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Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas

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DOI:

10.3791/55634

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10 de mayo de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Institute of Immunobiology, Kantonsspital St. Gallen, 2Internal Medicine V, Medical University of Innsbruck, 3Tyrolean Cancer Research Institute (TKFI), 4Medical Clinic III, Oncology, Hematology, Immunoncology and Rheumatology, University Clinic Bonn (UKB)

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Métodos que permiten la caracterización y el aislamiento de las poblaciones de células madre de muestras biológicas son fundamentales para el avance de los tratamientos dirigidos a células madre en el cáncer y más allá. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de células madre de cáncer utilizando el fenotipo de población lateral desencadenada por tinte.

Resumen

El cáncer es una enfermedad conducida por células madre y la erradicación de estas células se ha convertido en un objetivo terapéutico importante. La desciframización de las vulnerabilidades de las células madre de cáncer (CSC) y la identificación de objetivos moleculares adecuados se basa en métodos que permiten su discriminación específica en muestras heterogéneas tales como líneas celulares y tejido tumoral ex vivo . La citometría de flujo / FACS es una poderosa tecnología para diseccionar de forma multiparamétrica muestras biológicas a nivel de célula única y es hasta la fecha el método de elección para recuperar células vivas para análisis de aguas abajo. Los marcadores de superficie tales como CD44 y CD133, así como la detección de actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa, se han utilizado a menudo para definir y clasificar CSCs de muestras tumorales mediante FACS. Un enfoque complementario, descrito aquí en detalle metodológico, hace uso de la extrusión de colorante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica una población distinta de células fluorescentes-dim comúnmente denominadas población lateral (SP). SP, Las células cancerosas exhiben características de células madre canónicas y pueden ser anuladas y confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inhiben el transportador de fármacos extruyendo el colorante (más frecuentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Además, el ensayo de SP es compatible con otras evaluaciones de citometría de flujo tales como tinción de antígenos de superficie, detección de aldehído deshidrogenasa y discriminación de células muertas ( por ejemplo , con 7-AAD o yoduro de propidio (PI)). Por lo tanto, describimos un valioso y ampliamente aplicable método de CSC de identificación, aislamiento y sub-caracterización mecánica basada en un funcional, en lugar de un parámetro fenotípico. Aunque originalmente se realizó con Hoechst 33342 como colorante desencadenante, aquí nos centramos en el fenotipo más reciente basado en colorante Violeta SP que se puede resolver en cualquier citómetro de flujo equipado con una fuente de láser violeta.

Introducción

La eficacia de las terapias de cáncer primarias ha mejorado sustancialmente durante la última década debido a los avances en la comprensión genética y molecular de la enfermedad y el advenimiento de fármacos dirigidos como anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas. En contraste, la enfermedad metastásica y recurrente sigue siendo típicamente incurable, y la morbilidad y la mortalidad siguen siendo altos en estos ajustes clínicos. Las CSCs representan una subpoblación distinta dentro de los tumores y están dotadas de propiedades de células madre canónicas tales como clonogenicidad / tumorigenicidad, resistencia a múltiples fármacos y división celular asimétrica 1 , 2 . Por lo tanto, CSCs no sólo impulsan la progresión metastásica y la heterogeneidad tumoral, sino que también persisten durante el tratamiento para predisponer al paciente a la recaída. Por lo tanto, la eliminación terapéutica del CSC es una necesidad médica importante para prevenir la recurrencia de la enfermedad y permitir la curación a largo plazo del cáncer 3

La identificación de las vulnerabilidades y la elucidación de las estrategias para erradicar las CSC depende en gran medida de métodos que permitan su purificación a partir de muestras biológicas para su posterior perfilación y / o investigación funcional. A su vez, tales métodos se basan en marcadores superficiales, intracelulares o funcionales que son específicos para estas células. Los marcadores de superficie específicos de CSC incluyen, pero no se limitan a, CD44, CD133, CD24 y CD90, y se han usado para identificar poblaciones de CSC en una variedad de entidades tumorales incluyendo cáncer de mama y cáncer de colon 4 . Otro marcador, aldehido deshidrogenasa (ALDH), muestra localización intracelular y puede ser detectado funcionalmente proporcionando un sustrato respectivo cuya conversión enzimática produce luz. Usando esta prueba, las poblaciones CSC se han identificado en diversas entidades tumorales, así 5 . Un método complementario, comúnmente denominado análisis SP y retratado aquí en m Ethodological, aprovecha el eflujo de colorante activo por los transportadores de fármacos ABC para identificar pequeñas poblaciones de células de tallo fluorescente-dim-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir esto, se incuba una muestra dada en presencia de un fluoróforo de unión al ADN lipófilo que entra en todas las células a través de la difusión pasiva y se dirige al ADN nuclear y mitocondrial para la unión. Los no CSCs que carecen de expresión del transportador de fármacos ABC acumulan el colorante dando como resultado una fluorescencia brillante, mientras que CSCs extruyen activamente el colorante que reduce la fluorescencia. La inhibición farmacológica de la actividad transportadora de fármacos abroga y confirma funcionalmente el fenotipo SP y debe usarse para fines de control. Las poblaciones de CSC que presentan características de SP se han descrito, entre otros, en cáncer de ovario 9 , 10 , cáncer de próstata 11 ,> 12, cáncer de mama 13 , cáncer de pulmón 14 , cáncer endometrial 15 , glioma 16 , 17 y sarcoma óseo 18 . Es importante destacar que el ensayo SP es compatible con ambas líneas celulares de cáncer y tejido tumoral primario, aunque el material primario plantea retos adicionales tales como el requisito de una estrategia específica de discriminación de células tumorales (ciertas poblaciones de células huésped también pueden presentar características de SP) 19 , 20 .

Los dos transportadores de fármacos que confieren SP más establecidos son ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Sin embargo, otros transportadores de drogas puede ser un determinante molecular del fenotipo SP también ( por ejemplo , ABCB5) [ 22] . ABCB1Puede bloquearse eficazmente con verapamilo, mientras que la actividad de ABCG2 puede ser derogada específicamente con fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Una fuerza particular del análisis de SP es que puede combinarse con otras tinciones ( por ejemplo , marcadores de superficie y ALDH) y que permite la recuperación de células vivas siendo así compatible con investigaciones funcionales posteriores. Por otra parte, la detección de SP es ampliamente aplicable debido a la alta conservación de los transportadores de drogas ABC entre las poblaciones de CSC [ 9 , 23] .

Originalmente, la detección de SP se ha realizado utilizando Hoechst 33342 como un colorante desencadenante 24 . Este colorante consigue una excelente resolución pero requiere excitación con láser ultravioleta; Por lo tanto su aplicabilidad se limita naturalmente a los instrumentos de citometría de flujo de gama alta. La llegada de DyeCycle Violet (DCV) 25 ha abierto nuevas avenidasEs para el análisis SP y amplió la aplicabilidad de este método a los instrumentos de citometría de flujo estándar que carecen de una fuente láser ultravioleta (una fuente láser violeta es suficiente para resolver las células DCV-SP). Es importante destacar que Hoechst 33342 y DCV comparten especificidades comunes de la bomba, lo que indica que cualquier colorante debe identificar las mismas poblaciones de células.

Aquí, proporcionamos un protocolo experimental detallado del análisis de SP basado en DCV para una reproducción rápida y fácil en laboratorios independientes. Por lo tanto, percibimos nuestro artículo como un recurso para los investigadores de CSC que debería contribuir a la optimización y estandarización de este útil método biológico-celular.

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Protocolo

Este protocolo cumple con las directrices estándar de la Junta de Revisión Institucional de Ética. Si se investiga el tejido humano o animal usando el protocolo descrito aquí, los investigadores están obligados a obtener la aprobación de la junta de revisión de su institución o país.

Precaución: Las precauciones estándar para el manejo seguro de muestras biológicas se aplican a este protocolo. Esto incluye usar guantes y una bata de laboratorio, y realizar el trabajo bajo un gabinete de bioseguridad siempre que sea posible.

1. Preparación de células

  1. Líneas celulares de cáncer
    1. Cultivo de una respectiva línea celular de cáncer humano o murino a 37 ° C en 10-30 ml de medio apropiado ( por ejemplo , RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y penicilina / estreptomicina 1x) y cosecha Las células en la subconfluencia ( es decir, 70-90%) usando la digestión con tripsina-EDTA al 0,05% o algún otro de-attProcedimiento de diagnóstico. Determine el recuento celular y compruebe su viabilidad utilizando una cámara de recuento y una tinción con azul de tripano. La fracción de células viables debe superar el 85%.
      NOTA: Ejemplos de líneas celulares de cáncer humano que albergan compartimentos SP incluyen MCF7 / HTB-22 y SKBR3 / HTB-30 (cáncer de mama), A2780 y SKOV-3 / HTB-77 (cáncer de ovario) y A549 (cáncer de pulmón) 26 .
  2. Tejido tumoral ex vivo
    1. Tome una muestra de tumor quirúrgico fresco o, alternativamente, recolecte el tejido tumoral de un modelo de tumor de ratón transplantado o genéticamente modificado. Tome 200-1,000 mg de tejido y genere una suspensión de una sola célula por desagregación mecánica ( por ejemplo , usando tijeras o un bisturí) y digestión enzimática ( por ejemplo , usando un cóctel de colagenasa / dispasa / DNasa).
    2. Filtrar la muestra a través de un filtro de corte de 70 μm. Determinar el recuento celular y comprobar la viabilidad utilizando una cámara de recuento y trypan blUe tinción.
      NOTA: Los cócteles de digestión con frecuencia contienen 200 μg / ml de colagenasa P, 0,8 U / mL dispase y 25 μg / mL de DNasa I, y los tiempos de incubación típicamente varían de 20 a 50 min. Idealmente, la desagregación de tejidos se realiza de acuerdo con un protocolo optimizado para el tejido bajo investigación 27 , 28 , 29 .

2. Muestras de prueba

  1. Ajustar la concentración celular a 1 x 106 células / ml en medio de cultivo fresco (un vehículo que contiene nutrientes es importante, ya que la extrusión del colorante es un proceso que consume energía). Por último, transfiera 1 ml de muestra a un tubo circular de citometría de flujo / FACS (denominado "ensayo").
    NOTA: Para obtener resultados óptimos, puede ser necesario que la concentración celular sea titulada (por ejemplo 5 x 10 5 -1 x 10 6 -2,5 x 10 6 células / ml), pero una concentración de células más baja en generalProporciona una mayor resolución 19 . Sólo para las aplicaciones de clasificación en las que se recuperará un número máximo de células SP, se recomienda aumentar la concentración celular hasta 1 x 10 7 células / mL.
  2. Añadir 10 μM de DCV a la muestra y mezclar bien, ya sea por vórtice suave o resuspender durante 3-5x. Proceder a los controles de inhibición.
    NOTA: Los resultados óptimos pueden depender de la titulación del colorante desencadenante (por ejemplo 2.5; 5; 10; 20 μM), pero una concentración de colorante más alta generalmente produce una mayor resolución 19 .

3. Controles de Inhibición

  1. Transferir 250 μl de la suspensión celular que contiene tinte a un nuevo tubo de citometría de flujo / FACS de fondo redondo (denominado "control"). Añadir 50 μ M de verapamil o 20 μ M de FTC y mezclar bien por pipeteado.
    NOTA: Verapamil y FTC son los inhibidores más bien establecidos para el análisis de SP, pero tienen diferentes especificaciones de bomba de eflujoY: Verapamil inhibe varios transportadores de fármacos ABC incluyendo ABCB1 y ABCB5, mientras que FTC es específico para ABCG2 6,19. Si se desconoce el estado de SP de una muestra individual, se recomienda utilizar ambos verapamil y FTC en tubos separados.

4. Tinción

  1. Capa los tubos 'test' y 'control' y los incuba a 37 ° C en la oscuridad durante 90 minutos, agitando suavemente cada 15 min. La mayor parte de la extrusión de colorantes en las células SP se producirá dentro de los primeros 45 min, pero la acumulación de colorante en las células no SP (contribuyendo a la resolución) es sólo máximo después de 75-90 min 19 .
  2. Una vez completada la tinción, se lavan las células en 3-4 ml de PBS enfriado con hielo y se resuspende el sedimento en un volumen de 100 μl (PBS también). Mantenga las celdas en la oscuridad y enfríe en hielo, y proceda a la tinción de marcadores adicionales. Alternativamente, realizar directamente citometría de flujo anaLisis

5. Costura para otros marcadores

  1. Añadir un panel deseado de anticuerpos conjugados con fluorocromo a las células teñidas con DCV, mezclar bien e incubar las células a 4 ° C en la oscuridad durante 20-30 min. Lave las células en 3 - 4 mL de PBS helado y proceda a la discriminación de células muertas.
    NOTA: Los formatos de anticuerpos que son fácilmente compatibles con DCV y prácticamente no requieren compensación incluyen PerCP o PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 y BV786 . Los formatos que son compatibles con DCV pero pueden requerir compensación incluyen FITC, Alexa Fluor 488, PE y BV650. Los formatos que no son prácticamente compatibles con DCV incluyen BV421, V450 y V500.
  2. Añadir 7-AAD (o PI) a las células teñidas con DCV a la concentración recomendada por el fabricante en particular e incubar las muestras durante 5 - 10 min en la oscuridad. Filtrar las muestras a través de filtros de corte de 70 μm y proceder al análisis de citometría de flujo.

6. Análisis de citometría de flujo

NOTA: Se recomienda encender el respectivo instrumento de citometría de flujo durante el proceso de tinción ya para que todo se fije tan pronto como las muestras estén listas. Esto incluye también los procedimientos de mantenimiento estándar, como el seguimiento del rendimiento del sistema y el relleno del tanque.

  1. Adquirir las células en el citómetro de flujo y las puertas en un gráfico de puntos bivariados FSC / SSC (Figura 1B). Excluir dobletes y agregados comparando las diferentes señales de FSC ( es decir , altura, ancho, área) (Figura 1C).
    1. Si se ha incluido un marcador de células muertas, se introduce en la fracción de células viables ( por ejemplo , 7-AAD-negativo) ( Figura 1D ). Visualice las células singuetas viables en una gráfica de puntos bivariada para la emisión de DCV 'azul' y 'roja'. Con este fin, visualice el canal de fluorescencia "azul" en el eje y ( por ejemplo , 450/50) y el canal de fluorescencia "Rojo 'en el eje x ( por ejemplo , 525/50).
    2. Cambie ambos canales al modo lineal y ajuste los voltajes del detector correspondientemente para que el SP se sitúe al lado del gráfico en el cuadrante inferior izquierdo. Por el contrario, el no SP se sitúa en el cuadrante superior derecho de la gráfica que refleja la distribución del ciclo celular (G1 y G2). Puerta del SP y detener la adquisición ( Figura 1E ).
      NOTA: Las células SP definidas por DCV pueden detectarse utilizando instrumentos de citometría de flujo equipados con una fuente de excitación láser violeta ( es decir, una línea láser de 405 nm). Es uno específico del análisis de SP que la fluorescencia emitida se mide en modo lineal y en dos canales separados mostrados en una gráfica de puntos bivariada. La emisión "azul" de DCV se mide aproximadamente a 450 nm ( por ejemplo , con un filtro estándar 450/40) y la emisión "roja" de DCV se mide aproximadamente a 510-585 nm ( por ejemplo , con un 510/50, un 525/50 o un filtro 585/15) 19 . Debido a la química particular del ensayo, la separación entre células SP y no SP es generalmente mayor en el canal de fluorescencia "rojo" 19 .
  2. Cargue el (los) control (es) de inhibición y adquiera los datos. Las células SP han desaparecido o se han reducido sustancialmente ( Figura 1F ). Si es necesario, refine la puerta SP con base en estos datos.
  3. Para investigar la expresión del marcador de superficie por células SP, deje la fluorescencia "roja" de DCV en el eje x y muestre un canal de fluorescencia respectivo en el eje y en modo logarítmico ( por ejemplo , APC). Ajustar los voltajes del detector correspondientemente y cubrir la fracción de células SP con tinción positiva para el marcador investigado ( Figura 1G ). La co-expresión de un marcador particular por células SP produce una señal respectiva en el cuadrante superior izquierdo de la parcela 30 .
  4. Registre elDatos y / o ordenar las células SP.

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Resultados

Se proporciona un análisis SP representativo de células A2780, una línea celular de cáncer de ovario humano previamente mostrada para albergar un SP que representa menos del 1% de células 9 . Las células se cultivaron a 37ºC en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y 1 x penicilina / estreptomicina y se cosecharon al 85% de confluencia usando tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05%. Las células se lavaron en PBS y se filtraron a...

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Discusión

El progreso en el manejo clínico del cáncer también depende del desarrollo de modalidades de tratamiento dirigidas a las CSC. Métodos que permiten el aislamiento fiable de CSC de muestras biológicas acelerará la identificación de objetivos adecuados y por lo tanto de importancia crítica en este esfuerzo. SP es una técnica establecida y valiosa para identificar las poblaciones de CSC que expresan los transportadores de fármacos ABC y la implementación del DCV ha extendido su aplicabilidad a los instrumentos estándar de c...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de interés para declarar. Tampoco hay participación de ningún autor en la preparación del manuscrito.

Agradecimientos

Maximilian Boesch cuenta con el apoyo de una Beca Erwin Schrödinger del Fondo Austríaco de Ciencia FWF (concesión número J-3807).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Vybrant DyeCycle VioletThermo Fisher ScientificV35003Listo para usar
Clorhidrato de verapamiloSigma-AldrichV4629Disolver en etanol
Fumitremorgin CSigma-AldrichF9054Disolver en DMSO
7-AAD (o yoduro de propidio - PI)BioLegend420403Listo para usar
Reactivos de cultivo celular estándar (p. ej., medio, FBS, L-glutamina, antibióticos, PBS, tripsina-EDTA, etc.)Diferentes proveedores
Muestras/células de interés (p. ej., línea celular de cáncer humano o murino, tejido tumoral humano o murino)Diferentes proveedores
Instrumento de citometría de flujo (FACS; analizador o clasificador de células)Diferentes proveedoresSe requiere una fuente de láser
violeta Tubos FACS (fondo redondo)Diferentes proveedoresTubos con tapa recomendados
70 y micro; Filtros de corte mDiferentes proveedoresOpcional pero recomendado
Mezcla de enzimas para la digestión (p. ej., colagenasa/dispasa/Dnasa)Diferentes proveedoresSolo relevante para la disociación de tejidos
Anticuerpos conjugados con flurocromo contra marcadores de superficie de interésDiferentes proveedores
Kit ALDEFLUOR opcional TecnologíasSTEMCELL01700Opcional

Referencias

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