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FRET de alta precisión a nivel de molécula única para la determinación de estructuras de biomoléculas

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DOI:

10.3791/55623

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13 de mayo de 2017

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1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

En este artículo

Resumen

Aquí se presenta un protocolo para experimentos FRET de alta precisión en el nivel de una sola molécula. Además, esta metodología puede usarse para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando del receptor de N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinar las distancias exactas es el primer paso hacia la construcción de modelos estructurales basados ​​en experimentos FRET.

Resumen

Aquí se presenta un protocolo sobre cómo realizar mediciones de distancia interdye de alta precisión utilizando la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) a nivel de molécula única en el modo de detección de fluorescencia multiparámetro (MFD). MFD maximiza el uso de todas las "dimensiones" de la fluorescencia para reducir los artefactos fotofísicos y experimentales y permite la medición de la distancia interdye con una precisión de hasta 1 Å en biomoléculas rígidas. Este método se utilizó para identificar tres estados conformacionales del dominio de unión al ligando del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) para explicar la activación del receptor tras la unión del ligando. Al comparar las estructuras cristalográficas conocidas con mediciones experimentales, acordaron dentro de menos de 3 Å para biomoléculas más dinámicas. La reunión de un conjunto de restricciones de distancia que cubre toda la dimensionalidad de las biomoléculas haría posible proporcionar un modelo estructural de biomolécula dinámicaEs

Introducción

Un objetivo fundamental de los estudios de biología estructural es desentrañar la relación entre la estructura y la función de las máquinas biomoleculares. La primera impresión visual de las biomoléculas ( por ejemplo, proteínas y ácidos nucleicos) se produjo en la década de 1950 a través del desarrollo de la cristalografía de rayos X 1 , 2 . La cristalografía de rayos X proporciona información estructural estática de alta resolución restringida por el empaque de cristal. Por lo tanto, la inmovilidad inherente de los modelos estructurales de rayos X evita la naturaleza dinámica de las biomoléculas, un factor que afecta a la mayoría de las funciones biológicas [ 3 , 4 , 5] . La resonancia magnética nuclear (RMN) 6 , 7 , 8 proporcionó una solución alternativa al problema resolviendo modelos estructurales en soluciones acuosas. Una gran ventajaDe la RMN es su capacidad para recuperar la naturaleza intrínseca dinámica de las biomoléculas y conjuntos conformacionales, lo que ayuda a aclarar las relaciones intrínsecas entre la estructura, la dinámica y la función 3 , 4 , 5 . Sin embargo, la RMN, limitada por el tamaño de la muestra y grandes cantidades de muestra, requiere complejas estrategias de etiquetado para sistemas más grandes. Por lo tanto, existe una necesidad acuciante de desarrollar métodos alternativos en biología estructural.

Históricamente, la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) 9 no ha tenido un papel importante en la biología estructural debido a la idea errónea de que FRET proporciona medidas de distancia de baja precisión. Es el propósito de este protocolo revisar la capacidad de FRET para determinar las distancias en la escala nanométrica, de tal manera que estas distancias pueden ser utilizadas para construir modelos estructurales de biomoléculas. El primer experimento verificLa dependencia de R - 6 de la eficiencia de FRET fue realizada por Stryer en 1967 10 midiendo poliprolinas de varias longitudes como una "regla espectroscópica". Un experimento similar se llevó a cabo a nivel de una sola molécula en 2005 [ 11] . Las moléculas de poliprolina resultaron ser no ideales y, por lo tanto, las moléculas de ADN de doble cadena se utilizaron más tarde 12 . Esto abrió la ventana para medidas de distancia precisas y la idea de utilizar FRET para identificar las propiedades estructurales de las biomoléculas.

FRET es óptimo cuando el rango de distancia entre interditos es de ~ 0.6-1.3 R 0 , donde R 0 es la distancia de Förster. Para fluoróforos típicos usados ​​en experimentos de FRET de molécula única, R $ . $ Es de aproximadamente 50 Å. Típicamente, FRET ofrece muchas ventajas sobre otros métodos en su capacidad de resolver y diferenciar las estructuras y la dinámica enHeterogéneos: i) Debido a la máxima sensibilidad de la fluorescencia, los experimentos FRET de una sola molécula 13 , 14 , 15 , 16 pueden resolver conjuntos heterogéneos contando directamente y caracterizando simultáneamente las estructuras de sus miembros individuales. (Ii) Las vías de reacción complejas pueden ser descifradas directamente en estudios FRET de molécula única porque no es necesaria la sincronización de un conjunto. (Iii) FRET puede acceder a una amplia gama de dominios temporales que abarcan más de 10 décadas en el tiempo, cubriendo una amplia variedad de dinámicas biológicamente relevantes. (Iv) Los experimentos de FRET pueden realizarse en cualquier condición de solución, tanto in vitro como in vivo . La combinación de FRET con microscopía de fluorescencia permite el estudio de estructuras moleculares y las interacciones directamente en las células vivas [ 15 , 16 , Sup> 17 , 18 , 19 , incluso con alta precisión 20 . (V) FRET se puede aplicar a sistemas de casi cualquier tamaño ( por ejemplo, oligómeros de poliprolina 21 , 22 , 23 , 24 , Hsp9025, transcriptasa inversa 26 de HIV y ribosomas 27 ). (Vi) Por último, una red de distancias que contiene toda la dimensionalidad de las biomoléculas podría utilizarse para derivar modelos estructurales de moléculas estáticas o dinámicas 18 , 28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 ,Ref "> 35 , 36 , 37 .

Por lo tanto, la espectroscopia FRET de una sola molécula se puede utilizar para derivar distancias que son lo suficientemente precisas para ser utilizado para modelado estructural restringido a distancia [ 26] . Esto es posible aprovechando la detección de fluorescencia multiparámetro 28 , 38 , 39 , 40 , 41 , 42 , que utiliza ocho dimensiones de información de fluorescencia ( es decir, espectro de excitación, espectro de fluorescencia, anisotropía, duración de la fluorescencia, rendimiento cuántico de fluorescencia, El tiempo macroscópico, las intensidades de fluorescencia y la distancia entre los fluoróforos) para proporcionar con exactitud y precisión las restricciones de distancia. Además, la excitación intercalada pulsada (PIE) se combina con MFD(PIE-MFD) 42 para monitorear la fluorescencia del aceptor de excitación directo y seleccionar eventos de molécula única que surgen de muestras que contienen una estequiometría de donante a aceptor de 1: 1. Una configuración típica de PIE-MFD usa láseres de excitación entrelazados de dos pulsos conectados a un cuerpo de microscopio confocal, donde la detección de fotones se divide en cuatro canales diferentes en diferentes ventanas espectrales y características de polarización. Más detalles se pueden encontrar en la Figura 1 .

Es importante señalar que FRET debe combinarse con métodos computacionales para lograr atomístico-como los modelos estructurales que son coherentes con los resultados FRET 26 , 30 . No es el objetivo del presente protocolo revisar la metodología asociada para construir modelos estructurales con distancias derivadas de FRET. Sin embargo, estos enfoques se han aplicado en combinación con otras técnicas ( por ejemplo, dispersión de rayos X de ángulo pequeñoO la resonancia paramagnética electrónica), dando origen al campo de la biología estructural integradora 43 , 44 , 45 , 46 . El objetivo actual es allanar el camino para FRET como una herramienta cuantitativa en biología estructural. Como ejemplo, esta metodología se utilizó para identificar tres estados conformacionales en el dominio de unión al ligando (LBD) del receptor N-metil-D-aspartato (NMDA). El objetivo final es superar las limitaciones antes mencionadas y traer FRET entre los métodos integradores utilizados para la determinación estructural de biomoléculas proporcionando distancias medidas con alta precisión.

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Protocolo

1. Preparación de tampón PBS y tratamiento de cámara

NOTA: Use una capa de laboratorio y guantes desechables cuando realice experimentos químicos húmedos. Utilice protección para los ojos cuando alinee el láser.

  1. Preparación del tampón PBS
    1. Se disuelven 4,5 g de Na2HPO4, 0,44 g de NaH2PO4 y 3,5 g de NaCl en 400 mL de agua destilada. Asegúrese de un pH de 7,5 y esterilice la solución en autoclave en un ciclo de líquido durante 1 h (dependiendo del sistema de autoclave).
    2. Tomar 15 ml de la solución de PBS y mezclarla con 0,1 g de carbón vegetal. Filtrar la mezcla utilizando un filtro de jeringa normal de 20 ml con un tamaño de poro de 0,2 μm . Sellar y almacenar el tampón de PBS a temperatura ambiente.
  2. Microscopio cubierto con cámara de tratamiento de vidrio
    1. Añadir 500 μl de agua destilada y 5 μl de surfactante no iónico polisorbato 20 (ver la Lista de Materiales)A un sistema de vidrio cubierto de cámara (vea la lista de materiales) y mezcle bien. Déjelo remojar durante 30 min. Quitar la solución de polisorbato 20 y lavar la cámara con agua destilada dos veces. Déjalo secar.
      NOTA: La cámara está lista para usar.

2. Preparación de la muestra de ADN

NOTA: Utilice hebras de ADN etiquetadas diseñadas (vea la Lista de Materiales) para la creación de muestras estándar de ADN bicatenario (dsDNA). Los oligos diseñados no deben tener colorantes en el extremo de un polímero para evitar artefactos que pueden comprometer la distancia determinada. La secuencia de ADN debe ser elegida para comportarse como un cuerpo rígido.

  1. Añadir 1,5 μl de una cadena de ADN marcada con donante y 4,5 μL de una cadena de ADN complementaria (aceptada o no) en un tubo de microcentrífuga y mezclarlos con 24 μl de agua libre de nucleasa.
    NOTA: Dependiendo de la mezcla de los oligonucleótidos seleccionados, se generarán las siguientes muestras: no-FRET, loW-FRET, o dsDNAs de alta FRET.
  2. Hibridar el ADN usando un mezclador térmico y el siguiente proceso: 95 ° C durante 10 min, 90 ° C durante 10 min, 80 ° C durante 10 min, 70 ° C durante 10 min, 60 ° C durante 10 min, 50 ° C Durante 10 min, 40ºC durante 10 min, 30ºC durante 10 min, 20ºC durante 10 min, 10ºC durante 10 min y mantenimiento a 5ºC.
    NOTA: Los estándares de dsDNA generados pueden mantenerse en un congelador de -20 ° C para almacenamiento a largo plazo o pueden usarse inmediatamente.

3. Preparación de la muestra de proteínas

Nota: Comenzando con el ADN recombinante para la expresión de la proteína de interés en sistemas bacterianos, es posible mutar los residuos a partir de los cuales las distancias deben medirse en cisteínas. Para ello, utilizar el estándar dirigido a la mutagénesis técnicas [ 47] . Para facilitar la purificación de proteínas, clonar el ADN recombinante y mutado en un vector que contiene una etiqueta de purificación ( por ejemplo,Un His-tag). Se usó el dominio de unión al ligando de la subunidad 1 de glutamato (LBD) del receptor ionotrópico de glutamato NMDA (GluN1) LBD ( es decir, NMDA GluN1 LBD clonado en el vector pET-22b (+)).

  1. Expresión de la proteína
    1. Transformar el plásmido de ADN de construcción en el sistema de expresión de elección [ 48] .
      NOTA: Los pasos siguientes asumirán que la expresión de una proteína soluble se transforma en Escherichia coli . También es posible la purificación de, por ejemplo, células de mamífero 49 transfectadas o células de insecto transducidas 50 , y se pueden encontrar etapas detalladas en otra parte. Asegúrese de que la cepa de E. coli seleccionada sea apropiada para la proteína de interés. Por ejemplo, la expresión de proteínas que contienen puentes disulfuro requiere una cepa de células competentes con un compartimento intracelular menos reductor (véase la Lista de Materiales).
    2. Inocular un iniciador E. Coli utilizando una punta de pipeta estéril para recoger una única colonia transformada [ 48] . Se deja caer en 100 ml de medio LB selectivo (véase la Lista de Materiales) y se deja crecer el cultivo durante la noche a 37ºC.
    3. Preparar caldo LB (ver la Lista de Materiales). Autoclave para esterilizar.
    4. Inocular cultivos a gran escala de E. coli transformada añadiendo el cultivo durante la noche a 2 L de medio LB selectivo en una relación 1: 500.
    5. En las próximas horas, evaluar el crecimiento del cultivo mediante el control de las lecturas de absorbancia (Abs) del cultivo a 600 nm, a veces denominado densidad óptica a 600 nm (DO 600 ), o utilizando un medidor de densidad celular. Tenga en cuenta que las lecturas aumentan con el tiempo.
    6. Inducir la expresión de la proteína con una concentración final de 0,5 mM de isopropil-β-d-1-tiogalactopiranósido (IPTG) cuando el cultivo alcanza un OD 600 de 0,7. Agitar induce E. coli a 20 ° C durante 20-24 h.
    7. Después de la inducción de la proteína, pellet la E. coli por hilatura durante 20 min a 3000 xg y 4 ° C. Desechar el sobrenadante y almacenar el sedimento de E. coli que contiene la proteína intracelular a -80 ° C hasta su uso.
  2. Purificación de proteínas
    1. Lyse E. coli usando un método de lisis de elección ( por ejemplo, sonicación, prensa francesa, cavitación con nitrógeno, etc. ) 51 .
    2. Hacer girar la membrana y los restos celulares centrifugando el lisado durante 1 h a 185.000 xg y 4 ° C.
    3. Para una proteína marcada con His, cargue el sobrenadante en una columna de cromatografía de afinidad de metal (IMAC) inmovilizada, cargada con níquel, equilibrada usando un sistema de cromatografía líquida de proteína rápida (FPLC) (véase Tabla de Materiales ) 52 .
      NOTA: Tampón de equilibrio para el NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM y Glicina 1 mM, pH 8. Tampón de elución para NMDA GluN1 LBD: NaCl 200 mM, Tris 20 mM, Glicina 1 mM y Imidazol 400 mM, pH 8.
      1. Lavar la columna IMAC con un tampón que contiene una cantidad baja (~ 12 mM) de imidazol.
      2. Eluir la proteína de la columna IMAC usando un gradiente lineal de imidazol de 12 mM a 400 mM.
    4. Dializar la proteína durante la noche en tampón de equilibrio sin imidazol 53 colocando el eluido de la etapa 3.2.3.2 en un tubo de diálisis y sumergiéndolo en el tampón de equilibrio bajo agitación continua durante 2-3 horas. Repita al menos una vez más.
      NOTA: Los pasos 3.2.3-3.2.6 suponen la purificación de una proteína marcada con His. Si la purificación a través de algún otro método, ajustar el protocolo en consecuencia.
    5. Cuantificar la cantidad de proteína tomando la absorbancia a 280 nm de la proteína dializada y utilizando la ley de Beer ( unidad de Absorbancia = ε L c , donde ε Es el coeficiente de extinción (M -1 cm -1), Que se puede obtener aquí 54 ; L es la longitud de la trayectoria de la luz (cm); Yc es la concentración de proteína (M)).
      NOTA: Se dispone de varios ensayos de cuantificación de proteínas, incluyendo el ensayo de Bradford y el ensayo de ácido bicinconínico. Ambos proporcionan resultados precisos.
  3. Etiquetado de proteínas
    1. Se añaden fluoróforos dador (colorante verde ciano-maleimida reactivo) y aceptor (colorante color rojo lejano reactivo a maleimida) a la proteína purificada a una relación molar proteína: donador: aceptor 1: 1: 8.
    2. Incubar la proteína y la mezcla de fluoróforo en hielo durante 30 min. Los tiempos de incubación más largos son posibles.
    3. Empaque una columna de 0,5 mL de Ni-Nitrilotriacético (Ni-NTA) agarosa (ver la Lista de Materiales) y equilibre usando el mismo tampón de equilibrio que en el paso 3.2.3 mientras la proteína está incubando.
      NOTA: Mantenga la cantidad de proteína cargada de acuerdo con la capacidad de unión a la resina.
    4. Después de los 30 minutos enCubicación, cargar la mezcla de proteína / fluoróforo sobre la columna preparada en la etapa 3.3.3 y purificar por flujo por gravedad.
    5. Lavar el exceso de fluoróforo con 5 ml de tampón de equilibrio.
    6. Eluir la proteína marcada por gravedad de la columna cuatro veces con 0,5 ml de tampón de elución. Debido a que la proteína ya ha sido purificada a partir de otras proteínas, no es necesario un gradiente.
    7. Compruebe cada eluato con un espectrómetro UV-Vis para identificar qué fracción contiene la proteína marcada. Escanear la absorbancia de 230-700 nm para poder asegurar que los picos de absorbancia de la proteína (280 nm) y cada fluoróforo (493 nm para el fluoróforo verde cian y 651 nm para el fluoróforo rojo lejano) son visibles en la Eluato.
      NOTA: Típicamente, la proteína se eluye en la fracción 2.
    8. Equilibrar una columna de desalación (véase la tabla de materiales ) con PBS tratado con carbón (etapa 1.1).
    9. Cargue la proteína marcada en la columna desalinizadora por flujo de gravedad.
      NOTA: Mantenga la cantidad de proteína cargada de acuerdo con la capacidad de la columna de desalinización seleccionada 55 .
    10. Eluir usando 3,5 ml de PBS tratado con carbón por flujo de gravedad y recoger fracciones de 0,5 ml del eluido.
    11. Utilizar un espectrómetro UV-Vis para escanear la absorbancia de cada eluato desde 230-700 nm para identificar qué fracción contiene proteína marcada.
      NOTA: Los pasos 3.3.8-3.3.11 sirven básicamente como un paso de intercambio de búfer. Otros protocolos que sirven a este propósito también son posibles ( por ejemplo, diálisis extensa). Alternativamente, uno podría ir directamente al paso 3.3.8 de la etapa 3.3.2.

4. Mediciones necesarias en condiciones de conjunto (en Cuvette)

  1. Determinación de la constante de Förster
    1. Scan f D , la emisión de fluorescencia fluoróforo (cps), en un fluorímetro mediante la excitación del donante a 15 nm a su máxima longitud de onda de absorbancia con el fin de obtener el pleno emEspectro de emisión. Supervisar la emisión comenzando 5 nm después de la longitud de onda de excitación y terminando 150 nm más tarde. Utilice las condiciones de ángulo mágico ajustando el polarizador de emisión a 54,7 ° Y los polarizadores de excitación a 0 ° 56 .
      NOTA: Para el fluoróforo donante usado aquí, el Abs máximo ocurre a 490 nm; Se utiliza 475 nm como longitud de onda de excitación y se controla la emisión desde 480-650 nm. Para el aceptor, el Abs máximo ocurre a 645 nm; Se utiliza 630 nm para la longitud de onda de excitación y se controla la emisión desde 635-735 nm.
    2. Utilice el fluorímetro para realizar una exploración de excitación del fluoróforo aceptor (Abs A ) que oscila entre 400 y 700 nm y utilizar condiciones de ángulo mágico ajustando el polarizador de emisión a 54,7 ° Y los polarizadores de excitación a 0 ° 56 . Ajuste el monocromador de emisión a 15 nm después de la longitud de onda de emisión máxima. Normalizar al máximo de excitaciónTación.
    3. En las tablas publicadas, localice el coeficiente de extinción del aceptor, ε A (M -1 cm -1 ) 56 , o utilice los valores proporcionados por el fabricante.
      NOTA: El valor publicado para el fluoróforo aceptor utilizado en este manuscrito es ε A647 = 270.000 cm -1 M -1 56 .
    4. Calcular la superposición espectral utilizando J = Σf D · (Abs A · ε A ) · λ 4 , donde f D , Abs A y ε A se han definido anteriormente λ y es la longitud de onda (nm). Utilice una hoja de cálculo para enumerar en columnas todos los valores dependientes de la longitud de onda obtenidos en los pasos 4.1.1-4.1.3. Alinearlos según la longitud de onda. Realizar la sumación a partir de la longitud de onda mínima de la emisión del donante (λ min ) a la longitud de onda máxima de la absorción del aceptorE ( lambda _ { max }).
    5. Calcular la constante de Förster (R o ) usando la siguiente fórmula R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F, D · n -4 , donde J es el solapamiento espectral previamente calculado en el paso 4.1.4, Κ 2 Es el factor de orientación, ΦF , D Es el rendimiento cuántico de fluorescencia del fluoróforo donante, yn es el índice de refracción del medio en el que está situado el fluoróforo.
      NOTA: Utilice n = 1,33 (si se utiliza tampón acuoso) y κ 2 = 2/3.
    6. Localizar el valor de rendimiento cuántico del fluoróforo donante (ΦF , D , Dependiente del entorno) en las tablas publicadas (véase la referencia 57) y utilizar el valor de la superposición espectral obtenida en el paso 4.1.4 para calcular el valor final de la constante de Förster utilizando la ecuaciónCión del paso 4.1.5.
      NOTA: Si el rendimiento cuántico no está disponible, siga el paso 4.2, a continuación, para calcularlo. En este caso, utilice ΦF , D = 0.8, que corresponde a una vida de donante τ D, r = 4.0 ns.
  2. Determinación del rendimiento cuántico de fluorescencia
    NOTA: El siguiente procedimiento supone sólo quenching dinámico. Para considerar el enfriamiento estático, refiérase a la Referencia 56. Sin embargo, los experimentos PIE-MFD también son útiles para determinar el rendimiento cuántico, incluso en el caso del enfriamiento estático (ver los Resultados).
    1. Seleccione un fluoróforo de referencia con perfiles de absorción y emisión similares para los fluoróforos aceptor y donante para los cuales se ha determinado el rendimiento cuántico (Φ r ).
      NOTA: Para el donante, Φ r = 0.8 y τ r = 4 ns, mientras que para el aceptor, Φ r = 0.32 y τ r = 1.17 ns, WQue corresponden a los Φ r y τ r para el fluoróforo verde cian-y los oligonucleótidos marcados con fluoróforo rojo, respectivamente 57 .
    2. Mida el decaimiento de fluorescencia resuelto en el tiempo (f (t)) usando el método de contaje de fotones únicos (TCSPC) correlacionado con el tiempo en condiciones de ángulo mágico.
    3. Ajustar el decaimiento de fluorescencia con una función de decaimiento mono- o multi-exponencial en forma de f (t) = Σ i x i e -t / τ i , donde x i Es la fracción de población y τ i Es la vida de fluorescencia de la población.
    4. Calcular las vidas medias de la especie, <τ> x = Σx i τ i , Donde x i Es la fracción de población y τ i Es la vida de fluorescencia de la población.
    5. UsoE fórmula Φ F, D = <τ D > x * Φ r / τ r Para calcular el rendimiento cuántico de fluorescencia del fluoróforo donador mediante la interconexión de la vida de fluorescencia y el rendimiento cuántico de la referencia, así como la vida de fluorescencia del fluoróforo donante.
      NOTA: Este método asume el apagado dinámico. Para otros Φ F, D determinaciones, siga Lakowicz [ 56] .

5. Alineación del experimento para PIE-MFD Detección de una sola molécula (SMD)

NOTA: Es mejor apagar las luces al tomar medidas.

  1. Ajuste del equipo (Figura 1)
    NOTA: Para este experimento se utiliza una configuración MFD construida en el hogar representada en la Figura 1 , con dos láseres pulsados ​​y 4 canales de detección en un cuerpo de microscopio invertido. Existen sistemas comerciales similares.
    1. Encienda los láseres de 485 nm y 640 nm y todos los detectores de la configuración MFD. Abra el software que controla la adquisición de TCSPC y los láseres. Asegúrese de que la frecuencia de repetición del láser es de 40 MHz.
    2. Ajustar la potencia del láser pulsado de 485 nm a 60 μW en un plano de imagen del objetivo de inmersión en agua 60X 1.2 NA y la potencia láser pulsada de 640 nm a 23 μW en modo de excitación intercalada pulsada (PIE-MFD) 42 .
      NOTA: Para configurar PIE-MFD, los dos pulsos láser se retrasan en el software del controlador láser. Para la excitación por láser de 485 nm, los canales TCSPC de detección (canales TAC) son 1-12.499 (canal "prompt"). Para la excitación por láser de 640 nm, los canales TCSPC de detección (canales TAC) son 12.499-50.000 (canal de "retardo").
    3. Añadir el líquido de inmersión objetivo (una gota de agua doblemente destilada) entre la lente de objetivo del microscopio y una diapositiva de vidrio de cubierta. Para asegurarse de que el plano de la imagen está dentro de la solución y lejos del vidrio surfaGire el botón de ajuste una vuelta y media después de encontrar el segundo punto focal brillante debido a la reflexión de los láseres en la interfaz vidrio-líquido.
    4. Añadir 1 μl de Rhodamine 100 nM 110 a 50 μl de agua destilada al centro de la cubierta. Asegúrese de que la solución esté también en el centro del objetivo del microscopio.
    5. Ajuste las posiciones del agujero de alfiler (tamaño: 70 μm) (dirección xey en cada momento) mientras se controla la tasa de recuento de fotones en el software de adquisición para maximizar el número de fotones detectados.
  2. Medición estándar SMD (trabajo en un cuarto oscuro)
    1. Utilice el ejemplo del paso 5.1.4 y registre 120 s de la tasa de recuento haciendo clic en el botón "Inicio" en el panel de control resuelto en el tiempo marcado con tiempo (TTTR) en formato "* .ht3" 58 en el software de adquisición.
    2. Calcular la espectroscopia de correlación de fluorescencia offline (FCS) 59 , </ Sup> 60 , 61 ( es decir, medición FCS) para determinar el tiempo característico de difusión, el número de moléculas en el volumen confocal, la cinética del estado triplete y el brillo molecular 62 .
      1. Abra el software para FCS (Kristine, MFD suite). Seleccione la configuración experimental haciendo clic en "Opciones" -> "Seleccione Configurar". Seleccione un archivo con parámetros experimentales similares y haga clic en "obtener parámetros del archivo" para leer la información del encabezado del archivo.
      2. Seleccione "Operate" -> "Correlate" para realizar FCS.
        NOTA: Asegúrese de que los números de canal están correctamente especificados y de que la "TAC Gate" (canales TCSPC) está marcada para seleccionar en consecuencia los canales de aviso o retardo.
      3. Seleccione "Operar" -> "Ajuste global de las curvas de correlación" para abrir la rutina de ajuste. Utilice la "ecuación # 24" en laE y haga clic en "iniciar".
        NOTA: La ecuación 24 del software describe la función de autocorrelación ( G c ) de moléculas fluorescentes de difusión libre sobre un perfil de iluminación gaussiana tridimensional, tal como 61 :
        figure-protocol-1
        Donde T es el número medio de moléculas en el volumen de detección, x T es la fracción de moléculas que ejercen la cinética triplete con el tiempo característico t T , t c , es el tiempo de correlación, t diff es el tiempo de difusión relacionado con la geometría Parámetro ω , y ω describe el perfil de iluminación gaussiana. Después del ajuste, tome nota del tiempo de difusión y del número de moléculas en el volumen confocal.
    3. Añadir 10 μl de Rhodamina 101 100 nM en 50 μl de solución destiladaAgua y mezclar bien. Coloque esta mezcla en la parte superior de la cubierta de vidrio y asegúrese de que la gotita está en el centro de la lente objetivo. Haga clic en el botón "iniciar" en el panel de control TTTR para grabar 120 s de datos en formato TTTR.
    4. Añadir 1 μl de 100 nM de fluoróforo rojo lejano en 50 μl de agua destilada y mezclar bien. Coloque esta mezcla en el centro del objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabar 120 s de datos en formato TTTR.
    5. Coloque 50 μl de agua destilada en el centro del objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabe 300 s de datos en formato TTTR.
    6. Coloque 50 μl de tampón PBS en el centro de la lente objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" y grabe 300 s de datos en formato TTTR.
    7. Tomar 1 μl de la mezcla del paso 5.1.4 y mezclar con 50 μl de agua destilada. Coloque esta mezcla en el cristal de la cubierta. Primero, haga clic en el botón "Inicio" y recoja 10 s de datos en el modo TTTR. Luego, analice el TTTR utilizando el software de análisis de vida de fluorescencia de integración (BIFL) de Burst (Paris, MFD suite), como se describe en el paso 5.3.
      NOTA: Verifique el número de ráfagas por segundo del software 26 y 61 de selección y análisis de ráfagas. Si el nivel de ráfaga es alrededor de 35 cada 10 s, es apropiado para la medición de una sola molécula.
    8. Continúe registrando la tasa de contaje en formato TTTR durante 1,5 h ( es decir, TCSPC en SMD) para tratar como un estándar de medición de una sola molécula.
      NOTA: Debido al tamaño de archivo grande, dividir archivos "* .ht3" en archivos de menor tamaño para cargar y procesar utilizando BIFL.
  3. Análisis de muestras estándar utilizando BIFL
    1. Abrir el software BIFL (París).
    2. Seleccione la configuración de PIE en la ventana emergente automática "Confirmar configuración" y lea el encabezado seleccionando el archivo con configuraciones experimentales similares. Haga clic en "get parameters fromM archivo ". Haga clic en" Aceptar ". Observe que la ventana emergente se cierra y se integra en el front-end de París Haga clic en" Aceptar "en" Siguiente ".
    3. Elija los archivos para analizar haciendo clic en "Seleccionar" en "Array de ruta de datos" para seleccionar la medida a analizar.
      1. Haga clic en "Dispersión verde" (para una medición de agua), "Green BG" (para una medición de buffer), "Green thick" (para una medición de 2 nM Rhodamine 110), "Red scatter" (para una medición de agua) Red BG "(para una medición de buffer o agua)," Red thick "(para una medición de Rhodamine 101 de 20 nM)," Yellow scatter "(para una medición de agua)," Yellow BG "(para una medición de buffer) y "Amarillo Grueso" (para una medición de fluoróforo de 2 nM).
      2. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
        NOTA: El canal "Verde" corresponde a la señal de los detectores verdes en los canales TCSPC "prompt". losEl canal "amarillo" corresponde a la señal de los detectores rojos en los canales TCSCP de retardo.
    4. Haga clic en "Ajustar" junto a "Datos cortados en ráfaga" para ajustar los parámetros de selección de una sola molécula. En la nueva ventana emergente, seleccione eventos de molécula única con dos desviaciones estándar del tiempo de llegada interphoton medio ("dt") cambiando el tiempo de llegada interphoton bajo "Umbral" y el número mínimo de fotones por evento de molécula única en "min Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org Haga clic en "Volver" para cerrar la ventana emergente. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
      NOTA: El umbral, en unidades ms, depende de la velocidad de recuento de fondo. El número mínimo típico de fotones utilizados es 60.
    5. Ajustar la duración de fluorescencia inicial "Parámetros de ajuste de color" ( por ejemplo , de, a, y convolución) para la generaciónD parámetros de decaimiento de fluorescencia en los colores "Verde", "Rojo" y "Amarillo". En la misma ventana, ajuste los valores "from" y "to" para "Prompt" y "Delay". Haga clic en "Volver" para cerrar la ventana emergente. Haga clic en "Aceptar" en "Siguiente".
      NOTA: Asegúrese de que la casilla de verificación de excitación de 2 colores está seleccionada. "De" y "a" corresponden a los compartimientos inicial y final en el histograma de decaimiento de fluorescencia (número de canal de TAC). Si los parámetros de ajuste inicial se seleccionan correctamente, se agrega una función de ajuste a los decaimientos de fluorescencia en cada canal.
    6. Seleccione la ubicación en la unidad de disco duro a la que guardar todos los archivos ASCII procesados ​​en una carpeta principal.
      NOTA: París procesa todas las ráfagas seleccionadas y crea múltiples archivos de salida ascii que pueden ser utilizados por otros programas para la visualización ( por ejemplo, Margarita MFD suite).

6. Estándares dsDNA y Muestra de MedidaInformes

  1. Añada 500 μl de tampón de PBS a un cristal de tapa con cámara y coloque una gota de agua destilada entre la cámara y el objetivo. Haga clic en el botón "Inicio" en el pedal de control y recoger 5 min de datos en el modo TTTR para utilizar para el análisis.
  2. Tome una pequeña cantidad (normalmente alrededor de 0,1 μL, concentración de alrededor de 1 μM) de estándar de dsDNA, añádala al tampón PBS y mezcle bien. Primero, recoja 10 s de datos haciendo clic en "Inicio". A continuación, compruebe la ráfaga para obtener 35 ráfagas por 10 s (como en los pasos 5.2.7 y 5.3). Finalmente, recoja> 2 h de datos en formato TTTR, como se describió anteriormente.
  3. Analizar los datos recogidos para las muestras de dsDNA, como en el paso 5.3.3.
  4. Visualice los histogramas de ráfaga utilizando la suite MFD (Margarita) y muestre la eficiencia de FRET frente a <τ D (A) > f o F D / F A frente a <τ D (A) > f .
    1. AbiertoEl software de Margarita y seleccione "Archivo" -> "Importar todos los archivos *. 4 y *. MTI." Seleccione la carpeta principal que contiene varias subcarpetas.
    2. Seleccione los parámetros a visualizar haciendo clic al lado de la "X" (abscisa) de uno de los parámetros derivados de París ( por ejemplo, tau green o <τ D (A) > f ); Similarmente, repita esto para la ordenada "Y" para seleccionar el parámetro deseado para visualizar ( por ejemplo, eficiencia de FRET, F D / F A o S PIE PIE).
      NOTA: En este caso, la eficiencia FRET, F D / F A o S PIE corregir la tasa de recuento de fondo adecuada en los canales verde, rojo y amarillo; Para rendimientos cuánticos del donante y aceptor; Para la relación de eficiencia de detección (g G / g R ); Y para crosstalk (α). Aquí, g G / g R = 3,7 y α = 0,017, dependiendo únicamente del instrumento. Tasa de contaje de antecedentesDependen del tampón usado, y los valores de rendimiento cuántico se determinan previamente.
    3. Agregue una línea FRET abriendo la ventana "Overlay Equation" haciendo clic en "Display" -> "Overlay Equation". Seleccione la línea de FRET estática en el menú emergente. Seleccione los tiempos de vida del donante y los parámetros de rendimiento cuántico adecuados para generar la línea FRET adecuada.
      NOTA: Se pueden generar líneas FRET para correlacionar varios indicadores FRET.
  5. Determine el factor de corrección para la excitación del aceptor por la fuente de excitación del donante (β) usando el parámetro de estequiometría mostrando la eficiencia de FRET frente a la estequiometría (S PIE ) en Margarita (Ecuación 1).
    NOTA: β se elige de modo que la muestra del donante tenga un pico en S PIE = 1,0 en la escala de estequiometría; La muestra sólo aceptor debe tener una estequiometría de S PIE = 0.0, y el dsDNA con ambas etiquetas debe tener una estequiometría de S PIE ~ 0.5.
    NOTA: El instrumento ya está listo, y es posible medir las muestras marcadas con FRET.
  6. Mida y analice las muestras marcadas con FRET preparadas en la sección 3 siguiendo los pasos 6.3-6.4.

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Resultados

En experimentos típicos de smFRET usando una configuración de MFD (líneas de láser: 485 nm a 60 μW y 640 nm a 23 μW, sección 5.1), la muestra de fluorescencia se diluye a una concentración picomolar baja ( 10-12 M = 1 pM) y se coloca En un microscopio confocal, donde un pulso de láser sub-nanosegundo excita las moléculas marcadas que se difunden libremente a través de un volumen de excitación. Un volumen confocal típico es <4 femtolitros (fL). A concentraciones tan bajas, s...

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Discusión

En este trabajo se presenta el protocolo para alinear, calibrar y medir las distancias de interdye con alta precisión usando experimentos FRET de una sola molécula PIE-MFD. Al calibrar cuidadosamente todos los parámetros instrumentales, se puede aumentar la precisión de las distancias medidas y alcanzar la precisión de Angstrom. Para ello, se utilizan varios histogramas multidimensionales para analizar e identificar poblaciones para su posterior caracterización. Utilizando el tiempo macro medio para verificar la estabil...

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Divulgaciones

Todos los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia con el contenido de este artículo.

Agradecimientos

VJ y HS reconocen el apoyo de NIH R01 GM094246 a VJ. HS reconoce fondos de puesta en marcha del Programa de Investigación Creativa de la Universidad de Clemson y el Centro de Ciencia de Materiales Ópticos y Tecnologías de Ingeniería en la Universidad de Clemson. Este proyecto también fue apoyado por una beca de formación del Centro Keck para el Entrenamiento Interdisciplinario en Biociencias de los Consorcios de la Costa del Golfo (NIGMS Subvención No. 1 T32GM089657-05) y la Beca de la Fundación Schissler para Estudios Traslacionales de Enfermedades Humanas Comunes a DD. El contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no representa necesariamente las opiniones oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
carbón vegetalMerck KGaAK42964486 320
filtro de jeringaFisherbrand09-719Ctamaño: 0.20 y micro;
cubreobjetos con cámaraFisher Scientific155409vidrio de borosilicato de 1,5, 8 pocillos cubreobjetos de
microscopioFisher Scientific063014-9tamaño: 24 x 60-1,5
Agua libre de nucleasaFisher Scientific148859sin nucleasa
tween-20Thermo Scientific28320Solución al 10% de hebra de ADN aceptor de polisorbato 20
( High FRET)Integrated DNA Technologies1781248955&agudo;-d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT(Cy5)C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
hebra de ADN aceptora (FELL bajo)Integrated DNA Technologies1779564245´-d (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT(Cy5)A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC
)hebra de ADN del donanteintegrada Tecnologías de ADN1779514375&agudo; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
hebra de ADN (sin FRET)Tecnologías5&agudo; -d (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
termocicladorEppendorfE6331000025gradiente
de nexoAlexa Fluor 488 C5  MaleimideThermo ScientificA10254denominado fluoróforo verde cian en el manuscrito
Alexa Fluor 647 C2  MaleimidaThermo ScientificA20347denominado fluoróforo rojo lejano en el manuscrito
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth, MillerFisher ScientificBP1426Para el cultivo de E. coli
AmpicillinSigma-AldrichA0166Usado en 100 µ concentración final g/mL en medio LB selectivo para mantener la selección de plásmidos
Tetraciclina Calbiochem58346utilizado en 12.5 y micro; concentración final de g/mL en medio LB selectivo para mantener la mutación de gor (flutatión reductasa) en cepas de Origami B(DE3) para facilitar la oxidación del enlace disulfuro
KanamicinaFisher ScientificBP906-5Utilizado en 15 µ concentración final de g/mL en medio LB selectivo para mantener la mutación trxB (rhiorredoxina reductasa) en tinciones de B(DE3) para facilitar la oxidación del enlace disulfuro
Células competentes de origami B(DE3)Millipore70837-3Células competentes E. coli para la expresión de proteínas con puentes disulfuro
Isopropil-β-D-tiogalactopiranósido (IPTG)Fisher ScientificBP1755Para la inducción de la expresión de proteínas E. coli
Quelante HiTrap HPGE Life Sciences17-0409-01Para la purificación a gran escala de FPLC de la proteína marcada con His
ImidazolSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose Qiagen30210
PD-10 Columna de desalinizaciónGE Life Sciences17-0851-01
AktaPurifierGE Life Sciences28406264FPLC Instrumento Tubo
diálisisLaboratorios de espectro13256215 kD MWCO 24 mm Ancho de aFlanca, 10 metros/rollo
DicroicosSemrockFF500/646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 Polarizador divisor de hazQioptiq Linos G33 5743 000Polarizador de película de 10 x 10
Filtro de paso verde ChromaET525/50mET525/50m Montaje de 25 mm de diámetro
Filtro de paso rojoChromaET720/150mET720/150m Montaje de 25 mm de diámetro
Medidor de potenciaThorLabdPM200
Espectrofotómetro UV-VisVarianCary300Bio
Fluorolog 3 HoribaFL3-22-R3
Fluorohub Controlador TCSPCHoribaFluorohub-BTCSPC electrónica para mediciones de conjuntos
NanoLed 485LHoriba485LLáser de diodo azul
NanoLed 635LHoriba635LLáser de diodo rojo
Microscopio Olympus IX73microscopioOlympusIX73P2F
Detector híbrido PMA 40PicoQuant GmbH932200, PMA 40Optimizado para la detección de verde
PMA 50 Detector híbridoPicoQuant GmbH932201, PMA 50Optimizado para la sensibilidad del cambiador de dientes láser de
485 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-485
láser de 640 nmPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 y software de adquisición TTTRPicoQuant930021Temporizador de eventos de picosegundos y unidad de coutning de fotón único correlacionado con el tiempo, incluye el software de adquisición TTTR
SEPIA II SLM 828 y el software SEPIAPicoQuant910028Laser driver para pulsos de picosegundos, incluye controlador de software SEPIA.
computadora Delloptiplex 7010cpu: i7-3770 Memoria RAM: 16 GB
FRET Software de posicionamiento y detección (FPS)Heinrich Heine UnviersityIncluye el Accesibel Volume clacualtor disponible en http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html
suite MFDHeinrich Heine UnviersityIncluye el paquete de software BIFL Paris; Margarita para la visualización de las imágenes multiparamétricas, y el software de Análisis de Distribución de Probabilidad disponible en http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
de ADN integradas de Marco de

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