Disección del páncreas de ratón para análisis histológico y perfiles metabólicos

Resumen

Este artículo de video ofrece una demostración detallada de los procedimientos necesarios para eliminar con éxito el páncreas de un ratón por disección para análisis histológico y perfiles metabólicos.

Resumen

Hemos estado investigando el factor de transcripción específico de páncreas, 1a cre-recombinase; sarcoma de rata LOX-parada-lox-Kristen, glicina, ácido aspártico en el codón 12 (Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +}) tensión del ratón como un modelo humano de cáncer de páncreas. El objetivo de nuestros estudios actuales es identificar nuevos biomarcadores metabólicos de la progresión del cáncer de páncreas. Hemos realizado perfilado metabólico de orina, heces, sangre y extractos de tejido de páncreas, así como el análisis histológicos del páncreas a la progresión del cáncer de la etapa. El páncreas de ratón no es un órgano sólido bien definido como en los seres humanos, sino que es un tejido blando difusamente distribuido que no se identifica fácilmente por individuos familiarizados con la anatomía interna del ratón o por personas que tienen poca o ninguna experiencia realizando disecciones de órganos de ratón. El propósito de este artículo es proporcionar una step-wise manifestación visual para orientar a los novatos en la extirpación del páncreas de ratón por disección. Este artículo debe ser especialmente valioso para los estudiantes y los investigadores nuevos a la investigación que requiere la recolección del páncreas de ratón por disección de perfiles metabólicos o análisis histológicos.

Introducción

El ratón se ha convertido en un importante modelo animal de cáncer de páncreas humano^1,2. En el Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +} modelo de ratón, Kristen oncogene de rata sarcoma (K-Ras) se activa exclusivamente en el páncreas, dando lugar a la iniciación de las lesiones precancerosas en el páncreas, conocidas como neoplasias intraepiteliales pancreáticas (PanINs), que el progreso para adenocarcinomas ductales pancreáticas, comúnmente contempladas como PDACs³. Este sistema de modelo de ratón ofrece uno de los modelos animales mejor disponibles para cáncer pancreático humano^4,5, con la ventaja adicional que el PanINs surgen dentro de los primeros cinco meses de vida y con frecuencia el progreso PDAC dentro de un solo año^4,5, mientras que el cáncer de páncreas ocurre más frecuentemente en los seres humanos 60-70 años de edad.

Extracción de páncreas por la disección de la Ptf1a^{cre / +}; LSL-Kras^{G12D / +} ratones en diferentes edades permite el examen histológico longitudinal detallado de desarrollo del cáncer en el páncreas, que van desde las primeras etapas de PanIN a través de la progresión de la PDAC^{3,4 , 5}. recolección del páncreas en edades que van de cinco a quince meses puede usarse para preparar tejido extractos para caracterizar los cambios globales en el metabolismo del páncreas⁴ que ocurren durante la transición de sano a enfermo del tejido ^6,7.

Este artículo presenta a una completa guía visual de los pasos necesarios para realizar una extracción de páncreas de ratón y proporciona directrices para el almacenamiento de un páncreas para su posterior análisis. Esta guía será igualmente valiosa para personas que realizan investigación sobre otras enfermedades pancreáticas, incluyendo diabetes tipo y deben ser especialmente útiles para estudiantes e investigadores nuevos a la investigación que implica la cosecha de los páncreas de ratón utilizando disección de perfiles metabólicos o análisis histológicos.

Protocolo

los procedimientos realizados en el video y se describen a continuación han sido aprobados por el cuidado institucional del Animal y el Comité uso (IACUC) en la Universidad de Miami.

1. preparación y estímulo de prueba

1. establecer dos zonas diferenciadas para el procedimiento quirúrgico, la mesa de operaciones y la mesa después de la operación. Etapa de ambas áreas con todos los materiales y utensilios necesarios. Tabla de
   1. el funcionamiento de la etapa bajo una campana de ventilación. Arreglar la mesa con el equipo de una manera que permite el funcionamiento continuo y sin trabas de procedimiento.
   2. Establecer un cuadro postoperatorio en la misma habitación y cerca de la mesa principal de la operación. Mantener ambas tablas como ambientes estériles durante el procedimiento.
2. Lugar las siguientes fuentes en la mesa de operaciones: un tarro con tapa, un tubo de 15 mL, un par de tijeras quirúrgicas, una apretar botella de etanol al 70%, dos placas de espuma, dos pinzas, dos jeringas de 1 mL 21 calibre, dos tubos de 50 mL, tubo de uno centrífuga , un frasco criogénico, cuatro cojines quirúrgicos, diez pernos, un dispensador de toallitas de esterilización y un contenedor.
3. Coloque los siguientes suministros en la mesa después de la operación: una balanza analítica, una 4 L dewar de nitrógeno líquido, un ancho superficial de la boca dewar, un flotante estante microtubo, un par de tijeras quirúrgicas, pinzas de dos, cuatro frascos criogénicos y un dispensador de toallitas o pañitos estériles.
4. Llenan un 50 mL y un tubo de 15 mL a 75% volumen de formalina.
5. Usando un perno en cada esquina, colocar un cojín quirúrgico a un tablero de la espuma de aproximado 30 cm x 30 cm para servir como la Junta de la disección. Utilice las cuatro clavijas restantes durante la operación. Preparar un pequeño tablero de la espuma con un paño quirúrgico para transferir a los órganos a la mesa después de la operación.
   PRECAUCIÓN: Isoflurano (99.9%) es un producto químico tóxico y debe utilizarse en una campana de ventilación para garantizar el máximo nivel de seguridad de la depuración de gases anestésicos residuales ⁸. Información adicional sobre los riesgos a los investigadores asociados con el uso del método de caída libre con isoflurano puede encontrarse en un artículo por Taylor y Mook ⁸.
6. Coloque un cojín quirúrgico en el tarro de cristal y remojo con unas gotas de isoflurano (99,9%) y coloque una toalla de papel sobre la parte superior para evitar el contacto directo del ratón con el isoflurano. Del mismo modo, utilice una almohadilla de quirúrgica línea tubo restante y poner en remojo con unas gotas de isoflurano y coloque una almohadilla adicional sobre la parte superior para evitar el contacto directo entre el ratón y el isoflurane.
7. Nitrógeno líquido vertido en la boca ancha baja dewar hasta línea de llenado máximo se alcanza.
Compartimiento de
8. lugar el ratón seleccionado para la disección en la anestesia, es decir, el tarro de cristal con un paño empapado con unas cuantas gotas de isoflurano (99,9%) cubierto con la tapa, para ~ 1 min
   Nota: Este tiempo varía de ratón a ratón. Una vez que el ratón está inconsciente, retire de la cámara y colocarlo sobre el tablero operativo.
9. Oriente el ratón de manera que esté acostada lateral ventral y con su cabeza apuntado lejos del científico. Coloque el cabezal dentro del tubo con un cojín quirúrgico impregnado con unas gotas de isoflurano (99,9%) y realizar una prueba de estímulo una pizca de pie para asegurarse de que el ratón no responde a estímulos.
   1. Si esta prueba falla y el ratón responde a la prueba del pellizco de pie, repita el paso 1.8.

2. Inicial de incisión, punción del corazón y la eutanasia

1. Pin las extremidades del ratón para el tablero de la espuma quirúrgica y mojado el lado ventral del ratón con etanol al 70%.
2. Pellizcar la piel/piel cerca de la abertura uretral con pinzas y tire ligeramente hacia arriba. Hacer una incisión con las tijeras quirúrgicas a través de la cavidad abdominal a partir de la apertura uretral, la línea media y terminando en la barbilla.
   1. Cerca del punto de partida de la incisión inicial, agarra un lado de la piel/piel con las pinzas y hacer otra incisión con las tijeras hacia abajo y en diagonal hacia la pata trasera.
   2. Repetirlo de la misma manera en el lado opuesto.
      Nota: La piel, la piel puede ser inmovilizada para crear una abertura más amplia, pero no es necesaria.
3. Localizar el corazón y quitar el pericardio, que es el saco alrededor del corazón, para evitar la obstrucción de la aguja de la jeringa.
   1. Agarre el pericardio con el fórceps y cortar con las tijeras. Realizar la punción del corazón introduciendo con cuidado la aguja de la jeringa en el corazón y poco a poco empieza a retraer el émbolo.
   2. Para recolección de sangre óptimo, utilice el émbolo de la aguja para imitar la acción de bombeo del corazón y evitar demasiado rápido.
      Nota: Por lo general alrededor de 1 mL de sangre se puede recoger.
   3. Después de completar la colección de sangre, disipar la sangre en el tubo de centrífuga y deseche la jeringa en el contenedor.
   4. Después de realiza la punción del corazón, realizar eutanasia quitando los accesorios conectando el corazón.
      Nota: Heparina, un anticoagulante, no fue añadida a la jeringa en este procedimiento antes de la punción del corazón para permitir que la sangre a coagular para la colección de suero en este estudio específico. Sin embargo, si el investigador desea prevenir la coagulación de la sangre para recoger el plasma, la heparina podría añadirse a la jeringa antes de la punción del corazón.
4. Si el estudio implica el genotipado del ratón, cortar una porción de la oreja con las tijeras y coloque en un tubo de centrífuga para una verificación de genotipos.

3. extracción de páncreas

1. localización del estómago en el lado izquierdo del ratón. Comenzar suavemente (para evitar el rasgado) separa el páncreas estómago y el duodeno mediante el uso de dos pinzas.
   Nota: Al extraer el páncreas desde el estómago y los intestinos, es muy importante que las pinzas se utilizan suavemente para guiar el tejido del páncreas de los órganos y para no aplastar o romper el páncreas con el fórceps.
   1. Continuar separar el páncreas de las secciones de yeyuno e íleon del intestino delgado y por último de intestino ciego del intestino grande.
2. En el intestino ciego, vuelva a colocar las pinzas y continuar la separación del páncreas a lo largo de los dos puntos restantes hacia el recto.
   Nota: En este punto, es conveniente cortar y quitar la porción del estómago a la región de los dos puntos inmediatamente anterior del recto.
3. Localizar el páncreas y Unido del bazo. Deslice el páncreas hacia el lado derecho del ratón. Separar las conexiones restantes entre el páncreas y la cavidad torácica con el fórceps para separar totalmente el páncreas y el bazo contiguas.
4. Quitar el páncreas y extienda para el examen. Deje el bazo, atado páncreas para propósitos de identificación.
   1. Quitar todos del tejido conectivo, grasa y mesentérico del tejido del páncreas.
      Nota: Este tejido es más blanco en color y así puede ser fácilmente distinguido del tejido del páncreas es más rosado en color. Esto es particularmente importante si el páncreas entero debe ser extirpado. Por ejemplo, si el páncreas tiene que ser pesado y en comparación con el peso corporal o entre grupos de animales. En el Ptf1a ^{cre / +}; LSL-Kras ^{G12D / +} modelo con ratones, específicamente en los meses más viejo, duro fibroso tejido pancreático puede estar presente. En este caso, deberá realizarse remoción cuidadosa del páncreas como los intestinos podrían ser entrelazados en tejido tumoral. En casos avanzados, bazo anormal y el tejido del hígado pueden también estar presentes.
5. Si lo desea, eliminar otros órganos en este momento.

4. recopilación de datos y almacenamiento

1. después de la extracción de los órganos, mover las muestras al área de postoperatorio para la preservación de.
2. Pesan cada órgano y colocarlos en su respectivo frasco criogénico.
   Nota: a lo largo de ingenioh la masa de cada muestra, se deben registrar las irregularidades para futura referencia.
3. Una vez que los órganos son pesados, colocarlos en el nitrógeno líquido para congelar rápido.
4. Después de snap congelar, almacenar los órganos a-80 ° C para almacenamiento a largo plazo.
5. Colocar las muestras de formol almacenada en la mesa durante la noche y la mañana siguiente cambiar su solución de formalina a etanol al 70%.
   Nota: Estas muestras deben almacenarse a 4 ° C para almacenamiento a largo plazo.
6. Para almacenamiento a largo plazo, congelación de la sangre y oído ponche a-80 ° C.. Para la recolección de suero de la sangre, que la sangre coagular durante 30 minutos y luego centrifugarlo. Eliminar la porción de suero con una pipeta y luego conservarlo a -80 ° C.

5. Limpiar

herramientas

1. desinfección la disección con los trapos de esterilización. Tapa el tubo con el isoflurano empapado cojín quirúrgico. Reemplace la almohadilla quirúrgica en el tablero de la espuma con una esponja quirúrgica fresca. Disponer las porciones del ratón que no fueron recogidas por el centro de ' política de eliminación de animales de s.

Resultados

La figura 1 muestra un resumen del funcionamiento área de medio ambiente y la figura 2 muestra el área de operación post. Aunque esta configuración proporciona la cantidad mínima de equipo y escenificando, individuos puede modificar esto para que mejor se adapte a las necesidades individuales. El protocolo debe ser optimizado según las necesidades específicas del experimento. Este procedimiento se lleva a cabo de forma que termin...

Discusión

Importancia con respecto a los métodos existentes
Mientras que existen otros videos informales de disecciones de ratón, este artículo de vídeo ofrece primera calidad profesional, con revisión por pares, demostración de todos los pasos detallados necesarios para la extracción y recolección de lo páncreas de ratón por disección¹⁰ . Con el páncreas es un órgano principal de la actividad metabólica y de la insulina producción, disección y extracción del páncreas permite la preserva...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tarro de vidrio	Corning	3140-150	El frasco de vidrio utilizado en el video ha sido descontinuado. Este es su reemplazo.
Tapa del tarro de cristal	Corning	9985-150	La tapa del tarro de cristal utilizada en el vídeo ha sido descatalogada.  Este es su reemplazo.
15 mL Falcon Tubes	Fisher Scientific	339650
Tijeras quirúrgicas	Fisher Scientific	9201
Frasco exprimible	Fisher Scientific	03-409-10DD
100% Etanol	Fisher Scientific	22-032-103
Formalina	Fisher Scientific	245-684
Tableros de espuma	Therapak
	Fisher Scientific	200205SHN
1 mL 21G Jeringas	BD Biosciences	309624
Tubos Falcon de 50 mL Fisher	Scientific	339652
Tubos de microcentrífuga de 2.0 mL	Fisher Scientific	02-681-258
Almohadillas quirúrgicas	Fisher Scientific	S67011
T-Pins Longitud:  2"	Productos de Advance Store	X32T-05
Toallitas Esterilizantes	Desechables Profesionales International Inc.	Q85084
Contenedor de objetos punzocortantes	Fisher Scientific	14-827-122
Balanza analítica	Marshall Scientific	ME-AE200
4L Dewar	Taylor-Wharton	4LD
Boca ancha poco profunda Dewar Fisher	Scientific	F3087-V
Bastidor de microtubos flotante	VWR	60986-100
Vial criogénico 1,2 mL, estéril	Fisher Scientific	10-500-25
Isothesia (isoflurano)	Henry Schein Salud Animal	050033
Nitrógeno Líquido	Wright Brothers	NIT-60-XX
Ratón Kras	Cepa The Jackson Laboratory	OO8179
Ratón Cre Cepa	MMRRC	OOO435-UNC

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