Preparación de Herbal Medicine: Decocción de Er-Xian y suero que contiene Er-Xian para In Vivo Y In Vitro Experimentos

El interés en el estudio y la aplicación de la medicina herbaria tradicional está creciendo actualmente. A diferencia de las drogas modernas, en las cuales los ingredientes químicos son definidos, las fórmulas herbarias tienen algunos ingredientes desconocidos y requieren procesos de extracción para permitir la entrega de sus compuestos activos. Aunque muchos estudios tratan de seleccionar un pequeño compuesto con una estructura bien conocida como representante de toda la hierba o fórmula herbaria, ni las eficacias farmacológicas ni los mecanismos pueden considerarse equivalentes ^{1 , 2} . Mientras que las huellas dactilares permiten el análisis de los constituyentes de fórmulas herbarias complejas, algunos constituyentes todavía no se analizan claramente, lo que conduce a un desafío cuando se combinan todos los extractos para el estudio ³ . Las interacciones de numerosos constituyentes / extractos median los efectos terapéuticos de las hierbas medicinales. Para conservar esta ventaja, la forma tradicional de extracto-decocciónIon-todavía es ampliamente utilizado en la clínica. Dado que el procedimiento de extracción tiene un gran impacto en la eficacia terapéutica, es necesario un protocolo estándar de decocción tradicional de agua, especialmente para estudios in vivo ^{4 , 5} .

Por otro lado, al explorar mecanismos farmacológicos, la administración de decocciones a base de hierbas durante estudios in vitro o ex vivo es también un desafío. El concepto de un suero que contenía fármacos fue propuesto por primera vez por Tashino en 1988 ⁶ . Desde entonces, un número creciente de investigadores lo han aplicado a la medicina herbal ^{7 , 8 , 9} . Aunque el método del suero que contiene fármaco tiene algunas limitaciones, tales como la influencia de ciertos componentes del suero, todavía se considera que es un método que imita de cerca las condiciones fisiológicas.

10 ^{, 11 , 12 , 13} . También se ha aplicado al tratamiento de la anemia aplásica ¹⁴ , osteoporosis menopáusica ^{15 , 16 , 17} , fallo ovárico prematuro ¹⁸ , cáncer de mama ¹⁹ , cáncer de ovario ²⁰ y pubertad tardía ²¹ . Aquí presentamos protocolos detallados para la preparación de la decocción er-xian (EXD) y su suero que contiene fármaco. Además, se describe la aplicación de EXD y EXD conteniendo suero a los modelos de osteoporosis menopáusicas murinos.

Un EXD se compone de 9 g cada uno de Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis y Radix Angelicae Sinensis y 6 g de Cortex Phellodendri y Rhizoma Anemarrhenae por paciente adulto al día. La dosis equivalente para un ratón es de 0,1418 EXD / kg / día basándose en la siguiente ecuación ²² : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) ^1/3 . DA y dB se refieren a la dosis por peso corporal (mg / kg) del ser humano y del ratón, respectivamente. La dosis, en mg / kg, se sustituye por el número de EXD / kg. RA y RB representan el factor del cuerpo humano y el factor corporal del ratón respectivamente, que son proporcionales a la (superficie corporal (m ² ) / peso corporal (kg)) ^2/3 (ver Tabla 1 ). WA y WB indican el peso corporal (kg) del humano y del ratón, respectivamente.

El protocolo sigue las pautas del cuidado animal de la universidad de Shangai de la medicina china tradicional y es aprobado por el experimento animal Comité de Ética animal de Shangai.

1. Protocolo I: Preparación de EXD

1. Cálculo
   1. Administrar el EXD a un grupo de tratamiento de 10 ratones hembra de seis meses de edad de Imprinting Control Region (ICR) (0,02 kg / ratón), 5 días a la semana durante 12 semanas.
      NOTA: Se necesitan un total de 1.702 EXDs. Debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos, en la práctica real, administrar 2 EXDs.
   2. Calcular el volumen de EXD aplicado por ratón ( es decir, V = (0,1418 EXD / kg • día) * (0,02 kg / ratón) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / ratón • día).
2. Remojo
   1. Colocar todas las materias primas de dos EXD ( es decir, Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) y Rhizoma Anemarrhenae (12 g), 96 g en total) en un recipiente con tapa.
      NOTA: Se recomienda un recipiente de cerámica.
   2. Macerar las hierbas crudas con 500 mL de agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
3. Primera decocción acuosa
   1. Calentar las hierbas utilizando una cocina de gas o una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 minutos, el tiempo depende de la potencia de calefacción, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Baja la potencia a fuego lento durante 2 h.
4. Primera filtración
   1. Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
   2. Devolver el residuo de hierbas restanteN el papel de filtro al recipiente.
5. Segunda decocción acuosa
   1. Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
   2. Repita el paso 1.3.
6. Segunda filtración
   1. Repita los pasos 1.4.1 y 1.4.2.
   2. Vierta la segunda decocción en el mismo vaso. Mezclar la primera y la segunda decocciones juntas.
7. Concentración
   1. Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo cocción a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una barra de vidrio.
   2. Cuando la decocción se reduce a 200 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 500 ml.
   3. Repita el paso 1.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 100 mL.
8. Almacenamiento y administración
   1. Transferir la decocción concentrada a una botella de vidrio estéril. Dejar enfriar a temperatura ambienteRe (RT). Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   2. Usando una aguja de sonda, administre 0,14 mL / ratón de la decocción a ratones ovariectomizados (OVX) una vez al día, 5 días a la semana durante 12 semanas.

2. Protocolo II: Preparación de suero que contiene EXD

1. Cálculo
   1. Calcular la dosis equivalente de rata (RED) usando 0,15 kg como el peso corporal de cada rata (1 mes de edad): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 EXD / Kg / día.
      NOTA: Se necesita un total de 10 ml de suero que contenga EXD para preparar 100 ml de medio de cultivo (10% de suero que contenga EXD). Se espera que cada rata proporcione 2 ml de suero. Por lo tanto, 6 ratas (una pérdida del 20% se tienen en cuenta) son necesarios para la administración de EXD una vez al día durante 3 días. El número de EXD es: (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (6 ratas) * (3 días) = ​​0.300 EXD. De nuevo, debido a que los EXDs se miden en incrementos discretos,Utilice 1 EXD.
   2. Calcular el volumen de EXD aplicado por rata ( es decir, V = (0.111 EXD / kg • día) * (0.15 kg / rata) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / rata • día).
2. Remojo
   1. Ponga las materias primas para 1 EXD en un recipiente con una tapa. Macerar las hierbas crudas en agua destilada durante 1 h; El agua debe cubrir las hierbas por cerca de una pulgada. Deja que todas las hierbas se empapen completamente.
3. Primera decocción acuosa
   1. Calentar las hierbas utilizando una cocina de inducción de alta potencia hasta que el agua hierve (alrededor de 5 - 10 min, el tiempo depende de la potencia calorífica, el recipiente y la cantidad de hierbas y agua). Apague la alimentación a fuego lento durante 2 h.
4. Primera filtración
   1. Cubra un vaso de precipitados de 500 ml con papel de filtro regular o con gasa y algodón. Vierta cuidadosamente la decocción en el vaso de precipitados a través del filtro. Deje las hierbas en el recipiente.
5. Segunda decocción acuosa
   1. Añadir agua destilada al recipiente con las hierbas; Deje cubrir las hierbas por cerca de una pulgada.
   2. Repita el paso 2.4.
6. Segunda filtración
   1. Repita los pasos 2.5.1 y 2.5.2.
   2. Vierta la segunda decocción en el mismo vaso de precipitados que en el paso 2.4.1 y mezcle la primera y la segunda decocciones juntas.
7. Concentración
   1. Colocar el vaso en una cocina de gas con gasa de alambre libre de amianto entre ellos, calentar la decocción con un bajo a fuego lento y revolver lentamente y continuamente con una varilla de vidrio.
   2. Cuando la decocción se reduce a 100 ml, se transfiere a un vaso de precipitados de 100 ml.
   3. Repita el paso 2.7.1 hasta que la decocción se reduzca a 50 ml.
8. Almacenamiento y administración
   1. Transferir la decocción concentrada en unaBotella de vidrio. Dejar enfriar a RT. Almacenar a 4 ° C si se utiliza dentro de una semana oa -70 ° C para el almacenamiento a largo plazo.
   2. Administrar intragástralmente 0,83 mL / rata una vez al día durante 3 días.
9. Preparación de suero que contiene EXD
   1. Anestesiar las ratas por inyección intraperitoneal de 300 ml / 100 g de 80 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina a 1 h después de la última administración de EXD. Confirme la adecuada anestesia por pellizco del dedo del pie.
   2. Inciso de la piel y el peritoneo de la rata desde el abdomen hasta el fondo del tórax con un bisturí (o tijeras de operación recta). Crear una incisión de longitud y profundidad de unos 5 cm y 0,5 cm, respectivamente. Mueva las vísceras abdominales a la izquierda utilizando papel de seda.
   3. Usando papel tisú, retire el tejido conectivo de la aorta abdominal para exponer claramente el vaso.
   4. Saque la sangre lentamente de la aorta abdominal usando una jeringa calibre 22 de 10 ml. Transferirlo aUn tubo estéril de 15 ml después de retirar la aguja; Una rata puede producir 8-10 ml de sangre.
      NOTA: La rata debe estar viva ( es decir, con la aorta abdominal pulsando) al comenzar el dibujo de sangre y muerta después de que el dibujo se complete.
   5. Coagular la sangre en posición vertical durante 30 - 60 min a la habitación RT. Centrifugar a 500-600 xg durante 20 min. Colocar cuidadosamente todo el sobrenadante (suero) en un tubo estéril de 50 ml y mezclar todo el suero (de diferentes animales).
   6. Realizar la inactivación por calor mediante la incubación del suero en un baño de agua a 56 ° C durante 30 min. Filtrar el suero utilizando un filtro de jeringa con una membrana de polietersulfona hidrófila de 0,22 μm de tamaño de poro. Utilice el suero fresco o guárdelo a -20 ° C.
10. La preparación de suero que contiene un fármaco de control (utilizada en el grupo de control)
    1. Administrar cada rata con el mismo volumen de solución salina (0,83 mL) una vez al día durante 3 días. Los otros pasos son los mismos que en el paso 2.9.
11. Solicitud
    1. Añadir 10 ml de suero que contenga EXD o suero que contenga fármaco a cada 100 ml de medio, más 1% de penicilina-estreptomicina (PS) [ ^23] .

El efecto de EXD sobre la densidad ósea de ratones OVX

La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) de la sección de la vértebra lumbar muestra un aumento de las trabéculas óseas después del tratamiento EXD in vivo ( Figura 1A , panel derecho) en comparación con las del grupo OVX ( Figura 1A , panel izquierdo). La Figura 1B muestra las imágenes representativas de μCT de la 4ª columna lumbar en ratones OVX ( Figura 1B , panel izquierdo) y OVX con tratamiento EXD durante 12 semanas ( Figura 1B , panel derecho). Se observan más huesos trabeculares dentro de la vértebra lumbar de ratones tratados con EXD que los de ratones OVX de control. Los datos de la imagen de μCT indican un aumento del volumen óseo / volumen de tejido (BV / TV), el número trabecular (Tb.N) y el grosor trabecular (Tb.Th) y la disminución del espaciamiento trabecular (Tb. Sp) de la 4ª columna lumbar En ratones EXD ( Figura 1C ).

El efecto de EXD sobre la osteogénesis de células madre mesenquimales óseas (bMSCs) de ratones OVX

La Figura 2 representa el potencial osteogénico de las BMSC. Las gotitas de grasa (asterisco, forma irregular de una gota de lípido) se forman automáticamente cuando se cultivan bMSCs de ratones OVX durante 7 días ( Figura 2A , panel izquierdo). En los ratones tratados con EXD, se forman nódulos óseos (flecha) en lugar de una gotita de grasa ( Figura 2B , panel derecho). Un ensayo de fosfatasa alcalina (ALP) demuestra que se pueden detectar más células positivas a ALP (púrpura) en las bMSC tratadas con EXD ( Figura 2B , panel de la derecha) en comparación con las de las bMSC de los ratones OVX control ( Figura 2B , panel izquierdo).

Los cambios en la expresión génica entre los ratones OVX y EXDS = "xref"> 24

Hierarchical agrupación muestra que la expresión de 389 genes revelados por microarray en bMSCs fue cambiado (> 1,5, normalizado por no OVX ratones) entre OVX y EXD-ratones tratados in vivo (total: 26.991 genes) ( Figura 3 ]. Verde indica que la expresión fue upregulated, mientras que el rojo indica que la expresión fue downregulated. Tres muestras en el mismo grupo se agrupan primero, indicando las cualidades confiables del perfil. La Figura 4 muestra la ruta de señalización superpuesta dirigida por EXD, tanto in vivo como in vitro .

Figura 1: El efecto de EXD en la morfología ósea.
( A ) Tinción de H & E de la 4ª sección lumbar de ratones tratados con OVX y EXD. Unesdoc.unesco.org unesdoc.unesco.org 4º lumbar en ratones control OVX y EXD. ( C ) Cuantificación de μCT. BV: volumen óseo, TV: volumen tisular, Tb.N: número trabecular, Tb.Th: grosor trabecular, y Tb.Sp: espaciamiento trabecular. Las columnas representan las medias ± SE. N = 6 por grupo. * P <0,05, ** p <0,01 EXD versus OVX (prueba t de Student). ( AC ) se han modificado de Shufen Liu et al. 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: El efecto de EXD en la diferenciación bMSC.
( A ) Las imágenes de bMSCs cultivadas durante 7 días después de beiNg aislado del fémur de ratones tratados con OVX o EXD. * Indica una gota de grasa. Una flecha indica un nódulo óseo. ( B ) tinción con ALP de BMSCs tratadas con OVX y EXD cultivadas durante 7 días (púrpura representa ALP positivo). ( C ) Cuantificación de ( B ). Las columnas representan la media ± SE de tres platos (seis ratones) por grupo. ** p <0,01 EXD versus OVX (prueba t de Student). ( AC ) se han modificado de Shufen Liu et al. 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El efecto de EXD en el perfil de expresión génica.
Calormap de la agrupación jerárquica de la expresión de 389 genes en OVX y EXD bMSCs Cosecha el 7º día después de la disociación. La escala (imagen pequeña) indica cambios de veces normalizados por bMSC no-OVX. La lista de genes se proporciona en el archivo suplementario 1 . La figura se ha modificado de Shufen Liu et al. 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Efecto de la EXD en la vía de señalización superpuesta tanto en experimentos in vivo como in vitro .
Las primeras 10 vías de señalización superpuestas que se invierten por EXD in vivo y EXD que contiene suero in vitro basado en la vía KEGG. Los genes relacionados con las vías se muestran en el archivo suplementario 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Factor R en diferentes especies.
El factor R en 8 especies que se utilizan comúnmente en la investigación farmacológica. El factor R es proporcional a: (superficie corporal (m 2 ) / b(Kg)) 2/3 .

Archivo suplementario 1.
Información sobre 389 genes que son upregulated o downregulated ≥ 1,5 veces, pero son rescatados por EXD in vivo . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo suplementario 2.
Información sobre la vía de señalización (basada en la vía KEGG) y genes relacionados tanto en experimentos in vivo como in vitro . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.