En Ovo electroporación en el tronco encefálico auditivo del pollo

Resumen

Las neuronas auditivas del tronco encefálico de aves y mamíferos están especializadas en la codificación neural rápida, un proceso fundamental para las funciones auditivas normales. Estas neuronas surgen de precursores distintos de embriones hindbrain. Presentamos técnicas que utilizan electroporación para expresar genes en el cerebro posterior de embriones de pollo para estudiar la función génica durante el desarrollo auditivo.

Resumen

La electroporación es un método que introduce genes de interés en organismos biológicamente relevantes como el embrión de pollo. Se ha establecido que el embrión de pollo es un modelo de investigación eficaz para estudiar las funciones biológicas básicas del desarrollo del sistema auditivo. Más recientemente, el embrión de pollo se ha vuelto particularmente valioso en el estudio de la expresión génica, la regulación y la función asociada con la audición. En ovo la electroporación se puede utilizar para dirigir las regiones auditivas del tronco cerebral responsables de funciones auditivas altamente especializadas. Estas regiones incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM) y el núcleo laminaris (NL). NM y NL neuronas surgen de distintos precursores de rhombomeres 5 y 6 (R5 / R6). Aquí, presentamos en ovo electroporación de genes codificados por plásmidos para estudiar las propiedades relacionadas con el gen en estas regiones. Se muestra un método para el control espacial y temporal de la expresión génica que promueven la ganancia o pérdida de funcional fenotipoEs Al dirigir las regiones neuronales neuronales progenitoras asociadas con R5 / R6, se muestra la transfección de plásmidos en NM y NL. La regulación temporal de la expresión génica puede conseguirse adoptando un sistema vectorial tet-on. Este es un procedimiento inducible por fármacos que expresa los genes de interés en la presencia de doxiciclina (Dox). La técnica de electroporación in ovo - junto con los ensayos funcionales bioquímicos, farmacológicos y / o in vivo - proporciona un enfoque innovador para estudiar el desarrollo de las neuronas auditivas y los fenómenos patofisiológicos asociados.

Introducción

La codificación neuronal rápida del sonido es esencial para las funciones auditivas normales. Estas incluyen las habilidades de localización de sonido ¹ , el habla en la discriminación de ruido ² , y la comprensión de otras señales de comunicación relevantes para el comportamiento ³ . Las neuronas análogas ubicadas en el tronco encefálico auditivo de aves y mamíferos son altamente especializados para la codificación neuronal rápida [ ^4] . Estos incluyen el núcleo de pollo magnocellularis (NM), el núcleo laminaris (NL) y sus análogos de mamíferos, el núcleo coclear anterove....

Protocolo

Todos los procedimientos fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado de Animales y Uso de la Universidad de Northwestern, y llevados a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud Pautas para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Manejo de huevos

1. Compre huevos fertilizados de un vendedor local. Almacene los huevos a 13 ° C en un refrigerador por no más de 5 días antes de la incubación. La viabilidad del embrión disminuye significativamente después de 1 semana.
2. Limpie cada huevo con etanol al 70% antes de colocarlo en la incubadora.
3. Coloque 1-2 docenas de huevos en sus lado....

Resultados

Se muestra aquí que en la electroporación ovo permite la expresión génica en un sistema biológico que se desarrolla normalmente. Los genes codificados por plásmidos se inyectan focalmente en el tubo neural que recubre R5 / R6. En la Figura 1A se muestra un ejemplo esquemático de las colocaciones de electrodo y pipeta con respecto a marcadores anatómicos importantes. La ubicación correcta de la inyección de plásmido se confirma 24 horas después de la ele.......

Discusión

In ovo electroporación es un método de expresar o derribar los genes de interés con el fin de analizar in vivo la función génica [ ^{8 , 9]} . En el embrión de pollo, es un método innovador para expresar genes codificados por plásmidos en diferentes regiones auditivas del tronco cerebral ⁸ . Para asegurar una expresión óptima, se requieren varios pasos críticos. En primer lugar, sólo inyectar embriones cuyos otocistos son c.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Huevos de gallina leghorn blancos fertilizados	Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)
Picospritzer	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III, uno o dos canales
Estimulador de corriente/voltaje	Grass Technologies	SD9	SD9
Agujas de jeringa SD9 Microfil	World Precision Instruments	MF28G67-5	Calibre 28, 67 mm de largo, (paquete de 5)
Portaelectrodos	Warner Instruments	64-1280	MP Series: Aplicaciones de presión no eléctrica
Microelectrodo estimulante	FHC	PBSA1075	PBSA1075
Tanque de aire/regulador	NU Servicios de laboratorio		Secado al aire 300 CF
Fast green	Sigma Aldrich	F7258-25G	F7258-25G
Cinta de plástico transparente	Scotch	191
Hiclato de doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891-1G
Nevera de huevos	Vissani Nevera		13.3 - 16.1 ° C (56-61 y grados; F)
Incubadora	Hova-Bator		38 ° C (100 ° F), ~50% de humedad
Osciloscopio de disección	Zeiss	4.35E+15	SteREO Discovery, Microscopio V8, 50.4X
Fuente de luz fría	Zeiss	4.36E+15	CL6000
Micromanipuladores	Narishige Japón	Modelo: MM-3	2 Micromanipuladores
Tubos capilares	Instrumento Sutter	BF150-86-10	Borosilicato de pared gruesa (dimensiones)
Jeringas			1 mL, 3 mL
Agujas BD	Precision Glide		27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2
Pinzas	de almacenamiento		Nº 5 Super Fine Dumont
Soporte para huevos	Hecho		base de arcilla también funciona Extractor
micropipetas	Sutter Instrument		Modelo P-97
Filtro de jeringa	Ultra Cruz	sc-358811	PVDF 0.22 μ m

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