Artículo de método

Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales

34.5K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/55637

⸱

21 de julio de 2017

1Amnis Biology Department, MilliporeSigma

En este artículo

Resumen

En este sentido, se utilizó la citometría de flujo de imágenes multiespectrales con una característica analítica que compara imágenes detalladas de 3 marcadores de autofagia y cuantifica su co-localización, junto con el recuento de puntos LC3, para medir la autofagia de una manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Resumen

La autofagia es una vía catabólica en la que los componentes celulares normales o disfuncionales que se acumulan durante el crecimiento y la diferenciación se degradan a través del lisosoma y se reciclan. Durante la autofagia, la proteína LC3 citoplasmática se lipide y se recluta en las membranas autofagosómicas. El autofagosoma se fusiona con el lisosoma para formar el autolisosoma, donde se produce la ruptura de la vesícula autofagosoma y su contenido. La proteína p62 asociada a la ubiquitina, que se une a LC3, también se usa para monitorizar el flujo autofágico. Las células sometidas a autofagia deben demostrar la co-localización de p62, LC3 y marcadores lisosómicos. La microscopía de inmunofluorescencia se ha utilizado para identificar visualmente LC3 puncta, p62, y / o lisosomas sobre una base por célula. Sin embargo, una evaluación objetiva y estadísticamente rigurosa puede ser difícil de obtener. Para superar estos problemas, se utilizó citometría de flujo de imágenes multiespectrales junto con una característica analítica que comparaCola de tres marcadores de autofagia (LC3, p62 y lysosomal LAMP1) y cuantifica su co-localización, en combinación con el recuento de puntos LC3 para medir la autofagia de manera objetiva, cuantitativa y estadísticamente robusta.

Introducción

La macroautofagia, en adelante denominada autofagia, es una vía catabólica en la que los componentes dañados o disfuncionales, las proteínas de larga vida y los orgánulos se degradan a través del lisosoma y se reciclan 1 . La autofagia es un proceso dinámico de varios pasos que implica la formación de un autofagosoma; La fusión del autofagosoma con el lisosoma, formando el autolisosoma; Y la degradación de los contenidos del autolisosoma 2 . El marcador biológico crucial utilizado para identificar la autofagia en los sistemas de mamíferos es la proteína ligada a los microtúbulos 1A / 1B-cadena ligera 3 (LC3), que constituye la membrana autofagosomal. Durante la autofagia, el LC3-1 citosólico se conjuga con fosfatidiletanolamina para formar LC3-II; Entonces se incorpora LC3-II en la membrana autofagosomal 3 . Otro marcador ampliamente utilizado para el flujo autofágico es el receptor de autofagia sequestosome 1 (SQSTM1, p62) que físicamente liCarga autofágica a la membrana autofágica 4 , 5 .

Métodos que se han utilizado tradicionalmente para medir la autofagia son Western blots y microscopía de fluorescencia [ 7] . Sin embargo, ninguno de estos métodos se considera el "patrón oro" , 2 , 6 ya que hay desafíos asociados con ambas técnicas. Western blots sólo dan un promedio porque utilizan una muestra homogeneizada, por lo que los observadores no pueden ver lo que está sucediendo en las células individuales. Por otro lado, la microscopía de fluorescencia proporciona una información del observador a nivel de célula única, pero carece de capacidades de rendimiento, lo que hace difícil obtener evaluaciones objetivas y estadísticamente rigurosas. En los últimos años, la medición de LC3 y p62 por citometría de flujo de imágenes multiespectrales (MIFC, véase la Tabla de Materiales ) ha ido ganando popularidadDebido a su poder cuantitativo, capacidades de alto rendimiento, potencial de multiplexación y capacidad de imagen de cada célula. Uno de los métodos más utilizados para medir la autofagia usando MIFC, junto con su software de análisis complementario (véase la Tabla de Materiales ), es a través del recuento puntual de LC3 puncta o autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Sin embargo, un aumento de autofagosomas no significa necesariamente que hay un aumento en la autofagia, ya que también podría representar un bloqueo en el proceso [ 2] . LC3-II volumen de negocios es un parámetro útil para medir el flujo autofágico mediante el análisis de las células en la presencia yAusencia de un inhibidor de degradación lisosómica, como la cloroquina. La cloroquina inhibe la fusión del autofagosoma con el lisosoma, permitiendo así la cuantificación de la formación de autofagosomas como una medida del grado de autofagia deteniendo el flujo autofágico antes de que se produzca la degradación lisosomal 18 . Además, p62 se degrada principalmente por autofagia, y si la degradación lisosomal del autofagosoma y su contenido se bloquea, se espera una acumulación de p62 17 , 19 .

Autofagia es un proceso de varios pasos, y la medición de LC3 o p62 por sí sola no proporciona una imagen completa de lo que está sucediendo en las células. Publicaciones recientes han enfatizado la necesidad de examinar la formación concurrente del autolisosoma 2 , 17 , 20 , 21 . El MIFC esSingularmente capaz de medir la formación del autolisosoma mediante la imagen de la co-localización del autofagosoma al lisosoma 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 . Además, la co-localización de p62 y LC3 utilizando MIFC también se ha explorado para medir el flujo autofágico [ 5] . En el software de análisis referenciado, la "característica" que mide la co-localización se llama "Bright Detail Similarity R3" (BDS) y fue específicamente diseñada para comparar los detalles de imagen pequeños y brillantes de dos imágenes. BDS es el coeficiente de correlación log-transformado de Pearson de las manchas brillantes localizadas con un radio de 3 píxeles o menos; En otras palabras, BDS calcula el grado de oVerlapping pixels de dos canales fluorescentes diferentes. Los puntos brillantes están correlacionados ( es decir, la misma ubicación espacial) o no correlacionados ( es decir, diferentes ubicaciones espaciales). Por lo tanto, el coeficiente de correlación varía entre 0 (no correlacionado) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango entre cero e infinito 26 , 27 . BDS solo puede no ser suficiente; Rajan et al. Encontró que el uso de sólo BDS podría conducir a falsos positivos o falsos resultados negativos [ 21] . BDS evalúa la co-localización de dos marcadores de autofagia, pero no considera el número de autofagosomas. Para explicar el número de autofagosomas, Rajan et al. Incluido el recuento puntual de las puntas de LC3 21 . Rajan et al. Propuesta utilizando un diagrama de dispersión bivariado de LC3 spot count versus BDS. Usando esta gráfica bivariada, dos poblaciones fueronE identificado por primera vez: uno con células que tienen un alto nivel de manchas LC3 y una con células que tienen un bajo nivel de manchas LC3. La población de puntos altos de LC3 se clasificó además en dos poblaciones: células con baja co-localización ( es decir, acumulación de autofagosomas) y células con alta co-localización ( es decir, acumulación de autolisosomas). Esta gráfica bivariada permite distinguir entre células con muy pocos autofagosomas y células con acumulación de autofagosomas y / o autolisosomas [ 21] .

Hasta ahora, no era posible la co-localización simultánea de LC3, p62 y LAMP1 (marcador lisosómico) utilizando un solo "Feature Type" en el software de análisis de acompañamiento del MIFC (véase la Tabla de Materiales ). Sin embargo, una nueva característica, recientemente introducida en la versión 6.1, se llama Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 compara las imágenes de detalle brillante de cada una de las tres imágenes (en este caso, LC3, p62 y LAMP1) y cuantifica la co-localización de las tres sondas ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). La característica BDC3 calcula el coeficiente de correlación de Pearson modificado para extenderse a tres imágenes. Como los puntos brillantes de las tres imágenes están correlacionados o no correlacionados, el coeficiente de correlación varía entre 0 (sin correlación) y 1 (correlación perfecta). El coeficiente es log-transformado para aumentar el rango dinámico entre 0 e infinito. Al cambiar la función BDS con la característica BDC3, el método de análisis presentado por Rajan et al. Ahora pueden incorporar los tres marcadores más usados ​​para medir la autofagia en un sistema al mismo tiempo. La capacidad de co-localizar estos tres marcadores de autofagia en un solo ensayo podría conducir a nuevos conocimientos sobre la inducción y regulación de la autofagia. El siguiente protocolo describe los pasos para inducir la autofagia en células Jurkat; Marcar las células con anticuerpos LC3, p62 y LAMP1; Adquirir datos en un sistema multispCitometría de flujo de imágenes ectrales; Y analizar los datos para evaluar el flujo autofágico.

Protocolo

1. Preparación del medio de cultivo y inhibidor de la degradación lisosómica

  1. 1.1. Hacer ~ 500 ml de 1x medio de cultivo RPMI. Añadir 5 ml de aminoácidos no esenciales (100x), 5 ml de piruvato sódico (100 mM), 5 ml de penicilina-estreptomicina-glutamina (100x) y 25 ml de suero bovino fetal (FBS) a 500 ml Frasco de RPMI - 1640 1x medio. El medio debe prepararse en un gabinete de bioseguridad. Almacenar el medio de cultivo RPMI a 2-8 ° C. Calentar el medio de cultivo RPMI a 37 ° C antes de añadirlo a las células Jurkat.
  2. Hacer cloroquina 100 mM, el inhibidor de la degradación lisosomal. Pesar 0,05 g de sal de difosfato de cloroquina y agregarla a 1 ml de agua de grado de cultivo celular en un tubo de centrífuga de 15 ml. Vórtice hasta que la cloroquina se haya disuelto.

2. Cultivo de células

  1. Cultivo 80 ml de células Jurkat clon E6-1 en medio de cultivo RPMI a 37 ° C y 5% de CO 2 .
    NOTA: Cuando se cultivan célulasO trabajando con las células Jurkat antes de la fijación, todo el trabajo debe hacerse en el gabinete de bioseguridad.
  2. Antes de inducir la autofagia, cuente las células Jurkat usando un hemocitómetro u otro dispositivo de recuento de células para determinar las células / mL.

3. Inducción de la autofagia en células

  1. Tomar las células de Jurkat en fase de crecimiento exponencial y dividirlas en cuatro muestras de 20 ml cada uno en tubos de centrífuga de 50 ml. Etiquetar los tubos como "Control", "Control + Cloroquina", "Starved" y "Starved + Cloroquina".
    NOTA: Las células Jurkat deben tener una concentración de 2.5-5 x 10 5 células / mL.
  2. Lavar las células mediante la adición de 30 ml de solución salina equilibrada de Hank sin Ca 2+ o Mg 2+ (HBSS) a cada muestra. Centrifugar a 250 xg durante 10 min. Se vierte el sobrenadante en un vaso de precipitados.
  3. Resuspender las muestras de control en 20 ml de medio de cultivo RPMI pipeteando hacia arriba y hacia abajo utilizando una solución de 25 ml sSeguido de la realización de un vórtex ligero. De forma similar, resuspender las muestras hambrientas en 20 ml de solución de sal equilibrada de Earle sin Ca 2+ o Mg 2+ (EBSS).
  4. Utilizando una pipeta desechable estéril de 25 ml, transfiera las muestras de control y muerto de hambre a matraces T75 que han sido etiquetados como "Control", "Control + Cloroquina", "Hambre" y "Starved + Cloroquina".
  5. Añadir 20 μl de cloroquina 100 mM a los 20 ml de medio de cultivo celular en los frascos "Control + Cloroquina" y "Starved + Cloroquina". Mezcle la cloroquina agitando suavemente el frasco. Colocar todos los frascos en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2 durante 2 h.

4. Preparación de tampones para la fijación y etiquetado de LC3, LAMP1 y p62

  1. Preparar 10 ml de solución de fijación de formalina al 4% en PBS. Añadir 4 ml de solución de formalina al 10% a 1 ml de solución tampón de fosfato de 10 x DulbeccoSolución salina sin Ca 2+ o Mg 2+ (PBS) y 5 ml de agua ultrapura en un tubo de centrífuga de 15 ml.
    NOTA: PRECAUCIÓN. Formalina / formaldehído es tóxico si se inhala o se ingiere; Es irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel; Y puede causar sensibilización por inhalación o contacto con la piel. Existe el riesgo de lesiones oculares graves. Es un potencial carcinógeno.
  2. Preparar 10 ml de solución de resuspensión final de formalina al 1% en PBS. Añadir 1 ml de solución de formalina al 10% a 9 ml de 1x PBS en un tubo de centrífuga de 15 ml.
  3. Preparar 500 mL de tampón de lavado añadiendo 10 mL de FBS a una botella de 500 mL de 1x PBS.
  4. Preparar 50 ml de tampón de permeabilización en un tubo de centrífuga de 50 ml mediante la adición de 0,5 ml de triton X-100 al 10% a los 49,5 ml de tampón de lavado preparado en el paso 4.3.
  5. Preparar una solución de trabajo de tampón de anticuerpo / permeabilización anti-SQSTM1 / p62-Alexa 488 (AF488) añadiendo 5 μl de anti-SQSTM1 / p62-AF488 a 495 μl del tampón de permeabilización hecho en sTep 4.4. Asegúrese de que la concentración final de anticuerpos sea de 5 μg / mL.
    NOTA: Haga la solución de trabajo del tampón de permeabilización de anticuerpos justo antes de añadirla a la muestra. Proteja la solución de la luz.
  6. Preparar el ratón anti-LC3 / buffer permeabilización solución de trabajo mediante la adición de 5 μ l de ratón anti-LC3 a 495 μ l del tampón de permeabilización realizado en el paso 4.4. Asegúrese de que la concentración final de anticuerpos sea de 20 μg / mL.
    NOTA: Haga las soluciones de trabajo del tampón de permeabilización de anticuerpos justo antes de añadirlo a la muestra. Proteja la solución de la luz.
  7. Preparar una solución de trabajo de burbuja anti-ratón Alexa 647 (AF647) / tampón de permeabilización mediante la adición de 5 μl de anticuerpo anti-ratón IgOG de burro marcado con AF647 a 495 μl del tampón de permeabilización realizado en el paso 4.4. Asegúrese de que la concentración final de anticuerpos sea de 20 μg / mL.
    NOTA: Haga la solución de trabajo del tampón de permeabilización del anticuerpo justo antes de añadirlo a la muestra. ProtegerLa solución de la luz.
  8. Preparar solución de trabajo de anticuerpo anti-CD107a humana (LAMP1) -PE / tampón de permeabilización añadiendo 25 μl de anti-CD107a (LAMP1) -PE a 475 μL del tampón de permeabilización realizado en el paso 4.4. Asegúrese de que la concentración final de anticuerpos sea de 21 μg / mL.
    NOTA: Haga la solución de trabajo del tampón de permeabilización del anticuerpo justo antes de añadirlo a la muestra. Proteja la solución de la luz.
  9. Preparar 10 x DAPI tinción nuclear mediante la adición de 4 μ l de 5 mg / mL DAPI y 100 μ l de 10% tritón X-100 a 896 μ l de 1x PBS.

5. Etiquetado de las células Jurkat con LC3, LAMP1 y p62

  1. Eliminar 2 x 10 6 células por muestra (cuente las células como en el paso 2.2). Coloque cada muestra en un tubo de centrífuga de 15 mL que ha sido etiquetado con el nombre apropiado de la muestra ( es decir, Control, Control + Cloroquina, Starved, o Starved + Cloroquina).
    1. Añadir tampón de lavado para que noUn volumen total de 15 ml en cada tubo de centrífuga de 15 ml. Centrifugar las muestras a 250 xg durante 10 min. Aspirar fuera del sobrenadante.
  2. Añadir 100 μl de solución de fijación de formalina al 4% a cada uno de los sedimentos celulares. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200. Incubar durante 10 min a temperatura ambiente. Durante la etapa de fijación, transfiera las muestras a tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconado etiquetados.
    NOTA: No sobre-fije las células; Esto podría resultar en resultados de etiquetado pobres.
  3. Después de la etapa de fijación de 10 min, añadir 1 mL de tampón de lavado a cada muestra. Pipetar hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 para mezclar la muestra. Centrifugar a 250 xg durante 5 min. Aspirar fuera del sobrenadante.
  4. Añadir 100 μl de anticuerpo anti-SQSTM1 / p62 - AF488 / buffer de permeabilización solución de trabajo a cada muestra. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200. Incubar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
  5. Lave las células añadiendo 1 mL deTampón de permeabilización a cada muestra. Pipetar hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 para mezclar la muestra. Centrifugar a 250 xg durante 5 min. Aspirar fuera del sobrenadante.
  6. Repita los pasos 5.4-5.5 para cada una de las soluciones de trabajo del anticuerpo.
    NOTA: Las soluciones de trabajo del anticuerpo son solución de trabajo de ratón anti-LC3 / solución de trabajo de tampón de permeabilización, solución de trabajo de burro anti-ratón-AF647 / solución de tampón de permeabilización y solución de trabajo de tampón de anticuerpo / permeabilización CD107a (LAMP1) -HE humana. Cada anticuerpo se debe hacer por separado y en el orden indicado. El orden se eligió para minimizar la reactividad cruzada no deseada entre anticuerpos.
  7. Añadir 100 μl de solución de formalina al 1%. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200. Añada 10 μL de la tinción nuclear 10x DAPI a cada muestra. Vórtice ligeramente cada muestra para mezclar. Incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente antes de ejecutar cualquiera de las muestras en el instrumento.
    NOTA: En este punto, la muestra puede bE funcionan en el MIFC o almacenados protegidos de la luz a 2-8 ° C por hasta una semana.

6. Etiquetado de controles de un solo color

  1. Para cada control de un solo color (es decir, AF488, PE, AF647, y DAPI), tomar 1 x 10 6 células Jurkat, que pueden ser de cualquiera de las poblaciones de la muestra. Poner 1 x 10 6 células en 15 tubos de centrífuga ml etiquetados como sea AF488, PE, AF647, o DAPI.
  2. Agregue tampón de lavado de manera que haya un volumen total de 15 mL en cada tubo de centrifugación de 15 mL. Centrifugar las muestras a 250 xg durante 10 min. Aspirar fuera del sobrenadante.
  3. Añadir 100 μl de tampón de lavado a los tubos AF488, PE y AF647.
    NOTA: Para el tubo DAPI, vaya al paso 6.8.
    1. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200. Transferencia a tubos de 1,5 ml.
  4. Añadir 5 μl de anti-CD45-AF488, anti-CD45-PE o anti-CD45-AF647 a los tubos AF488, PE o AF647, respectivamente. Mezclar vórtex lIghtly
  5. Incubar los tubos AF488, PE y AF647 durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
    NOTA: Se pueden usar otros marcadores, como anticuerpos LC3, p62 y LAMP-1 en lugar de anticuerpos anti-CD45. Sin embargo, CD45 es un marcador fiable para controles de un solo color.
  6. Lave las células AF488, PE y AF647 añadiendo 1 mL de tampón de lavado a cada muestra.
    1. Pipetar hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P1000 para mezclar la muestra. Centrifugar a 250 xg durante 5 min. Aspirar fuera del sobrenadante.
  7. Añadir 100 μl de solución de formalina al 1%. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200.
    NOTA: En este punto, la muestra se puede ejecutar en el MIFC o almacenarse protegido de la luz a 2-8 ° C por hasta una semana.
  8. Añadir 100 μl de solución de fijación de formalina al 1% al tubo DAPI.
    1. Resuspender pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una pipeta P200. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.
    2. Añadir 101; L de 10x DAPI tinción nuclear a la muestra DAPI. Vórtice ligeramente para mezclar. Incubar durante 10 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente antes de correr sobre el instrumento.
      NOTA: En este punto, la muestra se puede ejecutar en el MIFC o almacenarse protegido de la luz a 2-8 ° C por hasta una semana.

7. Inicio y calibración del MIFC

  1. Compruebe que la vaina, el reactivo de calibración del sistema (vea la tabla de materiales ), el debubbler, el limpiador y los recipientes del esterilizador estén llenos y el tanque de residuos esté vacío. Si no, llenar los contenedores y vaciar el tanque de residuos.
  2. Encienda el sistema y haga doble clic en el icono del software (vea la tabla de materiales ) para iniciar la aplicación; Esto iniciará el software MIFC.
  3. Haga clic en el botón Inicio y asegúrese de que está seleccionado Iniciar todas las calibraciones y pruebas . Esto descargará el sistema, la vaina de carga, el reactivo de calibración del sistema,Y calibrar el sistema.

8. Ejecución de las muestras y controles de un solo color en el MIFC

  1. Cargue la plantilla predeterminada, vaya a la ficha Archivo y seleccione Cargar plantilla predeterminada .
    NOTA: La plantilla predeterminada contiene los gráficos de puntos de pixel máximo en bruto.
  2. Encienda los láseres 488 nm, 405 nm, 642 nm y SSC haciendo clic en sus respectivos botones. Ajuste la potencia del láser introduciendo la potencia deseada junto a cada botón del láser. Vea la Figura 1 .
    NOTA: Para este experimento, las potencias láser son de 200 mW, 20 mW, 150 mW y 5 mW (Ch06) para los 488 nm, 405 nm, 642 nm y SSC, respectivamente. La magnificación de plantilla predeterminada de MIFC se ha establecido en 40X, la sensibilidad predeterminada es Hi , y todos los canales están habilitados.
  3. Confirme que el control deslizante de ampliación está ajustado en 40X, el modo de alta sensibilidad está seleccionado y todos los canales se muestran en la galería de imágenes; Figura 1 muestra los ajustes de los instrumentos utilizados en este experimento.
  4. Cargue la muestra "Starved + Cloroquina" haciendo clic en el botón Cargar y cargando el tubo de 1,5 mL en el instrumento.
    NOTA: Esta muestra experimental debe tener la señal más alta de todas las muestras para AF488, PE y AF647 (la señal DAPI debe tener aproximadamente la misma intensidad de señal para todas las muestras experimentales, incluyendo la muestra "Starved + Cloroquina").
  5. Utilice la muestra "Starved + Chloroquine" para confirmar que se establecen las potencias láser apropiadas para los láseres 488 nm, 405 nm, 642 nm y SSC. Utilice las gráficas de puntos de pixel máximo bruto de la plantilla predeterminada para ajustar las potencias del láser de modo que las señales sean fuertes pero no alcancen un valor máximo de pixel bruto de 4.096, lo que saturaría la cámara CCD del instrumento. Utilice este ajuste láser para todas las muestras experimentales.
  6. Haga clic en el icono Crear Gráfico de Puntos para crear una nueva trama de puntos. Seleccione "Area_M01 "en el eje X y" Aspecto Ratio_M01 "en el eje Y para la población" todos "Haga clic en el icono Crear región poligonal Dibuje una región alrededor de las celdas Nombre esta región" Celda ".
    NOTA: Los usuarios pueden agregar parcelas y regiones adicionales para restringir las celdas que se están recopilando. Una trama adicional común para agregar sería gradiente RMS para identificar las células que están en foco.
  7. Ajuste los parámetros de adquisición. Especifique el nombre del archivo y la carpeta de destino, cambie el número de eventos a "5.000" y seleccione la población de la colección "Celda". Haga clic en el botón Adquirir para adquirir el archivo. Después de recoger el archivo, devuelva la muestra haciendo clic en el botón Volver . Retire el tubo de muestra del instrumento.
  8. Para las tres muestras siguientes ("Starved", "Control" y "Control + Cloroquina"), cargue la muestra, ingrese el nombre de la muestra, adquiera la muestra y devuelva la muestra usando los mismos ajustes quePara la muestra "Starved + Cloroquina", arriba.
  9. Una vez que se han adquirido las muestras, ejecute las muestras de control de un solo color y adquiera datos de manera que se pueda hacer una matriz de compensación. Apague el láser SSC haciendo clic en el botón SSC . Desactive los canales de campo claro haciendo clic en el botón Brightfield y seleccionando OFF .
    NOTA: Si se eliminaron los canales de la galería de imágenes para la adquisición experimental de muestras, vuelva a habilitar todos los canales. Alternativamente, se pueden obtener controles de un solo color haciendo clic en la pestaña Compensación y seleccionando Crear matriz ; Esto abre el asistente de compensación, que recorrerá el paso de recopilar archivos y hacer una matriz de compensación.
  10. Cargue el control DAPI de un solo color haciendo clic en el botón Cargar y cargando el tubo de 1,5 ml en el instrumento. Introduzca el nombre de la muestra (sólo DAPI), establezca la población de recopilación en "Todos" y cambie el número de eventosS a "500".
    1. Haga clic en el botón Adquirir para adquirir el archivo de control de un solo color.
    2. Cuando se complete la recopilación de archivos, devuelva la muestra haciendo clic en el botón Volver . Retire el tubo de muestra del instrumento.
    3. Después de la muestra DAPI, cargue 10% de blanqueador como una muestra haciendo clic en el botón Cargar y cargando 100 μl de lejía al 10% en un tubo de 1,5 ml. Deje que la muestra funcione durante ~ 15 s. Esto eliminará cualquier DAPI residual del tubo.
    4. Ejecutar 100 μ l de 1x PBS, como se hace en 8.10.3, para eliminar el 10% residual de blanqueo. El instrumento ya está listo para ejecutar los controles monocromáticos AF488, PE y AF647.
    5. Repita los pasos 8.10-8.10.2 para cada uno de los controles de un solo color ( es decir, AF488, PE y AF647).
      NOTA: No hay necesidad de ejecutar 10% de blanqueador o PBS entre estas muestras, sólo después del control DAPI de un solo color.

9. Análisis de datos en el MIFCAlysis Software

  1. Inicie el software de análisis del MIFC (consulte la Tabla de materiales ).
  2. Haga clic en Iniciar análisis para iniciar el Asistente para abrir archivos . Seleccione el archivo de datos para abrir navegando por el archivo de imagen cruda "Starved + Cloroquina" (.rif). Seleccione el archivo y haga clic en el botón Abrir . Haga clic en Siguiente .
    1. Aplique una compensación. Seleccione una matriz de compensación creada anteriormente y haga clic en Siguiente . Alternativamente, haga una nueva matriz de compensación haciendo clic en el botón Nueva matriz .
      NOTA: Los pasos 9.2.1.1 a 9.2.1.2 son los pasos para crear una nueva matriz.
      1. Agregue los archivos de control de un solo color ( es decir, sólo DAPI , sólo AF488, sólo PE y AF647) a la lista Archivos de control haciendo clic en Agregar archivos , seleccionando los archivos y haciendo clic en el botón Abrir . Haga clic en Siguiente .
      2. La ventana Crear Matriz de Compensación aparecerá para este experimento. EnsurE que Ch02, Ch03, Ch07 y Ch11 están seleccionados y haga clic en Siguiente . Se creará la matriz de compensación. Haga clic en Finalizar para guardar la matriz de compensación. Agregue el archivo de compensación al Asistente para abrir archivos y haga clic en Siguiente .
    2. Aplicar la plantilla de análisis. En esta etapa, no hay una plantilla de análisis que aplicar, así que haga clic en Siguiente .
      NOTA: Para los otros archivos experimentales, este archivo "Starved + Chloroquine.daf" puede usarse como una plantilla.
    3. Nombre del archivo (los nombres de archivo que corresponden con los nombres de "rif" se generan automáticamente) y haga clic en Siguiente . Ajuste las propiedades de visualización de la imagen seleccionando los canales "02", "03", "07" y "11"; Los canales 01, 06 y 09 están preseleccionados. Haga clic en Siguiente .
  3. Al final del Asistente para abrir archivos , seleccione el Asistente para apoptosis . Haga clic en el icono del Asistente para Apoptosis yEl botón Asistente de selección para abrir el asistente de Apoptosis .
    1. Seleccione el canal de imagen nuclear (Ch07) y haga clic en Siguiente . Puerta las células en mejor enfoque. Haga clic en el icono Crear región de línea y dibuje una región en el gradiente RMS_M01_Ch01 de 60 a 90. Nombre esta región "Enfoque", haga clic en Aceptar y haga clic en Siguiente .
    2. Puerta las células individuales. Haga clic en el icono Crear región poligonal. Dibuje una región alrededor de las celdas individuales, el nombre de la región "Single", haga clic en Aceptar y haga clic en Siguiente . Haga clic en No para "¿Desea analizar las subpoblaciones?"
    3. Puerta las células nucleadas. Haga clic en el icono Crear región de línea y dibuje una región que incluya todas las celdas nucleadas. Nombre la región "Nucleated". Haga clic en Aceptar y en Siguiente .
    4. Puerta de las células apoptóticas. Haga clic en el icono Crear región poligonal. Dibuje una región alrededor de las células apoptóticas; Estas son célulasCon un área nuclear baja y un alto contraste de campo brillante. Haga clic en Finalizar . Agregue una segunda región haciendo clic en el icono Crear región poligonal y dibujando una región alrededor de las células no apoptóticas; Llame a esta región "Células".
  4. Seleccione las celdas positivas para LAMP1, p62 y LC3. Haga clic en el ícono Building Blocks , seleccione Fluorescence Positives - One Color , y seleccione la población "Cells" e Intensity_MC_Ch03 . Etiquetar el X-Axis "Intensity LAMP1." Dibuje una región que incluya celdas con intensidades mayores de 10.000 haciendo clic en el icono Crear región de línea y dibujando la región. Etiquetar esta región "LAMP1 +". Siga los mismos pasos que en 9.4 para seleccionar células positivas para p62 y LC3.
    1. Para p62 + seleccionar la población "LAMP1 +" y Intensity_MC_Ch02 . Etiquetar el eje X "Intensidad p62" y la región de p62 + células "LAMP1 + / p62 +".; Para el LC3 +, seleccione la población "LAMP1 + / p62 +" e Intensity_MC_Ch11. Etiquetar el X-Axis "Intensidad LC3" y la región de células LC3 + "LAMP1 + / p62 + / LC3 +." Utilice esta población "LAMP1 + / p62 + / LC3 +" para el resto del análisis.
  5. Cree una función de recuento de puntos para contar los puntos LC3.
    NOTA: Esto debe crearse usando la muestra "Starved + Cloroquina".
    1. Haga clic en la ficha Análisis y seleccione Máscara . Haga clic en el botón Nuevo y, a continuación, en el botón Función . Bajo Función , seleccione Pico ; Máscara , seleccione M11 ; Y Canal , seleccione Ch11 . Establezca la proporción de fondo de punto a celda en 4 . Haga clic en Aceptar para cerrar la ventana Definir función de máscara y Aceptar para agregarla a la lista Máscara . Haga clic en Cerrar para salir del Administrador de máscaras .
    2. Haga clic en la pestaña Análisis y seleccione Características. Haga clic en el botón Nuevo . En Tipo de entidad , seleccione Cuenta de puntos y bajo Máscara , seleccione Pico (M11, Ch11, Brillante, 4). Escriba "Spot Count LC3" para el Nombre y haga clic en OK y Close para salir del Feature Manager .
      NOTA: El Asistente de Spot también se puede utilizar para crear una función de conteo de puntos. La característica de recuento de puntos usada en este experimento puede no ser apropiada para otros experimentos y / o líneas celulares. El usuario debe probar varias máscaras / características de contaje puntual al decidir sobre una máscara / función para un conjunto de datos específico. Pugsley 2017 tiene más detalles sobre el recuento puntual utilizando el software de análisis MIFC 26 .
    3. Haga clic en el icono Nuevo histograma . Seleccione la población "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Seleccione la función Cuenta puntual LC3 y haga clic en Aceptar .
  6. Cree la característica BDC3.
    1. doLame la pestaña Análisis y seleccione Funciones . Haga clic en el botón Nuevo . En Tipo de entidad , seleccione Colocalización de detalle brillante 3 ; Máscara , seleccione MC ; Imagen 1 , seleccione Ch02 (p62); Imagen 2 , seleccione Ch03 (LAMP1); Y mago 3 , seleccione Ch11 (LC3). Escriba "BDC3 p62 / LAMP1 / LC3" para el Nombre y haga clic en Aceptar y Cerrar para salir del Administrador de funciones .
    2. Haga clic en el icono Nuevo histograma . Seleccione la población "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Seleccione la función BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 y haga clic en Aceptar .
  7. Haga clic en el icono Nuevo diagrama de dispersión . Seleccione la población "LAMP1 + / p62 + / LC3 +". Seleccione BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para el eje X. Seleccione la función de contaje de puntos LC3 para el eje Y. Haga clic en Aceptar .
  8. SalvaE Archivo "Starved + Chloroquine". Haga clic en Archivo y seleccione Guardar archivo de análisis de datos (.daf) . Haga clic en Guardar y Sí para reemplazar la versión anterior del archivo; Este archivo ahora se puede utilizar como una plantilla.
  9. Abra el archivo "Control". Haga clic en Archivo y luego en Abrir . Seleccione el archivo "Control.rif" y haga clic en Abrir . Seleccione la matriz de compensación del paso 9.2.1 y el archivo "Starved + Chloroquine.daf" como plantilla. Haga clic en Aceptar .
  10. Crear regiones para la acumulación de autofagosomas y la acumulación de autolysosome utilizando la muestra "Control" para establecer las regiones.
    1. Haga clic en el icono Crear Rectángulo Región . Dibuje una región de coordenadas X de -0,1 a 3 y coordenadas Y de 1,5 a -0,3. Llame a esta región "Puntos Bajos". Clickea en el Crear icono Rectangle Region . Dibuje una región de coordenadas X de -0.1 a 1 y coordenada YDe 17,5 a 1,5. Nombre esta región "High Spot / Low BDC3."
    2. Haga clic en el icono Crear Rectángulo Región. Dibuja una región de coordenadas X de 1 a 3 y coordenadas Y de 17,5 a 1,5. Nombre esta región "High Spots / High BDC3."
  11. Guarde el archivo "Control". Haga clic en Archivo y seleccione Guardar archivo de análisis de datos (.daf ) . Haga clic en Guardar y Sí para reemplazar la versión anterior del archivo; Este archivo ahora se puede utilizar como una plantilla.
  12. Abra el archivo "Control + Cloroquina" haciendo clic en Archivo y luego en Abrir . Seleccione el archivo "Control + Chloroquine.rif" y haga clic en Abrir . Seleccione la matriz de compensación del paso 9.2.1 y el archivo "Control.daf" como plantilla. Haga clic en Aceptar . Repita esto para los archivos "Starved" y "Starved + Chloroquine".
    NOTA: La función de lote en el software de análisis también se puede utilizar para aplicar la compensaMatriz y / o plantilla a los otros archivos. La estrategia de gating final se muestra en la Figura 2 .

Resultados

Este método de análisis utiliza múltiples características para evaluar el flujo autofágico. Para entender completamente la gráfica bivariada final, primero deben investigarse las características de análisis individuales. El contar de autofagosomas es una forma lógica de medir la autofagia; Sin embargo, el tamaño / forma / brillo de LC3 puncta puede variar drásticamente entre las células. La variación puede dificultar el conteo manual de los autofagosomas o el uso de una función de recuento de puntos en el software de análisis. Por lo tanto, ninguna función de recuento de puntos será perfecta debido a esta gran variabilidad en los autofagosomas. Sin embargo, una buena función de recuento de puntos funcionará en la mayoría de las celdas 26 . La Figura 3 muestra ejemplos de enmascaramiento puntual de LC3 puncta en células Jurkat usando diferentes mascarillas. La función de recuento de puntos seleccionada para este conjunto de datos es Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, lo que significa que la función de recuento de puntos contó los puntos que el peAk máscara identificada dentro de la máscara de canal 11 por defecto (M11) en el canal 11 (Ch11-LC3-AF647) con una relación de fondo de 4 a 4 (Bright, 4). La Figura 4 muestra histogramas de conteo de puntos e imágenes representativas para el recuento de puntos medios para las células Jurkat Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina marcadas con anti-LC3-AF647. Los recuentos medios de control y Starved no son significativamente diferentes; Con la adición de cloroquina, hay una gran diferencia en la media del Control + Cloroquina en comparación con el Starved + Cloroquina.

La siguiente característica a investigar es BDC3. BDC3 es una medida de la co-localización de tres marcadores / sondas, en este caso, LC3, p62 y LAMP1. La Figura 5A - 5D muestra histogramas BDC3 para las células Jurkat Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina etiquetadas con anti-p62-AF488, Anti - LAMP1 - PE, y anti - LC3 - AF647. Hay un desplazamiento entre la media de Control a la media de Starved, así como la media de Control + Cloroquina a la media de Starved + Cloroquina. Sin embargo, mirando las imágenes de las células de la media BDC3 puntuaciones en la Figura 5E - 5H , hay una mayor diferencia entre las muestras que los histogramas pueden conducir a uno a creer. Esto se debe a que BDC3 no considera el número de organelas de autofagia que co-localizan, dando como resultado un gran grado de variabilidad en el número de autofagosomas para la misma puntuación BDC3. En la mayoría de los casos, hay superposición entre las tres sondas porque, incluso en los niveles basales, p62, LAMP1 y LC3 deberían, en cierta medida, co-localizar o residir en regiones similares en las células. Como contraste, un ejemplo de tres sondas que no deberían co-localizarse son el colorante nuclear anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 y DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina, mostrada en la Figura 6. Cuando se combinan la función de conteo de puntos y la característica de BDC3, son evidentes la presencia de diferentes subpoblaciones que mejoran la capacidad de distinguir entre las diversas muestras / condiciones. La Figura 7 muestra la gráfica bivariada del recuento de puntos de LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para las cuatro muestras: Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina. La muestra de control se utilizó para establecer la estrategia de bloqueo para tres poblaciones: puntos bajos, puntos altos / bajo BDC3 y puntos altos / alto BDC3. Las muestras de control demostraron que más del 98% de las células tenían 1 o menos manchas. La frontera entre los High Spots / Low BDC3 y High Spots / High BDC3 se ajustó a una puntuación BDC3 de 1 porque más del 91% de la muestra Control tenía una puntuación BDC3 menor de 1. Un resumen de los resultados para las parcelas bivariadas Se muestra en la Tabla 1 .

Edad = "1"> figure-results-1
Figura 1: Configuración del instrumento MIFC. Una captura de pantalla de los ajustes del instrumento MIFC utilizados para este experimento, descritos en el paso 8 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: Estrategia de control de software de análisis. Una captura de pantalla del esquema de gating de software de análisis, descrito en el paso 9 del protocolo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Fig3.jpg "/>
Figura 3: Mascarilla de punto LC3. Imágenes y máscaras de celdas Jurkat utilizadas para crear la función de recuento de puntos. Se muestran BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Brillante, 5), Spot (M11, Ch11 - LC3 - AF647, Brillante, 5,3,1) y Spot (M11, Ch11 - LC3 - AF647, Bright, 6,2,1). La máscara que funcionó mejor para todas las células mostradas era Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-3
Figura 4: Histogramas de conteo puntual LC3. Utilizando la función de contaje spot Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 y los histogramas de conteo de puntos LC3-AF647 para Control ( A , azul claro), Control + CloroquinoE ( B , azul), Starved ( C , rosa), y Starved + Cloroquina ( D , rojo). Los recuentos medios para Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina son 0,07, 1,13, 0,10 y 2,77, respectivamente. BF, LC3-AF647 (rojo), DAPI colorante nuclear (azul) y un compuesto de las imágenes LC3-AF647 y DAPI de células representativas para el recuento de puntos promedio se muestran para Control ( E , 0 puntos), Control + Cloroquina F , 1 punto), Starved ( G , 0 manchas), y Starved + Cloroquina ( H , 3 manchas). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-4
Figura 5: Histogramas BDC3 de p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramas paraR Control ( A , azul claro), Control + Cloroquina ( B , azul), Starved ( C , rosa), y Starved + Cloroquina ( D , rojo). La puntuación media de BDC3 para Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina es de 0,57, 0,82, 0,74 y 0,98, respectivamente. BF; P62 - AF488 (verde); LAMP1 - PE (amarillo); LC3 - AF647 (rojo); Y un compuesto de las imágenes p62-AF488, LAMP1-PE y LC3-AF647 de células representativas para la media BDC3 se muestran para Control ( E ), Control + Cloroquina ( F ), Starved ( G ) y Starved + Cloroquina H ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-5
Figura 6: Histogramas BDC3 de p62 / LC3 / DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina. ( A ) se muestra el histograma BDC3 p62 / LC3 / DAPI para la muestra de Starved + Cloroquina. La puntuación media de BDC3 es 0,07. ( B ) BF; P62 - AF488 (verde); LC3 - AF647 (rojo); DAPI (azul); Y se muestra un compuesto de las imágenes p62-AF488, LC3-AF647 y DAPI de células representativas para la BDC3 media para la muestra de Starved + Cloroquina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-6
Figura 7: Parcelas bivariadas del recuento de puntos de LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Parcelas bivariadas del recuento de puntos LC3 frente a BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 para las células Control, Control + Cloroquina, Starved y Starved + Cloroquina Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (verde); LAMP1 - PE (amarillo); LC3 - AF647 (rojo); Y se muestra un compuesto de las imágenes p62-AF488, LAMP1-PE y LC3-AF647 de tres regiones ( es decir, Puntos Bajos, Puntos Elevados / Bajo BDC3 y Puntos Elevados / Alto BDC3) para la muestra de Chorroquina Starved +. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Conteo de células Detalle brillante Colocalización 3 Media Cuenta puntual LC3 Media % Punto bajo % Punto alto / bajo BDC3 % High Spot / High BDC3
Controlar 439 0,57 0,07 98,2 1.8 0,0
Control + Cloroquina 1432 0,82 1,13 68,9 19,5 11,7
Famélico 1204 0,74 0,10 98,4 0,6 1.0
Starved + Cloroquina 1811 0,98 2,77 32,1 36,9 31,0

Tabla 1: Resumen de Jurkat LC3 punto Count frente BDC3 p62 / LÁMPARA1 / LC3 Bivariadas Terreno

Discusión

Al realizar este análisis, hay algunas cosas a considerar. Es importante tener muestras de control apropiadas. Para este experimento, se utilizaron dos controles diferentes: Control y Control + Cloroquina. La muestra de control se utilizó para establecer el umbral para las regiones. Representa el nivel basal de autofagia sin detener la degradación lisosomal y es el control de la muestra Starved. Sin embargo, la muestra Control no es un control apropiado para comparar con los resultados de la muestra de Starved + Cloroquina porque la propia cloroquina influye en la muestra de control. Por lo tanto, fue necesario tener una muestra Control + Cloroquina.

Antes de realizar cualquier análisis para la autofagia, es importante analizar / gate solo en las células individuales que están en foco ( es decir, gradiente RMS mayor de 60), ya que los resultados podrían verse afectados si hay más de una célula o las imágenes son fuera de foco. Es crucial que el autofagosomaEs y los lisosomas están en foco para el recuento apropiado del punto y el análisis de BDC3. Las células apoptóticas deben ser removidas antes del análisis de autofagia, ya que pueden sesgar los resultados y no deben ser incluidas. Debe haber tinción apropiada para los tres marcadores ( es decir, LC3, p62 y LAMP1). Por ejemplo, los tres marcadores son intracelulares y deben tener una señal punteada; Si la señal no es punteada, o si está en la superficie de la célula, la tinción no sería apropiada y el experimento / tinción debe ser rehecho. Además, para que la BDC3 sea precisa, es esencial que las células de las celdas que son brillantes para los tres marcadores fluorescentes de interés. Para evitar la medición de BDC3 en la fijación no específica, los artefactos de formación de imágenes y / o el ruido es necesario disponer de eventos positivos. Esto es crucial, ya que BDC3 potencialmente puede amplificar artefactos que no son señales verdaderas. Debido a que BDC3 sólo puede realizarse en eventos positivos brillantes, muchas células pueden no ser incluidas en el análisis final; Esto es especRealmente es cierto para las células de control que no tienen acumulación de LC3, p62 y / o LAMP1. Por lo tanto, una limitación de este ensayo es que BDC3 sólo examina las células que son positivas para los tres marcadores, que podría no ser apropiado para todos los experimentos de autofagia.

Al igual que BDS, que se ha informado previamente 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 solo no tiene en cuenta el número de organelas de autofagia que se co-localizan, dando lugar en gran medida De variabilidad en el número de autofagosomas. Por lo tanto, el enfoque bivariado presentado por Rajan et al. fue empleado. En cuanto a las parcelas bivariadas, uno podría preguntar siLas células deben ser positivas para LC3, p62 y LAMP1; ¿Por qué hay tantas células que tienen 0 puntos? Esto se debe a que la señal LC3 puede ser lo suficientemente brillante para la co-localización, pero puede no satisfacer el umbral establecido por la máscara de pico (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) lugar.

El protocolo presentado aquí utiliza MIFC para contar LC3 puncta y la co-localización de tres marcadores de autofagia para medir el flujo autofágico. Bajo condiciones basales (muestra de control), el número de autofagosomas era bajo, y pocas células se encontraron con "High Spots". Con la adición de cloroquina, que inhibe la fusión de autofagosomas / lisosomas, hubo un aumento en el número de manchas de LC3. Dado que el lisosoma es incapaz de romper el autofagosoma y el p62, que reside en el autofagosoma, esto conduce a un aumento en la co-localización de la LC5, p62 y LAMP1 autolysosome acumulación. Este efecto se amplificó bajo el rostro de nutrientesIon, que induce la autofagia. Sin embargo, sin la adición de cloroquina, no hubo un aumento significativo en el número de autofagosomas, muy probablemente debido a un aumento en la tasa de rotación autofágica. Cuando las células se someten a hambre en presencia de cloroquina, hubo un aumento en la co-localización y el número de autofagosomas, lo que apoya la conclusión de que la inanición aumenta el flujo autofágico. EBSS es conocido por ser un poderoso inductor de la autofagia. Por lo tanto, se espera que el aumento sea grande. Si se usa otro método, como la inducción del fármaco, para inducir la autofagia, la diferencia entre las muestras control y tratada puede ser más sutil.

Este protocolo particular fue diseñado para medir la autofagia en líneas celulares humanas, pero el ensayo podría adaptarse a otras especies cambiando a anticuerpos para esa especie particular. Además, el método de análisis podría utilizarse para cualquier aplicación intracelular que requiera la co-localizaciónDe tres sondas / marcadores.

Divulgaciones

Soy empleado de MilliporeSigma, el fabricante de la marca Amnis ImageStream, que se utilizó en este estudio.

Agradecimientos

Me gustaría dar las gracias a mis compañeros de trabajo en MilliporeSigma, Philip J. Morrissey y Sherree L. Friend, por su apoyo y orientación a lo largo de los años. También quiero dar las gracias a Vidya Venkatachalam y Bryan R. Davidson por su ayuda con la función BDC3 en el software IDEAS , Ryan P. Jessup para ayudar a la edición de este manuscrito, Raymond Kong para ayudar en el día de rodaje, y un agradecimiento especial A la artista de maquillaje Cynthia Xamonthiene.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubo de centrífuga de 15 mLFalcon352096
tubo de centrífuga de 50 mLFalcon352070
AF647 etiquetado Donkey anti-Mouse - IgG InvitrogenA-31571Burro anti-ratón Anticuerpo secundario IgG (H+L), Alexa Fluor 647. Concentración 2 mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571
clon antihumano CD107a-PE (LAMP1)BioLegend328607H4A3. Concentración 400 y micro; g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
clon antihumano CD45- AF488BioLegend304017HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html
CD45- PE  antihumanoBioLegend304008Clon HI30.  http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html
anti-humano CD45-AF647 BioLegend304018Clon HI30.  http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html
Anti-LC3 (Humano) clon mAb 4E12MBL International CorporationM152-3Clon 4E+12.  Concentración 2 mg/mL.  https://www.mblintl.com/products/m152-3
Anticuerpo anti-SQSTM1 / p62 [EPR4844] - Marcador de autofagosomas (Alexa Fluor 488)abcamab185015Clon EPR4844. Concentración 0,5 mg/mL. http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html
Sal de difosfato de cloroquinaSigma-AldrichC6628-25G
Limpiador - Coulter Clenz Beckman Coulter8546931Llene el recipiente con 200 mL de Limpiador.  https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/
DAPI Stain 5 mg/mLMilliporeSigma508741http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741
Deburbujeador - 70% IsopropanolMilliporeSigma1.3704Llene el recipiente con 200 mL de Deburbujeador.  http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 10xMilliporeSigmaBSS-2010-B  Ca++Mg++ Libre 
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1xMilliporeSigmaBSS-1006-BPBS Ca++Mg++ Free 
Earle's Balanced Salt Solution 1xGibco14155
Fetal Bovine SerumHyCloneSH30071.03
Formaldehído, 10%, libre de metanol, Ultra PurePolysciences, Inc.04018Esto es lo que se utiliza para el 4% y el 1% de formalina. PRECAUCIÓN: La formalina/formaldehído es tóxica por inhalación y si se ingiere. Irritante para los ojos, el sistema respiratorio y la piel. Puede causar sensibilización por inhalación o contacto con la piel. Riesgo de daños graves en los ojos. Riesgo potencial de cáncer.  http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/
Solución salina equilibrada de Hanks 1xGibco14175
Jurkat, clon E6-1 (ATCC TIB-152)ATCCTIB-152https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx
MEM aminoácidos no esenciales 100xHyCloneSH30238.01
MIFC - ImageStreamX Mark IIMilliporeSigma100220Se utilizó una cámara ImageStreamX Mark II de 2 cámaras con láseres de 405 nm, 488 nm y 642 nm. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006
software de análisis MIFC - IDEAS 6.2MilliporeSigma100220El software complementario del MIFC (ImageStreamX MKII).  IDEAS versión 6.2
Software MIFC - INSPIREMilliporeSigma100220Este es el software que ejecuta el MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE versión 200.1.388.0
PE anti-humano CD107a (LAMP-1) clon de anticuerpo H4A3BioLegend328608 http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html
Solución de penicllina/estreptomicina/glutamina 100xHyCloneSV30082.1
Enjuague - Agua ultrapura o agua desionizadaNANAPuede usar cualquier agua ultrapura o agua desionizada. Llene el recipiente con 900 mL de enjuague.
RPMI-1640 Medio 1xHyCloneSH30027.01
Funda - PBSMilliporeSigmaBSS-1006-BEsto es lo mismo que la solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco 1X  Libre de Ca++MG++. Llene el recipiente con 900 mL de funda.
Tubos de microcentrífuga de polipropileno siliconadoFisherbrand02-681-320Fisherbran Tubos de microcentrífuga siliconados de baja retención 1,5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936
solución de piruvato de sodio (100 mM)Esterilizador HyCloneSH30239.01
- 0.4 - 0.7% HipocloritoVWRJT9416-1Este es esencialmente un blanqueador de Clorox al 10% que se puede hacer diluyendo el blanqueador de Clorox con agua. Llene el recipiente con 200 ml de Sterilzer.
Reactivo de calibración del sistema - SpeedBeadMilliporeSigma400041Cada tubo contiene ~10 mL.  https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav 
Matraz T75Falcon353136
TRITON X-100, Detergente PROTEIN GRADE, Solución al 10%, Filtro estérilMilliporeSigma648463-50MLhttp://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463
Agua, Grado de Cultivo Celular HyCloneSH30529.03

Referencias

  1. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  2. Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. Why should autophagic flux be assessed? Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).
  3. Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. LC3 and Autophagy. Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).
  4. Larsen, K. B., Lamark, T., Øvervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bjørkøy, G. A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1. Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).
  5. Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. Applications of flow cytometry for measurement of autophagy. Methods. 75, 87-95 (2015).
  6. Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. Methods in mammalian autophagy research. Cell. 140 (3), 313-326 (2010).
  7. Klionsky, D. J., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy. Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).
  8. Arsov, I., et al. BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development. Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).
  9. Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy. Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).
  10. Altman, B. J., et al. Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis. Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).
  11. Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence. J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).
  12. Tra, T., et al. Autophagy in human embryonic stem cells. PLoS One. 6 (11), (2011).
  13. Yuan, N., et al. Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia. Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).
  14. Leveque-El Mouttie, L., et al. Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF. Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).
  15. Watson, A. S., et al. Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia. Cell Death Discov. 1, 15008(2015).
  16. Stranks, A. J., et al. Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages. J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).
  17. Clarke, A. J., et al. Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development. Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).
  18. Warnes, G. Flow cytometric assays for the study of autophagy. Methods. 82, 21-28 (2015).
  19. Bjørkøy, G., et al. p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death. J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).
  20. Phadwal, K., et al. A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells. Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).
  21. Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry. Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).
  22. Kwok, A. S., et al. HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes. J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).
  23. Lopez-Herrera, G., et al. Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity. Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).
  24. Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia. Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).
  25. Pike, L. R., et al. Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival. Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).
  26. Pugsley, H. R. Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry. Methods. 112, 147-156 (2017).
  27. IDEAS. Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Colocalización de LC3colocalización de p62colocalización de LAMP1marcadores de autofagiacuantificación de puncta de LC3microscopía de inmunofluorescenciamarcadores lisosomales
Evaluación del flujo autofágico midiendo la co-localización de LC3, p62 y LAMP1 usando citometría de flujo de imágenes multiespectrales
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.