Técnica laparoscópica para la Recolección de serie del hígado y los ganglios linfáticos mesentéricos en macacos

Resumen

A continuación, describimos una técnica laparoscópica mínimamente invasivo para el muestreo de serie del hígado y los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) en macacos que permite una mayor frecuencia de muestreo, y reduce el potencial de complicaciones quirúrgicas en comparación con la realización de una laparotomía.

Resumen

Los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) y el hígado están expuestos a microbios y productos microbianos del tracto gastrointestinal (GI), haciéndolos inmunológicamente único. El tracto GI y MLN asociado son sitios de replicación viral temprana en la infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el MLN son probables sitios reservorio importante que albergan células infectadas de forma latente, incluso después de la terapia antirretroviral prolongada (ART). El hígado se ha demostrado que desempeñan un papel importante en la respuesta inmune a los lentivirus y parece jugar un papel importante en la eliminación del virus de la circulación. primates no humanos (NHP) los modelos de VIH y Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) imitan estrechamente estos aspectos de la infección por VIH y el muestreo longitudinal de serie de sitios primarios de la replicación viral y las respuestas inmunes asociadas en este modelo ayudará a elucidar eventos críticos en la infección, patogénesis y el impacto de diversas estrategias de intervención en estos eventos. Currtécnicas ent publicado hasta la muestra de hígado y MLN juntos implican cirugía y / o la necropsia importante, lo que limita la capacidad de investigar estos sitios importantes en una manera en serie en el mismo animal. Hemos descrito previamente una técnica laparoscópica para la recogida del MLN. A continuación, describimos una técnica laparoscópica mínimamente invasivo para el muestreo longitudinal de serie del hígado y MLN a través de las mismas dos ubicaciones de los puertos necesarios para la colección de MLN. El uso de los mismos dos puertos minimiza el impacto a los animales como no se requieren incisiones adicionales. Esta técnica se puede utilizar con aumento de la frecuencia de muestreo en comparación con la cirugía abdominal mayor y reduce el potencial de complicaciones quirúrgicas y asocia las respuestas inflamatorias locales y sistémicas que podrían complicar la interpretación de los resultados. Este procedimiento tiene el potencial de facilitar los estudios con modelos NHP al tiempo que mejora el bienestar animal.

Introducción

El tracto gastrointestinal (GI) es la mayor superficie de la mucosa del cuerpo y se expone a una gran variedad de antígenos derivados de los alimentos, los agentes patógenos, y comunidades bacterianas endosymbiotic comúnmente referido como el microbioma ^{1, 2.} Los ganglios linfáticos mesentéricos (MLN) recubren el tracto GI y son un sitio principal de la función inmune para promover respuestas inflamatorias o tolerogénicas hacia estos diversos antígenos. La organización física del MLN crea un sistema compartimentado que pueda responder a los antígenos de forma local sin provocar respuestas sistémicas ^3. Del mismo modo, la sangre de los desagües del tracto GI hacia el hígado a través de la vena portal antes de volver a la circulación, y por lo tanto está expuesto a los microbios y productos microbianos que han translocados desde el tracto GI en la lámina propia y entrado en el torrente sanguíneo ^4. El hígado también funciona como un órgano linfoide secundario unand tiene un gran número de células inmunes, incluyendo macrófagos especializados, para eliminar microbios translocados ^{5, 6.} Por lo tanto, el MLN y el hígado son los órganos inmunes primarias expuestas a comensal y bacterias patógenas en el tracto GI, así como el medio de antígenos procedentes de otras fuentes, haciéndolos única e importante desde una perspectiva inmunológica.

El MLN son sitios críticos para la evaluación de los efectos virológicos e inmunológicos del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o una infección patógena del virus de inmunodeficiencia en simios (SIV), y es probable que participan en la difusión temprana de SIV después de la exposición intrarrectal. Tejido linfoide asociado al intestino es conocido por ser un sitio importante de persistencia de la replicación del VIH, a pesar de un control efectivo de la viremia por las terapias antirretrovirales modernos (ART) ^7. En modelos de infección SIV, MLN han demostrado ser importantes reservorios de virus latentes y puedenser el depósito primario ^{8, 9.} El hígado también es importante en la infección lentiviral como se evidencia por la acumulación de células T CD8 ⁺ específicas de SIV en los hígados de los macacos durante la infección aguda SIV ^10. Además, es el principal órgano responsable de eliminar el virus de la circulación ^11.

Infección por VIH y SIV se asocian con alterada microbiota GI, se rompen la integridad epitelial GI, y el aumento de la translocación de los microbios y productos microbianos de los dos puntos en la periferia y la circulación ^{12, 13.} Estos procesos se asocian con la activación inmune local y sistémica, y el aumento de la morbilidad y mortalidad en individuos infectados por el VIH ^14. En la infección por SIV, bacterias translocados se han observado en el MLN ^15, mientras que la acumulación de micproductos Robial en el hígado se ha demostrado que resulta en la inflamación y el daño al órgano ^16. Por lo tanto, en el contexto de VIH y las infecciones SIV, el MLN y el hígado pueden ser altamente informativo para la comprensión de los procesos inflamatorios conducidos por bacterias GI-residente.

A continuación, presentamos una técnica laparoscópica mínimamente invasivo para el muestreo de serie de la MLN y el hígado en primates no humanos (NHP). Demostramos rendimiento éxito de esta técnica en dos macacos rhesus hembra sanos (RMS), el muestreo de cada animal dos veces, con 160 días entre cada cirugía. Vamos a utilizar estas muestras para evaluar y comparar las poblaciones clave de leucocitos y linfocitos dentro de cada órgano utilizando citometría de flujo, y demostrar datos muy consistentes entre los dos puntos de tiempo.

Protocolo

Los animales fueron alojados y atendidos en la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Laboratorio Animal Care International (AAALACi) instalaciones acreditadas, y todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo a los protocolos aprobados por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC) de la Universidad de Washington y National Primate Research Center de Washington.

1. Surgical Preparación, anestesia y analgesia

1. La sedación y la inducción
   1. Sedar al macaco con una inyección intramuscular de 10 mg / kg de ketamina y 0,015 mg / kg de dexmedetomidina (combinados en una jeringa). Asegurar la ausencia de reflejos de retirada antes de retirarlos de la jaula.
   2. Intubar al animal, y mantener al animal en un plano de anestesia general usando isoflurano (1.0 - 2,5%) y 100% de oxígeno. Ver referencias para mayor información con respecto a la intubación y anestesia general en macacos ^17,ref "> ^{18, 19.}
2. Anestesia apoyo y seguimiento
   1. Insertar un catéter venoso periférico y proporcionar líquidos isotónicos intravenosos (tales como lactato de solución de Ringer) a una velocidad de 5 ml / kg / h a lo largo de la anestesia y la cirugía. Aplicar lubricante ocular estéril para evitar la sequedad de la córnea.
   2. Proporcionar analgesia, tal como una formulación de liberación sostenida de buprenorfina (0,2 mg / kg, por vía subcutánea).
      NOTA: un NSAID (tales como meloxicam o ketoprofeno) también puede estar provista durante la recuperación anestésica, siempre que el protocolo experimental permite la administración de AINE y que animal es normotensa y bien hidratado durante la anestesia.
   3. Monitor de profundidad de la anestesia (por ejemplo, tono de la mandíbula), la frecuencia cardíaca, frecuencia respiratoria, EKG, presión arterial, la oxigenación del pulso, final de la espiración CO _2, y la temperatura corporal a lo largo de la anestesia y la cirugía.
      NOTA: Cuando se insufla el abdomen, el animal puede hypoventilate.Proporcionar ventilación mecánica si la tasa de respiración disminuye, o el extremo de marea niveles de CO ₂ está por encima de 45 mmHg.
   4. Después de la cirugía, administrar atipamezol (0,15 mg / kg, intramuscular) para la inversión de dexmedetomidina.
3. Preparación quirúrgica
   1. Realizar múltiples enemas de agua caliente para reducir el volumen de las heces en el colon para ayudar a la visualización y manipulación intestinal durante el procedimiento ^20.
   2. Use máquinas de cortar con una cuchilla número 40 para eliminar el vello del campo quirúrgico. Afeitarse desde la cresta costal hasta el pubis y desde la izquierda a flanco derecho.
   3. Asépticamente preparar el campo quirúrgico utilizando antisépticos apropiados, tales como alternando clorhexidina-alcohol o povidona-yodo-alcohol friega.
   4. Coloque el animal en la mesa de operaciones en su dorso, a una mitad de camino ángulo entre dorsal y decúbito lateral derecho. Atar los brazos y las piernas con una cuerda en una posición extendida. Proporcionar una chlorhexi definitivacenar y prep alcohol vez que el animal se mueve a la sala de operaciones y está posicionada para la cirugía.

2. Cirugía

Nota: Para obtener más información de la laparoscopia en animales pequeños, véase la referencia ^21.

1. Laparoscópica Preparación Instrumento
   1. Coloque el animal con un paño fenestrado estéril.
   2. Con la ayuda de un asistente no estéril, envuelva la cámara digital con la cortina de la cámara estéril y conecte el cable a la torre. Una el endoscopio rígido a la cabeza de la cámara.
   3. Una el cable de luz estéril para el alcance rígido y conectar el cable a la fuente de luz. Balance de blancos de la cámara de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   4. Una el tubo insuflador estéril para el insuflador.
2. Entrada laparoscópica
   1. El uso de un bisturí # 15, hacer un ~ 5 mm incisión a través de la piel a la profundidad de la musculatura abdominal, approximately 1 - 2 cm a la izquierda del ombligo.
   2. Con la mano no dominante, levantar la pared abdominal craneal al sitio de la incisión. Con la mano dominante, coloque la punta de la aguja de Veress través de la incisión y el ángulo de la punta cranealmente.
      NOTA: El ángulo de penetración de la aguja de Veress variará en función de la condición corporal de los animales. Por ejemplo, en un animal de grasa, tendrá que ser insertado casi perpendicular a la pared abdominal de la aguja Veress. En un animal delgado, la aguja de Veress debe estar en ángulo cranealmente para reducir el riesgo de poner en contacto las vísceras.
      1. Sosteniendo el eje (no el cubo) de la aguja de Veress, empuje firmemente la aguja para penetrar la pared abdominal en la cavidad abdominal. Un distinto "clic" y disminución de la resistencia se sintió como la punta afilada penetra en el peritoneo y la punta roma de los resortes de aguja de Veress hacia delante en la cavidad abdominal.
         NOTA: Si la aguja pasa apropiadamente en ºe cavidad abdominal, habrá poca resistencia cuando es avanzada y retirada de 1 - 2 cm.
   3. Conectar el tubo insuflador CO ₂ a la aguja y abrir la llave de paso. Presurizar el abdomen a no más de 10-12 mmHg para crear un neumoperitoneo.
      NOTA: El abdomen ha alcanzado la insuflación ideal cuando se ha expandido de forma simétrica y hay una pérdida del contorno afilado normal de los bordes costales. La presión debe proporcionar un espacio adecuado para la inserción de la cánula / trocar sin riesgo de contacto con las vísceras.
3. La colocación de la cánula
   1. Una vez que el abdomen está totalmente insufla, hacer un ~ 5 - mm incisión 7 con una hoja de bisturí # 15 a través de la piel del abdomen craneal izquierda a la musculatura abdominal ~ de 2 - 4 cm caudal a la última costilla.
   2. Colocar un conjunto de trocar-cánula 5 mm a través de la incisión de la piel y el ángulo de TI ~ 45 - 60 grados caudomedially. Penetrar en la cavidad abdominal a una profundidad de 1-2 cm. screw la cánula roscada en el abdomen mediante la rotación de la cánula (~ 0,5 - 1 cm más) a una profundidad de 1,5 - 3 cm, y retirar el trocar.
   3. Retire el tubo insuflador de la aguja de Veress, apague la llave de paso, y retirar la aguja. Conectar el tubo insuflador a la cánula y abrir la llave de paso de mantener un neumoperitoneo a no más de 10 - 12 mmHg.
   4. Insertar el endoscopio rígido a través de la cánula y en la cavidad abdominal.
   5. Bajo visualización cámara, continuar haciendo una pequeña incisión con una hoja de bisturí # 15 a través de la musculatura abdominal y el peritoneo en la incisión de la piel anterior utilizado para la inserción de la aguja de Veress. La cámara se utiliza para visualizar el lado abdominal de la incisión para evitar los vasos y minimizar el sangrado.
      NOTA: Asegúrese de que la incisión a través del músculo y peritoneo es lo suficientemente grande como para facilitar la entrada de la sonda y exteriorización del mesenterio (~ 0,5 cm). Una incisión más grande puede ser requerido para exteriorizar mesentery en los animales con exceso de grasa mesentérica.
   6. Colocar el animal en posición de Trendelenburg ²¹ con los pies elevados en aproximadamente 15 - 30 grados por encima de la cabeza. Esto es opcional pero puede permitir un acceso más fácil a los ganglios linfáticos mesentéricos de colon, como el pequeño tracto intestinal se moverá a una posición más craneal.
4. Mesentérica biopsia del ganglio
   1. Bajo visualización cámara, inserte una sonda sólida a través de la incisión abdominal hecha en el paso 2.3.5.
   2. Coloque la sonda entre el omento y el intestino y el uso de un movimiento de barrido para barrer suavemente el epiplón fuera del intestino para permitir la visualización del mesenterio subyacente. El uso continuado del movimiento de barrido del caudal a craneal del abdomen. El omento se puede colocar en el derecho abdomen craneal por lo que está fuera del campo operatorio.
   3. Utilice la sonda para mover el colon descendente hacia la pared abdominal izquierda o hacia la derecha. Esto permitirá una mejor visualización de tque mesenterio para ayudar en la búsqueda de los ganglios linfáticos mesentéricos.
   4. Utilice la sonda para barrer a través del mesenterio para localizar los ganglios linfáticos mesentéricos a lo largo de los vasos de colon y mesentéricos.
      NOTA: Los nodos del colon corren a lo largo del borde mesentérico del colon, los nodos cólicos izquierdos se puede encontrar cerca de los puntos de ramificación de los vasos, y los nodos mesentérica inferior se puede encontrar a lo largo de los vasos mesentéricos inferiores. Los ganglios linfáticos mesentéricos son fácilmente visibles en los animales delgados. Cuando son enterrados en la grasa mesentérica que a menudo dan un poco elevada, brillantez en el mesenterio suprayacente y pueden ser más de un color marrón más grisáceo que rodea a continuación, grasa mesentérica. Además, los ganglios linfáticos mesentéricos tienden a estar a lo largo de los vasos linfáticos y la vasculatura mesentérica.
   5. Una vez que se identifica un ganglio linfático, eliminar la sonda e inserte los fórceps Maryland trinquete en la cavidad abdominal. Usa los fórceps para captar el mesenterio adyacente al nodo de destino. Tire del mesenterio hacia el INCISion, y quitar el alcance de la cánula.
   6. Apague el insuflador y dejar abierta la llave de paso de la cánula para despresurizar el abdomen para facilitar la exteriorización del mesenterio. Tire del mesenterio exterior del cuerpo a través de la incisión. Una vez exteriorizado, sujete el mesenterio con pinzas hemostáticas curvas de mosquitos o fórceps pulgar para garantizar el acceso a través de la incisión.
   7. Identificar el nodo (s) de linfa en el mesenterio exteriorizada mediante la palpación para el ganglio linfático más firme y / o la visualización directa del color más gris o apariencia nodular del ganglio linfático.
      1. Una vez identificados, hacer una pequeña abertura (~ 3 - 5 mm) en el mesenterio cerca del nodo utilizando pinzas hemostáticas curvas. adjuntos gratuitos para el mesenterio mediante disección roma con las pinzas hemostáticas curvas. Ligar la vasculatura con sutura monofilamento 4-0 no absorbible como sea necesario. Utilice disección cortante con un escalpelo para eliminar el nodo de linfa. Coloque los nodos en Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640) enhielo.
   8. Examine el mesenterio exteriorizado de sangrado. Si se observa sangrado, proporcionar hemostasis apropiada mediante la oclusión de los vasos con pinzas hemostáticas o ligaduras (4-0 no absorbible monofilamento de sutura), o mediante el uso de cauterio. Soltar el mesenterio y insuflar el abdomen de nuevo a 10 - 12 mmHg para permitir que el mesenterio para volver a la cavidad abdominal.
   9. Repetir los pasos 2.4.1 a través de 2.4.8 para obtener biopsias de ganglios linfáticos adicionales.
5. Biopsia hepatica
   1. Devolver la tabla a una posición horizontal.
   2. Colocar una cánula roscado en el abdomen a través de la incisión previamente utilizado para la recogida de la biopsia del ganglio linfático (incisión hecha en el paso 2.3.5). Asegúrese de que la incisión es lo suficientemente grande (~ de 5 - 7 mm) para permitir la colocación de la cánula sin la inserción del trocar. Insertar el endoscopio rígido a través de esta cánula hacia la cavidad abdominal craneal y visualizar el abdomen craneal y el hígado.
   3. Bajo visión de la cámara, inserte la biopsia forceps través de la cánula colocan previamente en el abdomen craneal izquierda (incisión hecha en el paso 2.3.1).
   4. Para obtener biopsias de hígado, colocar las pinzas de biopsia debajo del margen lóbulo hepático seleccionado con la parte móvil de la mandíbula hacia el hígado, abrir las pinzas, y permitir que el margen de caer en las mordazas abiertas. Asegúrese de que no epiplón es entre el hígado y fórceps de biopsia. Ajustar la posición del fórceps y cerrar el instrumento sobre la región de muestra deseado.
      1. Mantenga la presión durante aproximadamente 20 - 30 s para asegurar la hemostasia. Con las pinzas cerradas, retirar la muestra tirando suavemente las pinzas a través de la cánula. Esto rasgar suavemente la biopsia del hígado. Coloque las biopsias de hígado en medio RPMI 1640 en hielo.
         NOTA: El tamaño biopsia de hígado es de aproximadamente 5 mm x 2 mm x 2 mm utilizando 5 mm pinzas de biopsia.
   5. Examine el sitio de la biopsia para la hemorragia mediante la visualización de la cámara. Si se observa la hemorragia, coloque una solución salina moistened bastoncillo de algodón estéril a través de la cánula y se aplica presión a la zona de la biopsia. Alternativamente, el paquete de los sitios de la biopsia con espuma de gel estéril para ayudar a la hemostasia.
   6. Repetir los pasos 2.5.3 a través de 2.5.5 para obtener biopsias de hígado adicionales.
      NOTA: Aquí, se recogieron 3 biopsias por animal por procedimiento, que es suficiente para todos los análisis posteriores.
6. Cierre quirúrgico
   1. Examinar la cavidad abdominal de sangrado.
      NOTA: Esto no ha ocurrido hasta la fecha. Sin embargo, si se observa sangrado excesivo, determinar el lugar de la hemorragia y proporcionar hemostasis apropiada a través de la presión con hisopos de algodón estériles o el uso de espuma de gel.
   2. Apague el insuflador y abrir las llaves de paso de la cánula. Aplicar presión manual suave al abdomen para despresurizar completamente la cavidad peritoneal. Retire las cánulas.
   3. Cierre cada una de las incisiones de la pared abdominal con 1 a 2 suturas interrumpidas simples por sitio. Se recomienda 4-0 sutura absorbible.
   4. Realizar un bloque chapoteo mediante la colocación de bupivacaína 0,1-0,3 cc en cada incisión para la analgesia local antes de cierre de la piel.
   5. Cierre la piel con 1 - 2 suturas interrumpidas enterrados (se recomienda 4-0 sutura absorbible) por sitio. goma de tejido se puede aplicar.

3. Hígado Procesamiento de biopsia y análisis de linfocitos

1. Almacenar varios trozos de tejido hepático (aproximadamente 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de tamaño) en tubos de crioconservación, en una solución de almacenamiento de ARN preferida, y 10% de formalina para el futuro molecular y análisis histológicos.
   1. Colocar las biopsias hepáticas restantes en 50 ml de RPMI 1640 suplementado con 1x penicilina / estreptomicina, 40 mg / ml de una solución de colagenasa comercialmente disponibles, y 4 mg / ml de ADNasa en un 250 ml vaso de plástico estéril con una tapa. Se agita vigorosamente usando una barra de agitación magnética y una placa de agitación durante 1 h a 37 ° C.
2. Distribuir uniformemente vertiendo el tejido digerido. Gramoind el tejido digerido (de la etapa 3.1.1) más de dos 70 micras filtros encajan en dos tubos de 50 ml cónicos en una sola suspensión celular utilizando el extremo de un ml jeringa estéril 5. Llevar el volumen de ambos tubos de 50 ml en medio RPMI 1640 suplementado con 10% de suero fetal bovino y 1x penicilina / estreptomicina (R10).
3. Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar el sobrenadante. Concentrar las células en un único tubo cónico de 50 ml mediante la suspensión de las células de ambos tubos en 5 ml R10 y combinar en una sola 50 ml tubo cónico. Se ajusta el volumen a 50 ml usando R10. Recuento de células utilizando un hemocitómetro para determinar el rendimiento celular.
   1. Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Resuspender las células en 1 ml de R10, distribuir de manera uniforme en dos 5 tubos de poliestireno ml de fondo redondo y llevar el volumen de cada tubo a 4 ml con R10, segmentación para> 500.000 células en cada tubo.
4. Centrifugar las células a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar los supernatant y resuspender el sedimento de células en 4 ml de tampón fosfato salino (PBS). Centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C.
5. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 100 l de PBS por agitación suavemente. Añadir 1,5 l de una mancha de células muertas puede arreglar. Incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
6. Añadir los siguientes anticuerpos de tinción de superficie sin diluir en los títulos recomendados por el fabricante: CD45-PerCP (D058-1283 clon), CD3-PE-CF594 (clon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clon 2H7), CD4-BV605 ( OKT4 clon), CD8-BV570 (clon RPA-T8), y CD14-BV785 (clon M5E2). Se incuba a 4 ° C durante 20 min.
7. Añadir 4 ml de PBS y centrifugar a 840 xg durante 6 minutos a 4 ° C. Decantar el sobrenadante y resuspender las células en 250 l de 1% de paraformaldehído en PBS.
   Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Use equipo de protección personal adecuado.
8. Analizar las poblaciones celulares utilizando un citómetro de flujo como se describe en la referencia ^22.

Resultados

Métodos detallados para el procesamiento de MLN laparoscópicamente recogida, así como los rendimientos celulares, y frecuencias de leucocitos en estos órganos se ha informado anteriormente ^13. La Figura 1 muestra el rendimiento celular y viabilidad datos que comparan el MLN y biopsias de hígado recogidas en dos puntos de tiempo de 160 días aparte de dos RMs mujeres sanas que utilizan esta técnica laparoscópica. Se encontró que el rendimiento celular de la MLN fue significativamente mayor que en el hígado (P = 0,0021), con un promedio de 33,5 x 10 ⁶ y 6,74 x 10 ⁶ células obtenidas, respectivamente. tinción de células muertas y el análisis por citometría de flujo indicó que> 90% de las células aisladas a partir de ambos órganos fueron viables.

El uso de citometría de flujo, se evaluó y comparó la abundancia de leucocitos y linfocitos en el MLN y el hígado. Un esquema de gating representante para el hígado se muestra en la + células y, finalmente, las células CD3 ^+. De la población CD3 ^+, evaluamos la abundancia de células CD4 ⁺ y T CD8 ^+, mientras que se evaluó la abundancia de CD14 ⁺ y células CD20 ⁺ a partir de las poblaciones CD3. Flujo Representante citometría de gráficas que muestran CD45 ⁺ y CD3 ⁺ poblaciones del MLN y el hígado tanto de los animales en el día 0 y el día 160 se muestran en la Figura 3, mientras que la figura 4 muestra de leucocitos y linfocitos abundancias de los dos muestreos de los dos animales. El MLN mostraron significativamente mayor abundancia de células CD45 ⁺ que hizo el hígado (media 76,9% y 7,66% de células viables, respectivamente, P = 0,0002). No es sorprendente que el MLN mostró proporciones significativamente más altos de células T CD3 ⁺ (P0; 0,0001) y las células T CD4 ⁺ (P = 0,0004). A la inversa, el hígado fue significativamente enriquecido para los leucocitos CD14 ⁺ en comparación con el MLN (P = 0,0036). El MLN mostró un promedio más alto de las células T CD8 ^+, pero esto no fue significativo. Sorprendentemente, para estos dos animales demostraron ambos órganos abundancias similares de células CD20 ⁺ B. Los rendimientos celulares y abundancias de diferentes leucocitos y linfocitos subconjuntos de la MLN en este estudio confirmado previamente reportados valores ^23.

Figura 1. celular total Rendimiento (parte superior) y la viabilidad celular (parte inferior) de en serie recogió MLN y el hígado biopsias. El MLN mostró significativamente más altos rendimientos de células que hizo el hígado. Sin embargo, ambos tipos de muestras proporcionan células amplias para los análisis. La viabilidad celular, medida por cytom flujoetrically usando una mancha amina de células muertas que se puede fijar, mostraron que ambos tipos de muestras típicamente produjeron> 90% de viabilidad celular después de la disociación del tejido. Las barras de error representan la desviación estándar entre las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2. Representante Citometría de Flujo Estrategia Gating. En primer lugar, se excluyeron células agregadas, seguido por la selección de células sólo viables después de la tinción utilizando una mancha amina de células muertas que se puede fijar. A continuación, se seleccionaron los leucocitos CD45 ^+, seguido de la selección de las células T CD3 ^+. De la población CD3 ^+, se analizaron las células CD4 ⁺ y T CD8 ^+. Desde el CD3 ^- población, se analizaron CD14 ⁺ y células CD20 ^+. Thi gating estrategia s también fue utilizado para el MLN. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Parcelas Citometría de Flujo de MLN y de hígado de dos animales en sentido longitudinal. MLN y muestras de hígado se recogieron 160 días aparte para ambos animales. (A). MLN CD45 ⁺ células (leucocitos); Las células (B) de hígado de CD45 ⁺ (leucocitos); Células ⁺ (células T) (C) MLN ⁺ CD3; Células (D) Hígado CD3 ⁺ (células T). Tanto para los animales, el MLN mostró una mayor proporción de CD45 ⁺ y las células CD3 ⁺ en comparación con el hígado. A través del tiempo, las frecuencias de estas poblaciones fueron similares para ambos animales.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4. Las frecuencias de células CD45 ⁺ (izquierda) y varios de leucocitos y subpoblaciones de linfocitos (derecha) a través de 23 muestreos individuales. Los MLNs muestran significativamente mayores frecuencias de CD45 ^+, CD3 ^+, y CD4 ⁺ células, mientras que el hígado mostró significativamente mayores frecuencias de leucocitos CD14 ^+, lo que demuestra las funciones únicas de cada órgano. Las barras de error representan la desviación estándar entre las muestras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Aquí, demostramos una técnica mínimamente invasiva para la recogida en serie de MLN y biopsias hepáticas que tenía una tasa de éxito del 100% en estos y otros animales que no se describen en este estudio. Además, el uso de esta técnica en los mismos animales a través del tiempo no se ha asociado con todos los eventos adversos. De hecho, no ha habido complicaciones resultantes del uso de esta técnica en otras cohortes de animales que fueron infectados con el VIS, simio / virus de la inmunodeficiencia humana (Shiv), o virus Zika (datos no publicados). Del mismo modo, esta cirugía ha demostrado su eficacia incluso en los animales que habían sido sometidos previamente a cirugía abdominal mayor, y en animales trombocitopénicos (datos no publicados). Hemos demostrado que estas muestras se pueden recoger a través de los mismos dos puertos invirtiendo la ubicación de la cámara cuando se cambia de MLN a hígado evitando la necesidad de incisiones adicionales. Factores que afectan a la colección de MLN se ha informado anteriormente ^13.

Hasta cuatro colecciones de 3 MLN y 3 biopsias de hígado cada uno se han realizado a través del tiempo en animales individuales sin complicaciones, los cambios en las tasas de éxito, o alteraciones de los datos recogidos. Además, esta técnica de recogida / hígado laparoscópica MLN se ha combinado con éxito con otros procedimientos tales como la colección de los LN periféricos, biopsias GI superior e inferior endoscópicos, aspiración de médula ósea, la recogida de líquido cefalorraquídeo, y la punción venosa en el mismo evento anestésico permitiendo amplia evaluación de respuestas virológicas e inmunológicas de una manera en serie (datos no publicados).

Todo el procedimiento típicamente tarda 30 - 45 min para completar y se lleva a cabo a través de dos ~ 0,5 incisiones cm. En los animales obesos, puede ser necesario hacer una incisión más grande (~ 1 - 1,5 cm) para recuperar MLN a través de y puede requerir tiempo adicional para completar. Los animales con extensa grasa mesentérica a menudo requieren una importante experiencia a differentiate MLN de la grasa circundante. MLN se encuentran a menudo a lo largo de la vasculatura mesentérica y parece ser más frecuente cerca de los puntos de ramificación de los vasos. Un aspecto crítico de esta técnica es que requiere el MLN selecciona para que tenga suficiente movilidad en el mesenterio a ser exteriorizado través de la incisión abdominal. Como resultado de ello, esta técnica no puede ser utilizado para recoger MLN cerca de la raíz del mesenterio. Debido a la ampliación, es a veces más fácil identificar MLN con la cámara, y captar en las proximidades de la MLN puede ayudar con la localización e identificación del nodo, una vez que se exterioriza.

El uso de la posición de Trendelenburg no siempre se requiere para la recolección de MLN, y si MLN se puede recuperar fácilmente sin el uso de la posición de Trendelenburg puede hacer biopsias hepáticas más fácil ya que evitará que los órganos se muevan cranealmente. A veces, después de la colocación en posición de Trendelenburg, el hígado se desplaza hacia arriba contra el diafragma y el mosto ser suavemente manipulado en su posición antes de la recogida de la biopsia. A medida que la colocación de los puertos para la recogida MLN está a la izquierda, las biopsias hepáticas son típicamente tomados de los lóbulos del hígado medial y lateral izquierda a la izquierda, ya que están más cerca de la cánula.

Recogieron MLN y biopsias de hígado proporcionan amplios rendimientos de células para una variedad de análisis de aguas abajo y mostraron una alta viabilidad de las células recogidas. Aquí, las células se tiñeron para el análisis de citometría de flujo de poblaciones de leucocitos y linfocitos, y fueron aclarados diferencias clave entre estos dos órganos inmunes importantes. Por ejemplo, el MLN se altamente enriquecido para las células T CD4 ⁺ en comparación con el hígado, debido a la importancia de la MLN como puntos centrales de recogida y difusión respuestas inmunes adaptativas, así como a la importancia de T CD4 ⁺ para la gestión inflamatoria y respuestas tolerogénicas al medio antígenos derivados de la ingesta alimentaria y microorganismos GI-residentes = "xref"> 24. Sin embargo, el hígado fue significativamente enriquecido para CD14 ⁺ leucocitos en comparación con el MLN. CD14 se expresa predominantemente en monocitos y macrófagos y es un componente clave del complejo receptor de lipopolisacárido bacteriano (LPS) ^25. De hecho, el aumento de las concentraciones plasmáticas de CD14 soluble se asocian con la translocación microbiana y la activación inmune en VIH y SIV infecciones patógenas ^26. Por lo tanto, las frecuencias más altas de leucocitos CD14 ⁺ en el hígado probablemente el resultado de una mayor carga bacteriana en este órgano cuando se compara con el MLN.

Aquí, demostramos una técnica quirúrgica rápido y mínimamente invasivo para la recogida en serie de MLN y biopsias de hígado utilizando sólo dos pequeñas incisiones para la entrada laparoscópica que no ha conducido a ningún resultados adversos. Estas muestras proporcionan una vía útil para evaluar los procesos inmunológicos, virológicos y microbiológicos clave que tienen place en el MLN y el hígado, que están separados y único de inmunidad sistémica. Del mismo modo, las biopsias hepáticas son críticos para la evaluación a largo plazo de los efectos del VIH / SIV, terapias de fármacos, y los microbios translocados, que a menudo se combinan para inducir daño hepático significativo ^16. Además, debido a que el MLN y el hígado son órganos inmunes expuestos a la microbiota gastrointestinal, la capacidad para evaluar la inmunidad en estos órganos a través del tiempo proporciona una excelente plataforma para la comprensión del papel que juega el microbioma en el mantenimiento de la homeostasis inmune anfitrión. Tomados en conjunto, la evaluación del hígado y MLN es de gran importancia en el contexto de la vacuna y eficacias terapéuticas, el aclaramiento reservorio viral SIV, y la inmunidad de la mucosa general. La capacidad de recoger estas muestras a través de un método mínimamente invasivo significa que hay menos riesgo de la inflamación relacionada con el procedimiento de la que existe con técnicas publicados actualmente y un menor impacto sobre la fisiología de los animales. En el future, vamos a evaluar el potencial de combinar la colección de MLN y en el hígado con la colección de bazo a través de las mismas dos ubicaciones de los puertos para permitir la toma de muestras de otra parte importante y distinto del sistema inmune que ha sido demostrado que desempeñan un papel significativo en una serie de modelos de enfermedad.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Lágrimas Artificiales Lubricante Pomada Oftálmica	Patterson Veterinaria	97-890-8152
Cuidado Prioritario Clorhexidina 2% Exfoliante	Patterson Veterinaria	07-842-6153
Vedco Alcohol, Isopropílico 70%	Patterson Veterinaria	07-869-6434
Vedco Vetadina Exfoliante	Patterson Veterinaria	07-869-6772
Hospira Ringer's lactado 250 mL	Patterson Veterinary	07-800-9325
Laparotomía para adolescentes Paño quirúrgico	Medline DYNJP3004
Access 40 L Insufflator	Dyonics	7205832
300XL Fuente de luz de xenón	Dyonics	7206084
460P 3 – Cámara digital CCD con cabezal	dinámico	72200086
cortina de cámara universal, 7" x 96"	Servicios de soporte de endoscopia	ESS-6920
Guía de luz universal, 7.5 ft	Servicios de soporte de endoscopia	EE. UU. OU225
Tubo insuflador	asistencia para endoscopia	TM-102
Visor rígido multipropósito, 2,7 mm x 187,5 mm, 0 grados	Servicios de asistencia para endoscopia	B30-0007-00
Funda de examen y protección para endoscopio de 2,7 mm x 187,5 mm con una llave de paso fija	Servicios de apoyo a la endoscopia	B10-0025-00
Visor rígido, 5 mm x 300 mm	Servicios	de apoyo a la endoscopiaB30-0071-00
Aguja Veress, 2 mm x 80 mm	Servicios de apoyo para endoscopia	8302.08
Sonda sólida con marcas, 5 mm x 320 mm	Servicios de apoyo para endoscopia	8383.661
Maryland Pinzas de agarre y disección con mango de trinquete de doble acción, 3,5 mm x 240 mm;	Servicios de apoyo para endoscopia	8390.2054
Pinzas para biopsia, 3,5 mm x 310 mm	R. Wolf	8391.4063
Cánula roscada de plástico con puerto insuflador, 3,5 mm x 60 mm	Servicios de apoyo para endoscopia	8903.072
Cánula roscada de plástico con puerto insuflador, 5,5 mm x 60 mm	Servicios de apoyo para endoscopia	8919.333
Endoscopia de trocar de punta roma	Servicios de soporte	8903.101
Endoscopia	trocar de punta piramidal	8903.121
CO2	Airgas	CD USPE
RPMI 1640	Fisher Scientific	SH30027FS	con L-glutamina
Solución de estabilización de ARN	ThermoFisher Scientific	AM7021
Penicilina-estreptomicina	Sigma Aldrich	P4333
Liberase TM Grado de investigación	Sigma Aldrich	5401119001	Solución de colleganse disponible comercialmente
Dnase I de páncreas bovino	Sigma Aldrich	D5025
70 µ Filtros de células m	Morganville Scientific	CSS0200
5 mL Jeringa	BD	309646
50 mL Tubos de centrífuga cónicos	ThermoFisher Scientific	339652
Suero fetal bovino	Fisher Scientific Fisher Scientific	SH3007003
5 mL Tubos de poliestireno de fondo redondo	Fisher Scientific	14-959A
PBS	Fisher Scientific	SH3025601
LIVE/DEAD Aqua Kit de tinción de células muertas fijables	ThermoFisher Scientific	L34957	Tinción de células muertas con amina
CD45-PerCP (clon D058-1283)	BD Biosciences	558411
PE-CF594 Ratón anti-Hu CD3 (clon SP34-2)	BD Biosciences	562406
BV605 Ratón Anti-Hu CD4 (clon OKT4)	Biolegend	317438
APC-H7 Ratón anti-Hu CD8 (clon SK1)	BD Biosciences	560179
PE-Cy5 Ratón anti-Hu CD20 (clon 2H7)	BD Biosciences	555624
BV786 Ratón Anti-Hu CD14 (clon M5E2)	BD Biosciences	563698
16% PARAFORMALDEHÍDO AQ SOLUTN	Fisher Scientific	50-980-487
LSR II Citómetro de flujo	BD	NA