a partir de otras moléculas CD1 también se han generado y los nuevos reactivos han expandido enormemente el conocimiento de las funciones de las células T reactivas de lípidos, con uso potencial en el control de la respuesta a las vacunas basadas en lípidos y en el diagnóstico de enfermedades autoinmunes y otras los tratamientos.
Protocolo
I. Descongelar las células
Tome el frasco de helado de TN5 las células, y descongelar en un baño de agua a 37 ° C. Añadir 5 ml de medio de insectos Express (Invitrogen, número de catálogo-10486) en el frasco de 25 cm TC 2. Tenga en cuenta que Express cinco viene sin glutamina, necesita agregar 10 ml de estreptococos pluma 100X glutamina o glutamina solo a 1 lt medios de comunicación. Añadir TN5 células en ella y se incuba durante 30 minutos en una incubadora de 27 ° C. Luego, se aspira el medio con DMSO suavemente sin molestar a las células unidas al fondo del frasco. Añadir 5 ml de medio fresco.
II. Crec....
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Discusión
En este procedimiento, se muestra cómo iniciar, crecer, infectar células de insecto y cómo el título de la baculovirus uso de estas células. Los aspectos más importantes de este procedimiento son el mantenimiento de las células y saber el título exacto de baculovirus. Una vez que se han generado CD1 tetrámeros, que puede ser utilizado como una herramienta poderosa para el análisis de glicolípido las células T reactivas. Sistemas de baculovirus también se utilizan ampliamente para producir proteínas recombinantes, incluyendo tetrámeros de MH.......
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios | |
|---|---|---|---|---|
| Express Five SFM | Medio sin suero | Invitrogen | 10486025 | |
| High Five TM | Células de insecto | Invitrogen | B855-02 | |
| Glutamina Pen strep | Antibióticos | Invitrogen | 10378-016 | |
| Matraz TC de 25 cm2 | Plástico | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| Matraz TC de 175 cm2 | Matraz con sello de tapón | Fisher Scientific | 10-126-8 | |
| Matraz Erlenmeyer | Matraz para cultivo celular | Fisher Scientific | 07 200 672 | |
| Concentrador YM 30 | 30,000 MWCO | EMD Millipore | UFC 903096 | |
| Equipo FPLC | GE Healthcare | |||
| Enzima y tampón BrA | Kit de biotinilación | Avidity | BIRA500 | |
| Columna de agarosa Ni-NTA | Columna para purificación de proteínas con etiqueta His | GE Healthcare | ||
| Columna de desalación | Para eliminar la sal de la proteína | GE Healthcare | ||
| Columna MonoQ | Cromatografía de intercambio aniónico | GE Healthcare | ||
| Columna S200 | Cromatografía de exclusión por tamaño | GE Healthcare | ||
| alpha-Galcer | Glicolípido | |||
| Estreptavidina-PE | Para conjugar proteínas | Molecular Probes, Life Technologies | S-866 |
Referencias
- Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers. J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).
- Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M.
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Reimpresiones y permisos
