Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.
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Artículo de método
Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz
En este artículo
Resumen
Resumen
El escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum se ha convertido en un importante organismo modelo de insectos en la genética del desarrollo y la biología del desarrollo evolutivo. La observación de embriones Tribolium con microscopía de fluorescencia basada en la lámina de luz tiene múltiples ventajas sobre widefield convencional y microscopía de fluorescencia confocal. Debido a las propiedades únicas de un microscopio a base de lámina de luz, imágenes en tres dimensiones de los especímenes vivos se pueden grabar con altas relaciones de señal a ruido y redujeron significativamente foto-blanqueo, así como foto-toxicidad a lo largo de múltiples direcciones durante períodos que duran varios días. Con más de cuatro años de desarrollo metodológico y un aumento continuo de datos, el tiempo parece conveniente establecer procedimientos operativos estándar para el uso de la tecnología de lámina de luz en la comunidad Tribolium, así como en la comunidad de insectos en general. Este protocolo describe tres técnicas de montaje adecuadas fo diferentes propósitos, presenta dos nuevas líneas Tribolium transgénicos medida apropiada para imágenes en vivo a largo plazo, sugiere cinco colorantes fluorescentes para etiquetar las estructuras intracelulares de embriones fijos y proporciona información acerca de post-procesamiento de datos para la evaluación oportuna de los datos registrados. Los resultados representativos se concentran en imágenes en vivo a largo plazo, seccionamiento óptico y la observación del mismo embrión a lo largo de múltiples direcciones. Los respectivos conjuntos de datos se proporcionan como un recurso descargable. Por último, el protocolo analiza los controles de calidad para los ensayos de formación de imágenes en vivo, las limitaciones actuales y la aplicabilidad de los procedimientos que se indican a otras especies de insectos.
Este protocolo está destinado principalmente a los biólogos del desarrollo que buscan soluciones de imágenes que superan a equipo de laboratorio estándar. Promueve el intento continuo para cerrar la brecha entre los laboratorios / comunidades técnicamente orientada, que se desarrollan y refinan microscopiar metodológicamente, y los laboratorios de ciencias de la vida / comunidades, que requieren soluciones 'plug-and-play' a los desafíos técnicos. Además, es compatible con un enfoque axiomático que mueve las cuestiones biológicas en el centro de atención.
Introducción
El escarabajo de la harina Tribolium castaneum rojo, que pertenece a la gran familia de escarabajos negros (Tenebrionidae), tiene una larga historia dentro de las ciencias agrícolas y de la vida y es el organismo modelo modelo de insectos segunda mejor estudiado después de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Durante las últimas cuatro décadas, se convirtió en un poderoso y popular organismo modelo en la genética del desarrollo de insectos, en la biología del desarrollo evolutivo y, durante los últimos veinte años, en la morfogénesis embrionaria para una variedad de razones:
Drosophila y Tribolium
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Protocolo
1. Cría de Tribolium culturas
NOTA: Las condiciones estándar se definen como una temperatura de incubación de 25 ° C y 70% de humedad relativa en un 12 h brillantes / 12 h ciclo de oscuridad. Para obtener más información sobre Tribolium cría, las guías respectivas 64 están disponibles. Este protocolo requiere dos medios a base de harina diferentes, que se pueden preparar en cantidades kilogramo y almacenados durante varios meses.
- Antes de trabajar con la harina y la levadura seca inactiva, almacenar los paquetes sin abrir a -20 ° C durante 24 h y luego dejar que se caliente a temperatur....
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Resultados
Este protocolo describe un marco experimental para formación de imágenes de fluorescencia de vida o embriones fijados y teñidos Tribolium con LSFM. Debido a los bajos niveles de foto-blanqueador y foto-toxicidad, una consecuencia directa de su capacidad de seccionamiento óptico, LSFM es particularmente muy adecuado para imágenes en vivo a largo plazo.
La novela AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 línea transgénica expres.......
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Discusión
Control de calidad
En los ensayos de formación de imágenes en vivo, el procedimiento de preparación y la grabación debe ser no invasivo, es decir, ni la mecánica y manipulación de productos químicos (recogida, dechorionation, de montaje en el soporte de la muestra), ni la carga integrada de energía durante la observación debe afectar a la viabilidad de la muestra. Para los estudios que caracterizan el desarrollo WT, se recomienda el uso de datos sólo a partir de exp.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Contribuciones de autor
FS y EHKS concibieron la investigación. FS generado las líneas AGOC transgénicas. imágenes de fluorescencia basado en lámina de luz se realizó por FS y SK. FS y EHKS escribió el manuscrito con el aporte de SK.
Agradecimientos
Agradecemos a Sven Plath para soporte técnico. La línea transgénica glía-azul fue una especie de regalo de Gregor Bucher (Göttingen, Alemania). La investigación fue financiada por el Cluster de Excelencia Frankfurt am Main de complejos macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, altavoz Volker Dötsch) otorgado en parte a EHKS en el Instituto Buchmann Molecular Life Sciences (BMLS, director Enrico Schleiff) en el Goethe Universität Frankfurt am Main por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| harina de trigo integral | Demeter e.V. | 1.13E+08 | EE. UU.: harina de trigo integral, Reino Unido: harina de harina integral |
| 405 harina de trigo | fina Demeter e.V. | 1.13E+08 | EE. UU.: harina de repostería, Reino Unido: harina blanda |
| seca inactiva | Flystuff / Genesee Scientific | 62-106 | |
| Saine tamponado con fosfato (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| hipoclorito de sodio, ~12% activo Cl | Sigma Aldrich | 425044-250ML | Precaución: el hipoclorito de sodio es agarosa corrosiva |
| de bajo punto de fusión | Carl Roth | 6351.2 | |
| Placa de 6 pocillos | Orange Scientific | 4430500 | |
| Placa de 24 pocillos | Orange Scientific | 4430300 | |
| capilares de vidrio, internos Ø 0,46 mm | Marca GmbH + Co KG | 7087 09 | |
| SYTOX | Green Thermo Fisher Scientific | 57020 | La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2 |
| Yoduro YOYO-1 | La | Scientific Y3601 | se explica en la Tabla 2 |
| BOBO-3 Yoduro Thermo | Fisher Scientific | B3586 | La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2 |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2 |
| Alexa Fluor 546 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22283 | La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2 |
| tamiz, 800 y micro; m tamaño de malla | VWR International | 200.025.222-051 | |
| tamiz, 710 y micro; m tamaño de malla | VWR International | 200.025.222-050 | para la preparación del medio de crecimiento (paso 1.1) |
| tamiz, 300 y micro; m tamaño de malla | VWR International | 200.025.222-040 | |
| tamiz, 250 y micro; m tamaño de malla | VWR International | 200.025.222-038 | para la preparación del medio de puesta de huevos (paso 1.2) |
| plato de vidrio, Ø 100 mm &veces; 20 mm | Sigma Aldrich | CLS70165102 | |
| colador de celdas, 100 µ m tamaño de malla | BD Biosciences | 352360 | |
| pincel, cabeza y Oslash; 2 mm | Jeringa VWR International | 149-2121 | |
| , 1,0 mL | B. Braun Medical AG | 9166017V | |
| viales de centelleo | Sigma Aldrich | M1152-1000EA | |
| paraformaldehído (PFA) | Sigma Aldrich | 158127 | Precaución: el paraformaldehído es tóxico y corrosivo |
| N-heptano ≥ 99% | Carl Roth | 8654.1 | Precaución: el n-heptano es inflamable y tóxico |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100-100ML | Precaución: Trition X-100 es corrosivo |
Referencias
- Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
- Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
- Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N.
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Reimpresiones y permisos
