Artículo de método

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz Tribolium castaneum Los embriones

DOI:

10.3791/55629

⸱

28 de abril de 2017

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1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

En este artículo

Resumen

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Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Resumen

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El escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum se ha convertido en un importante organismo modelo de insectos en la genética del desarrollo y la biología del desarrollo evolutivo. La observación de embriones Tribolium con microscopía de fluorescencia basada en la lámina de luz tiene múltiples ventajas sobre widefield convencional y microscopía de fluorescencia confocal. Debido a las propiedades únicas de un microscopio a base de lámina de luz, imágenes en tres dimensiones de los especímenes vivos se pueden grabar con altas relaciones de señal a ruido y redujeron significativamente foto-blanqueo, así como foto-toxicidad a lo largo de múltiples direcciones durante períodos que duran varios días. Con más de cuatro años de desarrollo metodológico y un aumento continuo de datos, el tiempo parece conveniente establecer procedimientos operativos estándar para el uso de la tecnología de lámina de luz en la comunidad Tribolium, así como en la comunidad de insectos en general. Este protocolo describe tres técnicas de montaje adecuadas fo diferentes propósitos, presenta dos nuevas líneas Tribolium transgénicos medida apropiada para imágenes en vivo a largo plazo, sugiere cinco colorantes fluorescentes para etiquetar las estructuras intracelulares de embriones fijos y proporciona información acerca de post-procesamiento de datos para la evaluación oportuna de los datos registrados. Los resultados representativos se concentran en imágenes en vivo a largo plazo, seccionamiento óptico y la observación del mismo embrión a lo largo de múltiples direcciones. Los respectivos conjuntos de datos se proporcionan como un recurso descargable. Por último, el protocolo analiza los controles de calidad para los ensayos de formación de imágenes en vivo, las limitaciones actuales y la aplicabilidad de los procedimientos que se indican a otras especies de insectos.

Este protocolo está destinado principalmente a los biólogos del desarrollo que buscan soluciones de imágenes que superan a equipo de laboratorio estándar. Promueve el intento continuo para cerrar la brecha entre los laboratorios / comunidades técnicamente orientada, que se desarrollan y refinan microscopiar metodológicamente, y los laboratorios de ciencias de la vida / comunidades, que requieren soluciones 'plug-and-play' a los desafíos técnicos. Además, es compatible con un enfoque axiomático que mueve las cuestiones biológicas en el centro de atención.

Introducción

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El escarabajo de la harina Tribolium castaneum rojo, que pertenece a la gran familia de escarabajos negros (Tenebrionidae), tiene una larga historia dentro de las ciencias agrícolas y de la vida y es el organismo modelo modelo de insectos segunda mejor estudiado después de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Durante las últimas cuatro décadas, se convirtió en un poderoso y popular organismo modelo en la genética del desarrollo de insectos, en la biología del desarrollo evolutivo y, durante los últimos veinte años, en la morfogénesis embrionaria para una variedad de razones:

Drosophila y Tribolium ambos pertenecen a la Holometabola, pero se separaron hace aproximadamente 300 millones de años 1, 2, 3, 4. Mientras que el desarrollo embrionario de Drosophila se considera comúnmente como altamente derivada, Tribolium muestra un modo más ancestral de develrrollo que se encuentra en una proporción considerablemente mayor de especies de insectos 5, 6, 7, 8, 9. En primer lugar, Tribolium exhibe desarrollo de la cabeza no involutiva, es decir, sus partes de la boca y las antenas ya surgen durante la embriogénesis 10, 11, 12, 13, 14, 15. En segundo lugar, Tribolium sigue los principios de desarrollo a corto germen, es decir, segmentos abdominales se añaden secuencialmente a partir de una zona de crecimiento posterior durante la elongación germband 16, 17, 18, 19. En tercer lugar, Tribolium desarrolla y se degrada más tardedos membranas extraembrionarias es decir, el amnios, que cubre el embrión solamente ventralmente, y la serosa, que envuelve el embrión completamente 20, 21, 22. Ambas membranas juegan un morfogenética fundamental 23 así como la función de protección contra los microorganismos 24, 25 y la desecación 26. En cuarto lugar, las piernas embrionaria en desarrollo son totalmente funcionales durante la etapa de la vida de las larvas y sirven como los primordios de las piernas de adultos durante la metamorfosis de pupa 27, 28, 29, 30, 31.

Debido a su tamaño y modestos pequeñas demandas, el cultivo de Tribolium en el laboratorio es bastante sencillo. Los cultivos de tipo salvaje (WT) cepas o líneas transgénicas consisten típicamente de alrededor de 100-300 adultos y puede mantenerse dentro de botellas de un litro de vidrio (la huella de 80 cm 2) lleno de tres a cuatro centímetros de alto (aproximadamente 50 g) con medio de crecimiento que consiste en trigo de grano completo harina suplementado con levadura seca inactiva. Un suministro de agua no es necesario. Esto permite que incluso pequeños laboratorios para mantener docenas de culturas escarabajo dentro de incubadoras de insectos comercialmente disponibles pequeñas o medianas. Etapas de desarrollo posteriores de Tribolium (larvas después de aproximadamente el cuarto instar, pupas y adultos) se separan fácilmente del medio de crecimiento por tamizado. embriones sincronizados se obtienen mediante la incubación de los adultos, por períodos cortos en medio de puesta de huevos. Para el desarrollo rápido, culturas escarabajo se mantienen a 32 ° C (alrededor de cuatro semanas por generación), mientras se mantiene de stock se realiza típicamente a 22-25 ° C (aproximadamente diez semanas por generación).

En la última década, muchos tec normahniques se han ido adaptando y optimizado para Tribolium, que se resumen en los libros Emergentes organismos modelo 32. De gran importancia son avanzados métodos genéticos tales como embrionario 33, larval 34, 35 o parental 36, 37 de ARN basado en la interferencia desmontables gen, la transformación de la línea germinal, ya sea con la piggyBac 38, 39 o el sistema de transposasa de Minos 40 y CRISPR / genoma basado en Cas9 ingeniería 41. Además, el genoma Tribolium ha sido secuenciado hace aproximadamente una década 42, y ahora está en la tercera ronda del genoma conjunto de liberación 43, que permite la identificación eficiente y de todo el genoma y el análisis sistemático de los genes 44 u otros elementos genéticos 45, 46. Además, los genomas de otras cuatro especies de coleópteros están disponibles para los enfoques genéticos comparativos 47, 48, 49, 50. En asociación con el genoma secuenciado, dos análisis genéticos a gran escala se han realizado, es decir, una pantalla de mutagénesis de inserción 51 y una pantalla gen desmontables basado en la interferencia de ARN sistemática 52, 53.

Fluorescencia de imágenes en vivo con campo amplio, confocal o microscopía basada en la lámina de luz (LSFM) permite observar la morfología embrionaria de Tribolium como una función del tiempo (es decir, la morfogénesis) en un contexto multi-dimensional (Tabla 1). En campo amplio y fluorescencia confocal de microscopía, la Excitación y la emisión de luz se guía a través de la misma lente objetivo. En ambos enfoques, la muestra entera se ilumina para cada plano de dos dimensiones grabado. Por lo tanto, las muestras se someten a niveles muy altos de energía. En LSFM, sólo los fluoróforos en el plano focal se excitan debido a un desacoplamiento de la iluminación y la detección mediante el uso de dos lentes de objetivo perpendicularmente dispuestas (Figura 1). LSFM viene en dos implementaciones canónicas - el plano único de iluminación de microscopio (SPIM) y el microscopio de fluorescencia basada en la lámina de luz láser escaneado digital (DSLM, la Figura 2) - y ofrece varias ventajas cruciales sobre los enfoques tradicionales: (i) capacidad de seccionamiento óptico intrínseco, (ii) resolución buena axial, (iii) fuertemente reducido nivel de foto-blanqueo, (iv) muy bajo foto-toxicidad, (v) alta relación señal-ruido, (vi) relativamente alta velocidad de adquisición, (vii) de formación de imágenes a lo largo de múltiples direcciones y (viii) la penetración de tejido más profundo debido a la utilización de apertura numérica iluminación baja lentes de objetivo 54, 55, 56.

LSFM ya se ha aplicado con éxito en Tribolium para documentar casi toda la morfogénesis embrionaria 57 y para analizar los principios de la ruptura de la membrana extra-embrionario al inicio del cierre dorsal 23. Para aumentar el atractivo de LSFM en la comunidad Tribolium y para la ciencia de insectos en general, es de gran importancia para establecer procedimientos normalizados de trabajo y para mejorar los métodos, protocolos y el conjunto de recursos a un nivel en el microscopio se convierte en una facilidad de -use herramienta estándar en los laboratorios de biología del desarrollo, y las cuestiones biológicas permanecen en el centro de atención.

Este protocolo comienza con los fundamentos de Tribolium </ em> cultivo, es decir, el mantenimiento, la reproducción y la recolección de los embriones. A continuación, se ilustran dos estrategias experimentales: (i) de formación de imágenes en vivo de las líneas transgénicas a medida y (ii) de formación de imágenes de embriones fijos que se tiñeron con colorantes fluorescentes (Tabla 2). Posteriormente, tres técnicas de montaje con ligeramente diferentes propósitos se explican en detalle (Figura 3 y en la Tabla 3): (i) la columna de agarosa, (ii) el hemisferio agarosa y (iii) el nuevo soporte de tela de araña. El protocolo a continuación se explica el procedimiento de adquisición de datos con LSFM. modalidades de imagen y consideraciones clave se describen. Por último, la recuperación de embriones se explica y se proporcionan sugerencias para el procesamiento de datos básicos. En los resultados representativos, datos de imágenes en vivo de dos novela hechos a medida y se muestran las 58 líneas transgénicas Glia-azul y los respectivos conjuntos de datos de formación de imágenes se proporcionan como un recurso descargable. Además, una imagense presentan los datos de los embriones fijos que se tiñeron con una variedad de colorantes fluorescentes. La discusión se centra en el control de calidad, las limitaciones actuales del enfoque de imágenes en vivo y la adaptación del protocolo con otras especies.

El protocolo está escrito para microscopios de fluorescencia basada en la lámina de luz que están equipadas con una cámara de muestra y un mecanismo de abrazadera giratoria para los titulares estandarizados de muestra 54, 59, 60, que son típicamente elementos en forma de cilindro de metal, plástico o vidrio con un diámetro en el rango de milímetros. El protocolo también es adecuado tanto para las implementaciones canónicas, es decir, SPIM y DSLM, así como para configuraciones con dos o más brazos de iluminación y detección 61, 62, 63. Los resultados representativos muestran datos de dos canales espectrales, verde (ILlumination con un láser de 488 nm, la detección a través de un filtro de 525/50 de paso de banda) y rojo (iluminación con un láser de 561 nm, la detección a través de un filtro de 607/70 de paso de banda), pero el protocolo se puede ampliar a tres o cuatro canales espectrales.

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Protocolo

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1. Cría de Tribolium culturas

NOTA: Las condiciones estándar se definen como una temperatura de incubación de 25 ° C y 70% de humedad relativa en un 12 h brillantes / 12 h ciclo de oscuridad. Para obtener más información sobre Tribolium cría, las guías respectivas 64 están disponibles. Este protocolo requiere dos medios a base de harina diferentes, que se pueden preparar en cantidades kilogramo y almacenados durante varios meses.

  1. Antes de trabajar con la harina y la levadura seca inactiva, almacenar los paquetes sin abrir a -20 ° C durante 24 h y luego dejar que se caliente a temperatura ambiente. Este procedimiento elimina los patógenos potenciales.
  2. Pasar la harina de trigo de grano completo y levadura seca inactiva a través de un tamiz con tamaño de malla de 710! M, a continuación, preparar un medio de crecimiento por que complementa la harina de grano completo tamizada con 5% (w / w) tamizada levadura seca inactiva.
  3. Pasar 405 harina de trigo fina y levadura seca inactiva a través de un tamiz con 250 & #181; m tamaño de malla, a continuación, preparar el medio de puesta de huevos por que complementa la harina de trigo fina 405 tamizada con 5% (w / w) tamizada levadura seca inactiva.
  4. Pasar el respectivo cultivo Tribolium través un tamiz con 800 tamaño de malla m. Descartar el medio de crecimiento sobrante. Transferir las larvas, pupas y adultos a un gran plato de cristal.
  5. Si no existe una cultura de la progenie, transferir alrededor de 80 larvas y / o pupas a una nueva botella de vidrio para establecer una nueva cultura progenie. Si no hay larvas y / o pupas están presentes, toma alrededor de 40 adultos en su lugar. Añadir 50 g de medio de crecimiento e incubar en condiciones estándar.
  6. Recoger alrededor de 300 adultos (500-700 mg) en otra nueva botella de vidrio para establecer la cultura de la imagen. Añadir 50 g de medio de crecimiento e incubar en condiciones estándar. Dejar que la cultura de formación de imágenes se asiente durante al menos 24 h en el medio de cultivo fresco antes de la recolección de embriones.
  7. Reemplazar el medio de crecimiento de la cultura de imágenes por lo menos cada dos queEks, lo que se puede hacer en conjunto con la recolección de embriones (ver 3.2). Después de dos o tres meses, sustituir la cultura de imagen completamente por nuevos adultos del cultivo de la progenie.
  8. Si se utiliza una línea transgénica no homocigótica, curate los cultivos de progenie con frecuencia eliminando animales no transgénicos. Idealmente, genere líneas homocigóticas si el transgén respectivo no es letal o causa esterilidad cuando está presente en ambos cromosomas. Típicamente, los cultivos homocigóticos tienen un nivel de fluorescencia medio más alto y las condiciones experimentales globales son más estrechas, ya que sólo hay un genotipo presente.

2. Configuración y Calibración del Microscopio

NOTA: El embrión de Tribolium tiene una longitud anterior-posterior de aproximadamente 600-660 μm y un diámetro transversal de aproximadamente 300-330 μm. La mayoría de las cámaras CCD modernas tienen un tamaño de chip de sensor de aproximadamente 9 mm x 7 mm, es decir , un diámetro de 11,4 μm y una distancia de pixel-pixel de 6,45 μm.Cuando se combina con una lente objetivo de 10X de aumento, el embrión se pueden obtener imágenes in toto con un tamaño de píxel de 0,645 m. La mayoría de cámaras sCMOS modernos tienen un tamaño más grande chip sensor de alrededor de 16 mm x 14 mm, es decir, un diámetro de 21,3 m, y una distancia de píxel a píxel de 6,5 m. Cuando se combina con una lente de objetivo 20X, el embrión se pueden obtener imágenes in toto con un tamaño de píxel de 0,325 m.

  1. Una las lentes de iluminación y objetivos de detección al microscopio. Asegúrese de que los láseres y filtros de fluorescencia se ajustan a la absorción fluoróforo y espectros de emisión muy bien.
  2. Coloque la cámara de muestras para el microscopio. Llenar la cámara de muestras con PBS pH 7,4 o cualquier otro tampón de formación de imágenes apropiado.
  3. Encender y calibrar el microscopio. rutinas y pautas de solución de problemas para los microscopios de luz a base de hoja hechas a medida (más específicamente para la aplicación DSLM) de calibración integral se han publicado previously 65. Para los dispositivos comerciales, siga las instrucciones del fabricante con mucho cuidado. El manejo incorrecto podría agotar la cámara de muestra del medio y causar estragos en el instrumento, así como la muestra.

3. Recolección de embriones transgénicos o WT

  1. Pasar la colonia de formación de imágenes a través de un tamiz con tamaño de malla de 800 micras. Recoger los escarabajos adultos en una nueva botella de vidrio y añadir 10 g de medio de puesta de huevos. Incubar el cultivo de puesta de huevos durante 1 hora a 25 ° C y 70% de humedad relativa en la luz.
  2. Pasar la cultura de puesta de huevos a través de un tamiz con tamaño de malla de 800 micras para separar adultos del medio de la puesta de huevos, que contiene alrededor de 30-100 embriones. Transferencia adultos a una nueva botella de vidrio y añadir el antiguo o 50 g de medio de crecimiento fresco.
  3. Si la observación debe comenzar en la etapa de blastodermo uniforme (ejemplo conjunto de datos DS0002), se incuba el medio de puesta de huevos durante 15 h a 25 ° C y 70% de humedad relativa. To comenzar por el principio de la retracción germband (ejemplo conjuntos de datos DS0001 y DS0003), incubar los embriones durante 23 h a 32 ° C y 70% de humedad relativa. Si se desean otras etapas de desarrollo, consulte la literatura respectiva 64, 65 y adaptar el tiempo y / o temperatura de incubación como sea necesario.

4. Embrión dechorionation

NOTA: El corion es la capa externa de la cáscara del huevo y consiste en proteínas y polisacáridos. Es fuertemente la luz absorbente pero no es esencial para el desarrollo adecuado y por lo tanto se puede eliminar químicamente.

  1. Pasar el medio de puesta de huevos a través de un tamiz con tamaño de malla de 300 micras. Recoger los embriones en un filtro de células con tamaño de malla de 100 micras y desechar el medio de puesta de huevos sobrante.
  2. Preparar una placa de 6 pocillos como sigue: llenar el A1, A2, A3 y B3 pozos con 10 ml de PBS pH 7,4 y los pocillos B1 y B2 con 9 ml de PBS. A continuación, añadir con cuidado1 ml de hipoclorito de sodio a B1 y B2. Observar el progreso de los pasos 4.3 a 4.8 bajo el microscopio estereoscópico. hipoclorito de sodio PRECAUCIÓN es corrosivo.
  3. Insertar el filtro de células en el pocillo A1 (PBS pH 7,4) y lavar los embriones durante un minuto bajo agitación suave. partículas de harina grandes deben desprenderse de los embriones.
  4. Transferir el filtro de células al pocillo B1 (hipoclorito de sodio en PBS pH 7,4) y agitar la placa vigorosamente durante 30 s. Las partículas de harina restantes deben desprenderse completamente de los embriones.
  5. Transferir el filtro de células a la A2 bien (PBS pH 7,4) y lavar los embriones durante 1 min con agitación suave.
  6. Para dechorionation, transferir el filtro de células al pocillo B2 (hipoclorito de sodio en PBS pH 7,4). Agitar la placa vigorosamente hasta que se rompe el corion y se separa de los embriones. El corion se ve como una membrana delgada, semi-transparente con bordes lacerados, mientras que los embriones dechorionated tienen una silueta llanura.
  7. º de transferenciacélulas colador e para el A3 bien (PBS pH 7,4) y lavar los embriones durante 1 min con agitación suave. Si cualquier fragmento chorion todavía están unidos a los embriones después del lavado, repetir el paso 4.6.
  8. Almacenar los embriones en el bien B3 (PBS pH 7,4). Almacenamiento durante varias horas no hace daño a los embriones, pero hay que tener en cuenta que el desarrollo continúa.
  9. Para las líneas transgénicas no homocigotos, eliminar cualquier embriones no fluorescentes si es posible. Para la fijación y la tinción de WT o embriones transgénicos, continúe con el paso 5. Para imágenes en vivo de embriones transgénicos, continúe con el paso 6.

5. vitelina membrana permeabilización, fijación y tinción

NOTA: La membrana vitelina es la capa interna de la cáscara de huevo. Es impermeable para los colorantes fluorescentes y por lo tanto tiene que ser permeabilizadas químicamente antes de la tinción.

  1. Llene un vial de centelleo con solución de fijación / permeabilización (1,5 ml 4% (w / v) de paraformaldehído en PBS pH 6,9 unnd 1,5 ml de n-heptano). Transferencia de embriones con un pincel a los viales. viales Cubrir con papel de aluminio para protegerlo de los fluoróforos de la luz y se incuban durante 30 min en una plataforma oscilante a 50 rotaciones por minuto. PRECAUCIÓN paraformaldehído es tóxico y corrosivo, n-heptano es inflamable y tóxico.
  2. Retire la solución de fijación y el tratamiento de los embriones tres veces durante 15 minutos en 3 ml de 0,1% (v / v) de Triton X-100 en PBS pH 7,4 y, posteriormente, una vez durante 15 minutos en 3 ml de 1% (v / v) de Triton X-100 en PBS pH 7,4 en una plataforma oscilante a 50 rotaciones por minuto. PRECAUCIÓN Triton X-100 es corrosivo.
  3. Retire la solución de permeabilización y añadir 0,5 ml solución de tinción al vial. Soluciones de tinción de ejemplo se proporcionan en la Tabla 2. embriones de manchas durante la noche a 4 ° C en una plataforma oscilante a 50 rotaciones por minuto. Para los colorantes propuestos en la Tabla 2, el lavado no es necesario.

6. Preparación de montaje de agarosa

  1. Añadir 1 g bajo punto de fusiónde agarosa a 100 ml de PBS pH 7,4 y se calienta la mezcla durante 2-3 min en un horno microondas a 800 W. Si las pequeñas partículas de agarosa todavía están presentes, repetir el proceso de calentamiento en intervalos de 30 segundos hasta que las partículas se disuelven completamente. La agarosa de montaje no necesita estar preparado recién cada vez, el solidificado de agarosa se puede re-licuados por calentamiento como se describe anteriormente. Este proceso se puede repetir 5-6 veces antes de demasiada agua se ha evaporado.
  2. Permitir que la agarosa se enfríe a aproximadamente 40-45 ° C, a continuación, llenar dos tubos de reacción de 1,5 ml con la agarosa climatizada y mantener esos tubos a 35 ° C en un termobloque.

7. Montaje de embriones y la inserción en la cámara de muestras

  1. Opción 1: columna de agarosa (Figura 3A -C, primera columna; Tabla 3, segunda columna)
    1. Llene una jeringa ml 1,0 con agua destilada y adjuntarlo a una de las aberturas capilares de vidrio mediante el uso de una manguera de goma.Llenar hasta la mitad el capilar con agua destilada.
    2. Escoja un embrión con un pincel y colocarlo en el lado interior de la otra abertura capilar de vidrio. Proceder rápidamente al siguiente paso antes de que el embrión se seca.
    3. Pegar el capilar en la agarosa líquido y lentamente sacar algunas l de agarosa líquida junto con el embrión en el capilar. A continuación, aumentar rápidamente la fuerza de estirado de manera que el embrión es arrastrado junto con la agarosa. Al final, unos pocos l de agarosa debe estar por encima y por debajo del embrión. Establecer el capilar a un lado por unos minutos y dejar que la agarosa solidifique.
    4. Acortar el capilar con un cortador de vidrio de diamante a una longitud de aproximadamente 5 mm. El fragmento restante debe estar completamente lleno de agarosa y el embrión debe estar dentro del segundo cuartil.
    5. Insertar el cilindro de acero con el pasador en la cámara de muestra, y luego se adhieren el fragmento capilar en la parte superior del pasador. La columna de agarosa debe sobresalir unos pocos milímetros fesde el fragmento capilar con la parte que contiene el embrión.
  2. Opción 2: hemisferio agarosa (Figura 3A -C, segunda columna; Tabla 3, tercera columna)
    1. Dibuje 200 l de agarosa líquido en un ml jeringa 1,0, a continuación, utilizar para llenar el tubo de acero desde la parte superior con la agarosa hasta que se forma un hemisferio en la abertura inferior. El diámetro hemisferio debe ser igual al diámetro de la tubería. Esperar unos minutos hasta que la agarosa se ha solidificado.
    2. Escoja un embrión con un pincel y reorganizar en la punta del cepillo de manera que el extremo anterior se hace accesible. Sumergir el hemisferio agarosa en agarosa líquidos para cubrir con una película delgada.
    3. Coloque el embrión con su extremo anterior en posición vertical sobre el polo del hemisferio agarosa. Girar el tubo de acero alrededor y corregir la posición del embrión con el cepillo. Si es necesario, estabilizar el embrión mediante la adición de 2 l de agarosa para la frontera embrión / hemisferio. IdealLy, menos de la mitad de la superficie de embrión debe ser cubierto en agarosa y los flancos debe ser tan pronunciada como sea posible.
    4. Inserte la tubería de acero con el hemisferio y el embrión lentamente en la cámara de muestra.
  3. Opción 3: soporte de Telaraña (Figura 3A -C, tercera columna; Tabla 3, cuarta columna)
    1. Escoja un embrión con un pincel y déjelo a un lado.
    2. Cubrir el orificio ranurado del soporte de tela de araña con 5-8! L de agarosa líquida, a continuación, eliminar la mayor parte de la agarosa hasta que sólo una película de agarosa delgada permanece.
    3. Coloque el embrión sobre la película de agarosa y ajustar su posición. mover con cuidado el embrión al centro x-eje del agujero ranurado, y alinear su eje anterior-posterior alargada con el eje alargado del agujero ranurado.
    4. Insertar el soporte telaraña con el embrión montado lentamente en la cámara de muestra. Coloque el soporte de tela de araña para que no interfiera con la excitación y la emisiónluz, es decir, 45 ° con respecto a los ejes x y el eje z.

a base de hoja 8. Luz microscopía de fluorescencia

  1. Decidir a lo largo de la cantidad de direcciones (y a lo largo de la cual orientaciones) el embrión debe ser reflejado. Cuatro direcciones (a lo largo de las orientaciones 0 °, 90 °, 180 ° y 270 °) típicamente proporcionan un buen equilibrio entre la cobertura y la carga de energía.
  2. Configurar el número de canales de fluorescencia. Los principales parámetros para cada canal son la línea de láser, el filtro de fluorescencia, la potencia del láser y el tiempo de exposición. Para imágenes en vivo a largo plazo, es importante que la carga integrada de energía no supera la tolerancia del embrión. Un tiempo de exposición de 25-50 ms garantiza imágenes rápidas, mientras que un láser de potencia entre 100 y 300 mW no debería afectar a la viabilidad del embrión. Para las muestras fijas, tiempo de exposición y la potencia del láser puede ser al menos el doble.
  3. Para los ensayos de formación de imágenes en vivo, configurar el lapso de tiempo. el borradorlete embriogénesis de Tribolium toma aproximadamente siete días a temperatura ambiente (23 ± 1 ° C) y un poco menos de tres días a 32-35 ° C 64. Definir el intervalo temporal de acuerdo a los eventos morfogenéticos que deben ser observadas. Para intervalos temporales cortos, considerar reducir el tiempo de exposición y la potencia del láser (véase 8.2).
  4. Coloque el embrión en el modo de luz de transmisión a lo largo de los ejes x e y ejes en el centro del campo de vista sin exponerlo al láser. Girar el embrión por 360 ° en pasos de 90 ° para examinar el embrión de cualquier daño que pudiera haber ocurrido durante el proceso de montaje.
  5. Girar el embrión apropiadamente alrededor del eje y para alinear los ejes embrionarios con los ejes de microscopio, por ejemplo, el eje lateral con el eje x, es decir, el eje dorsoventral con el eje z. Cuando se utiliza la técnica de soporte de tela de araña, la alineación podría no ser posible.
  6. En el modo de fluorescencia, definir el z-stack for cada dirección. Añadir 25-50 micras como tampón espacial por delante y por detrás del embrión. Incluyendo el tampón, el típico z-stack cubre alrededor de 350-400 micras para un embrión Tribolium. También definir el z-separación, que debe ser cuatro veces la separación lateral, es decir, la separación a lo largo de los ejes x y y-ejes 66.
  7. Si dos o más embriones son imágenes en paralelo, reiniciar en 8,4 con la siguiente embrión.
  8. Para formación de imágenes a largo plazo, asegúrese de que la cámara de muestra se llena con suficiente PBS pH 7,4 u otro tampón de formación de imágenes. cubrir también la abertura de la cámara de muestra.
  9. Iniciar el proceso de obtención de imágenes. Para imágenes en vivo a largo plazo, monitorear la adquisición correcta a lo largo de todas las direcciones en todos los canales para todos los embriones. comprobar de vez en cuando durante los próximos días que los embriones están vivos y en la posición adecuada.

9. Recuperación de embriones y Control de Calidad

  1. Una vez de formación de imágenes se ha completado, retire el soporte de muestras conlos embriones de la cámara de muestra. Sólo los embriones de los ensayos de formación de imágenes en vivo tienen que ser recuperados. embriones fijadas y teñidas pueden ser descartados.
  2. Si se realizó un ensayo de formación de imágenes en vivo, la transferencia del embrión a una diapositiva objeto. Para la técnica de columna de agarosa, extraer los embriones de los alrededores de agarosa con un bisturí, micro-cuchillo o cuchilla de afeitar. Para la técnica hemisferio agarosa, transferir el hemisferio con el lado plano a la corredera objeto. la eliminación del embrión no es necesario. Para la técnica de soporte de telaraña, desmontar suavemente los embriones de la película de agarosa con un pincel. Incubar el portaobjetos objeto en un pequeño plato de vidrio en atmósfera saturada de humedad bajo condiciones estándar hasta que la eclosión de las larvas.
  3. Después de la eclosión, las larvas transferir a los pocillos individuales de una placa de 24 pocillos y añadir 500 mg de medio de crecimiento a cada pocillo. Incubar en condiciones estándar. Comparar el tiempo de desarrollo total y la morfología de las larvas fotografiado a WT no imagen y larv transgénicoAE (véase el debate). En los ensayos que caracterizan el desarrollo WT, no hay aberraciones morfológicas obvias idealmente deben ser notable.
  4. Una vez que el desarrollo de las larvas a adultos sanos, proporcionarles socios WT apropiados de la misma cepa de fondo. Después de dos semanas, la verificación de la producción de progenie. Considera también para comprobar la fertilidad de la descendencia en el apareamiento ellas inter pares. Sólo cuando los embriones fotografiados desarrollan en adultos fértiles que producen progenie fértil, el procedimiento de formación de imágenes se puede considerar no invasiva.

10. Imagen de Proceso de Datos

NOTA: Para el procesamiento de datos de imagen, se recomiendan los de código abierto de software de procesamiento de imágenes ImageJ 67 o su derivado FIJI 68. Ambas versiones, así como una amplia documentación se encuentran en www.imagej.net. El formato de archivo estándar para los datos LSFM es el formato de archivo de imagen etiquetada (TIFF). La opción recipiente intrínseca permite que el storabia de pilas de imágenes tales como z-pilas o series de tiempo de proyecciones de máxima z dentro de un único archivo que se pueden abrir en ImageJ o FIJI través de arrastrar y soltar.

  1. Si es necesario, rotar los z-pilas para alinear el eje anterior-posterior del embrión con el eje y (Imagen → Transformar → Rotar). Tenga en cuenta que los parámetros de rotación deben ser configurados individualmente para cada dirección, pero no para el lapso de tiempo y los canales de fluorescencia.
  2. Recortar la z-pilas a lo largo de los ejes x, y, z ejes de modo que sólo el fondo mínimo (20 - 40 píxeles a lo largo de la x e y ejes, 5 - 10 aviones a lo largo del eje z) se mantiene (para la x - e y ejes, utilice la herramienta de selección rectangular, a continuación, imagen → Recortar, porque el eje z, el uso de imagen → Pilas → Herramientas → rebanada Guardián). Tenga en cuenta que los parámetros de cultivo deben ser configurados individualmente para cada dirección, pero no para los puntos de tiempo y los canales de fluorescencia.
  3. Calcular la máxima proyección z para cada z-stack(Imagen → → Z Pilas proyecto, elija Max Intensidad). cálculos de proyección de intensidad son procedimientos de simplificación de datos que eliminan una dimensión espacial.
  4. Para los datos de imágenes en vivo a largo plazo, considerar el uso de una secuencia de comandos o ImageJ FIJI que realiza el procesamiento de los pasos 10.01 a 10.03 para todas las direcciones, todos los puntos de tiempo y todos los canales de fluorescencia 65. Idealmente, concatenar todas las proyecciones Z máxima por canal y la dirección y guardarlos como una serie de tiempo en un recipiente TIFF. Alternativamente, el BigDataViewer 69 plug-in para Fiji se puede utilizar para navegar a través de Terabyte-grandes conjuntos de datos.
  5. Dependiendo de la línea y de imagen modalidades transgénicos, los ajustes de intensidad dinámicas de las pilas de tiempo podrían ser deseable debido a la foto-blanqueo y / o fluctuaciones de expresión fluoróforo. O bien el ImageJ- o intrínseco FIJI-Bleach función de corrección (Imagen → Ajustar → Corrección Bleach, seleccione Histograma Matching) o dedicasoftware de Ted 65 se sugieren.
  6. Se recomiendan si el embrión se grabó y / oa lo largo de múltiples direcciones y en múltiples canales de fluorescencia, la combinación horizontal de las direcciones (Imagen → Pilas → Herramientas → Combinar) y de combinación de canal (color de imagen → → Merge Canales).
  7. Registro y fusión de z-pilas adquiridos a lo largo de múltiples direcciones 70, con el tiempo en combinación con deconvolución 71, permite el cálculo de imágenes tridimensionales superiores de calidad uniforme y resolución isotrópica. Ambos plug-ins son de código abierto y pre-instalado en Fiji, pero requieren la presencia de puntos de referencia (microesferas fluorescentes, por ejemplo, perlas) alrededor de la muestra.
  8. Marcos de software de código abierto para la extracción de datos cuantitativos a gran escala y el análisis también están disponibles, por ejemplo, para la segmentación y seguimiento de los núcleos de las células 72 o celreconocimiento de formas l 73.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un marco experimental para formación de imágenes de fluorescencia de vida o embriones fijados y teñidos Tribolium con LSFM. Debido a los bajos niveles de foto-blanqueador y foto-toxicidad, una consecuencia directa de su capacidad de seccionamiento óptico, LSFM es particularmente muy adecuado para imágenes en vivo a largo plazo.

La novela AGOC {ATub'H2B-mEmerald} # 1 línea transgénica expresa un...

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Discusión

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Control de calidad

En los ensayos de formación de imágenes en vivo, el procedimiento de preparación y la grabación debe ser no invasivo, es decir, ni la mecánica y manipulación de productos químicos (recogida, dechorionation, de montaje en el soporte de la muestra), ni la carga integrada de energía durante la observación debe afectar a la viabilidad de la muestra. Para los estudios que caracterizan el desarrollo WT, se recomienda el uso de datos sólo a partir de exp...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Contribuciones de autor

FS y EHKS concibieron la investigación. FS generado las líneas AGOC transgénicas. imágenes de fluorescencia basado en lámina de luz se realizó por FS y SK. FS y EHKS escribió el manuscrito con el aporte de SK.

Agradecimientos

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Agradecemos a Sven Plath para soporte técnico. La línea transgénica glía-azul fue una especie de regalo de Gregor Bucher (Göttingen, Alemania). La investigación fue financiada por el Cluster de Excelencia Frankfurt am Main de complejos macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, altavoz Volker Dötsch) otorgado en parte a EHKS en el Instituto Buchmann Molecular Life Sciences (BMLS, director Enrico Schleiff) en el Goethe Universität Frankfurt am Main por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
harina de trigo integralDemeter e.V.1.13E+08EE. UU.: harina de trigo integral, Reino Unido: harina de harina integral
405 harina de trigofina Demeter e.V.1.13E+08EE. UU.: harina de repostería, Reino Unido: harina blanda
seca inactivaFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine tamponado con fosfato (PBS), pH 7.4Thermo Fisher Scientific10010-023
hipoclorito de sodio, ~12% activo ClSigma Aldrich425044-250MLPrecaución: el hipoclorito de sodio es agarosa corrosiva
de bajo punto de fusiónCarl Roth6351.2
Placa de 6 pocillosOrange Scientific4430500
Placa de 24 pocillosOrange Scientific4430300
capilares de vidrio, internos Ø 0,46 mmMarca GmbH + Co KG7087 09
SYTOXGreen Thermo Fisher Scientific57020La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2
Yoduro YOYO-1LaScientific Y3601se explica en la Tabla 2
BOBO-3 Yoduro ThermoFisher ScientificB3586La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2
Alexa Fluor 546 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22283La preparación de la solución de tinción se explica en la Tabla 2
tamiz, 800 y micro; m tamaño de mallaVWR International200.025.222-051
tamiz, 710 y micro; m tamaño de mallaVWR International200.025.222-050para la preparación del medio de crecimiento (paso 1.1)
tamiz, 300 y micro; m tamaño de mallaVWR International200.025.222-040
tamiz, 250 y micro; m tamaño de mallaVWR International200.025.222-038para la preparación del medio de puesta de huevos (paso 1.2)
plato de vidrio, Ø 100 mm &veces; 20 mmSigma AldrichCLS70165102
colador de celdas, 100 µ m tamaño de mallaBD Biosciences352360
pincel, cabeza y Oslash; 2 mmJeringa VWR International149-2121
, 1,0 mLB. Braun Medical AG9166017V
viales de centelleoSigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldehído (PFA)Sigma Aldrich158127Precaución: el paraformaldehído es tóxico y corrosivo
N-heptano &GE; 99%Carl Roth8654.1Precaución: el n-heptano es inflamable y tóxico
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLPrecaución: Trition X-100 es corrosivo
levadura preparación de la solución de tinción de Thermo Fisher

Referencias

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