Artículo de método

Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

DOI:

10.3791/55655

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18 de mayo de 2017

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1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

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En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los filamentos intermedios (IF), junto con filamentos de actina y microtúbulos, forman el citoesqueleto, un elemento estructural crítico de cada célula. El funcionamiento normal de las IF proporciona a las células resistencia mecánica y al estrés, mientras que un citoesqueleto disfuncional de IF compromete la salud celular y se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Las modificaciones postraduccionales (PTMs) regulan críticamente la dinámica de IF en respuesta a cambios fisiológicos y bajo condiciones de estrés. Por lo tanto, la capacidad de supervisar los cambios en la firma PTM de IFs puede contribuir a una mejor comprensión funcional y, en última instancia, condicionamiento del sistema IF como un respondedor de estrés durante la lesión celular. Sin embargo, el gran número de proteínas IF, que están codificadas por más de 70 genes individuales y se expresan de una manera dependiente de los tejidos, es un reto importante para clasificar la importancia relativa de diferentes PTMs. Con este fin, los métodos que permiten el monitoreo de PTMs sobre las proteínas IFA nivel de todo el organismo, y no para miembros aislados de la familia, puede acelerar el progreso de la investigación en esta área. Aquí presentamos métodos bioquímicos para el aislamiento de la fracción total, soluble en detergente y resistente al detergente de las proteínas IF de 9 tejidos de ratón diferentes (cerebro, corazón, pulmón, hígado, intestino delgado, intestino grueso, páncreas, riñón y bazo). Demostramos además un protocolo optimizado para el aislamiento rápido de las proteínas IF utilizando matriz de lisis y homogeneización automatizada de diferentes tejidos de ratón. El protocolo automatizado es útil para perfilar IFs en experimentos con alto volumen de muestra (tal como en modelos de enfermedad que implican múltiples animales y grupos experimentales). Las muestras resultantes pueden utilizarse para diversos análisis de aguas abajo, incluyendo el perfilado de PTM basado en espectrometría de masas. Utilizando estos métodos, proporcionamos nuevos datos para demostrar que las proteínas IF en diferentes tejidos de ratón (cerebro e hígado) experimentan cambios paralelos con respecto a su expresiónY los PTM durante el envejecimiento.

Introducción

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Las IF son una familia de proteínas que en los seres humanos están codificadas por 73 genes y categorizadas en seis tipos principales: los tipos I a IV son citoplásmicos ( por ejemplo, queratinas epiteliales y capilares (K), mi- cito desmina, neurofilamentos, proteína glicolar fibrilar (GFAP) y otros); Tipo V son las láminas nucleares; Y el tipo VI son IFs en la lente ocular 1 . En cuanto a su organización molecular, las proteínas IF tienen tres dominios comunes: un dominio "varado" de bobina en espiral altamente conservado y dominios globulares de "cabeza" y "cola". Los tetrámeros de proteínas IF se unen para formar precursores de filamentos cortos, que finalmente se incorporan en filamentos maduros que forman estructuras citoesqueléticas y nucleoesqueléticas dinámicas involucradas en la protección mecánica 2 , la detección de estrés 3 , 4 , la regulación de la transcripción 5 y el crecimiento y otras funciones celulares críticas"> 1 , 6 , 7 .

La importancia funcional del sistema de IF se pone de relieve por la existencia de muchas enfermedades humanas causadas por mutaciones missense en genes de IF, incluyendo neuropatías, miopatías, trastornos de la fragilidad de la piel, disfunciones metabólicas y síndromes de envejecimiento prematuro 8 . Algunas mutaciones del gen IF no causan, pero predisponen a sus portadores a la progresión de la enfermedad, como las queratinas epiteliales simples en la enfermedad hepática 9 . Este último se debe a las funciones críticas de protección del estrés de las IF en los epitelios. Las IF en general se encuentran entre las proteínas celulares más abundantes en condiciones basales, pero se induce además fuertemente durante varios tipos de estrés 10 . Por ejemplo, estudios recientes que evalúan los cambios en todo el proteoma en el nematodo C. elegans demostraron que múltiples IFs están altamente reguladas y propensas a agregatiDurante el envejecimiento del organismo 11 , 12 . Dado que el mantenimiento de una estructura de IF adecuada es esencial para la resistencia celular a diversas formas de estrés 10 , la agregación de IF también puede contribuir a la disminución funcional durante el envejecimiento. Sin embargo, los estudios a nivel de organismal que examinan múltiples proteínas de mamífero IF a través de diferentes tejidos sometidos a estrés son deficientes.

Las IF son estructuras altamente dinámicas que se adaptan para satisfacer las demandas celulares. Las queratinas, por ejemplo, experimentan un ciclo independiente de biosíntesis entre el pool de proteínas solubles (no filamentosas) e insolubles (filamentosas) 13 . En condiciones fisiológicas normales, aproximadamente el 5% del total de K8 / K18 se puede extraer en tampón exento de detergente, en comparación con aproximadamente 20% que se puede solubilizar en el detergente no iónico Nonidet P-40, que es bioquímicamente comparable al Triton- X100 14 , 15 . Durante la mitosis hay un notable aumento en la solubilidad de los epitelios de tipo simple K8 y K18 14 , que es menos evidente en las queratinas epidérmicas, pero más evidente en la vimentina y otras proteínas tipo III IF [ 15 , 16] . Las propiedades de solubilidad de las proteínas IF están estrechamente reguladas por la fosforilación, una modificación clave post-traduccional (PTM) para el reordenamiento de los filamentos y la solubilidad 17 , 18 , 19 , 20 . La mayoría de las IF se someten a regulación extensiva por una serie de PTM en sitios conservados, lo que resulta en cambios funcionales [ 17] .

El propósito de este método es introducir a los investigadores que son nuevos en el campo de IF a la extracción bioquímica y métodos analíticos para el estudio de las proteínas de IF a través de múltiples tejidos de ratón. EspecíficoNos centramos en el aislamiento de las proteínas IF utilizando un método de extracción de alta sal y la evaluación de los cambios en PTMs a través de espectrometría de masas y por anticuerpos dirigidos a PTM. Estos métodos se basan en los procedimientos publicados anteriormente 21, pero incluyen modificaciones para extraer diferentes tipos de proteínas IF para descubrir el mecanismo común de regulación en toda la familia IF. Por ejemplo, la acetilación de K8 en un residuo de lisina específico regula la organización del filamento, mientras que la hiperacetilación promueve la insolubilidad de K8 y la formación de agregados 22 . Recientes estudios de perfiles proteómicos globales han revelado adicionalmente que la mayoría de las proteínas específicas de tejido IF son también objetivos para la acetilación y que la mayoría de los sitios de acetilación IF están confinados al dominio de barras altamente conservadas. Esto pone de manifiesto la necesidad de métodos adecuados para el perfil global del sistema IF. También se introduce un método rápido de aislamiento IF proteínas de múltiples tejidos utilizando homogeneización automatizada en optiMatriz de lisis. Las preparaciones resultantes son adecuadas para análisis PTM aguas abajo a través de espectrometría de masas y otros métodos.

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Protocolo

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El protocolo es aprobado y realizado de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Carolina del Norte.

1. Preparaciones

  1. Preparar tampón Triton-X (Triton X-100 al 1%, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar el volumen en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml cada uno de Triton X-100 y 500 mM de EDTA en 490 ml de PBS, pH 7,4. Guarde la solución tampón Triton-X a 4 ° C.
  2. Preparar tampón de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,5%, aumentar el volumen en H _ { 2 } O doble destilado). Para preparar 500 ml: agitar 10 ml de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 ml de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 ml de EDTA 0,5 M y 2,5 ml de Triton X-100, ajustar el volumen a 500 Ml con agua destilada doble). Almacene la solución del almacenador intermediario de la sal a 4 ° C.
  3. Justo antes de su uso, complete una cantidad apropiada de Triton-X y High Salt Buffer ( Por ejemplo, 1 ml para cada muestra de tejido de 25 mg) con un cóctel de proteasa o inhibidor de proteasa / fosfatasa y descartar cualquier tampón no utilizado que contenga los inhibidores.
  4. Preparar EDTA 5 mM en 1x PBS, pH 7,4. Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml de EDTA 0,5 M en 495 ml de 1x PBS, pH 7,4.
  5. Aislar los diferentes órganos del ratón (cerebro, corazón, pulmón, hígado, páncreas, colon, intestino, riñón, bazo) utilizando protocolos aprobados que cumplan con las directrices veterinarias y las normas institucionales 23 . El procedimiento de recolección de tejidos no debe tardar más de 5 minutos en conservar la integridad del ARN y la proteína de los tejidos ricos en proteasas ( por ejemplo, el páncreas debe ser procesado en primer lugar).
  6. Cortar una pequeña cantidad de tejido (~ 5-20 mg) y colocar en solución de almacenamiento de ARN, para la posterior extracción de ARN, la síntesis de ADNc, y el análisis cuantitativo de PCR en tiempo real para la expresión de genes IF. Coloque los tubos de solución de almacenamiento de ARN con tejido a 4 ° C durante la noche y siga el protocolo del fabricante para más sTorage y pasos de aislamiento.
  7. Cortar el resto del tejido en fragmentos más pequeños ( por ejemplo, 0,5 cm) y colocar en criovial. Congelar y almacenar los viales a -80 ° C o nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

2. IF Análisis de la expresión génica

  1. Extraiga el ARN de los tejidos conservados en el reactivo de la solución de almacenamiento de ARN. Utilice cualquier método de extracción de ARN adecuado / preferido de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. Cuantificar la concentración de ARN y utilizar 2 μ g de ARN para generar cDNA utilizando un adecuado adecuado de transcripción de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  3. Utilizando los cDNA generados y los cebadores específicos del gen de ratón IF establecieron reacciones qPCR, incluyendo tres repeticiones técnicas de cada muestra, así como un control en blanco de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  4. Cuantificar IF expresión génica como cambio de veces comparando diferentes condiciones ( por ejemplo, jóvenes frente a los tejidos viejos).

3. PDe los lisados ​​totais de tejidos para la inmunotransferencia

  1. Homogeneizar 25 mg de tejido en 1 ml de tampón de muestra SDS no reductor 2x. Omitir colorante azul de bromofenol del tampón de muestra si se va a realizar un ensayo de proteína colorimétrica para cuantificar la concentración de proteína.
  2. Añadir 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (2-ME) para obtener muestras reducidas. A 200 μL de las muestras no reductoras, añadir 10 μl de 2-ME.
  3. Determinar la concentración de proteínas utilizando un detergente y un agente de reducción de proteínas compatibles de ensayo. Si el colorante ya está incluido en el tampón de muestra, la cantidad de proteína puede estimarse después de ejecutar un gel a través de una serie de técnicas, incluyendo la tinción basada en Coomassie 24 .
  4. Vórtice todas las muestras y calentar a 95 ° C durante 5 min.
  5. Realizar la transferencia western en condiciones reductoras y no reductoras. Exposición membrana brevemente (<1 min) para revelar las especies monoméricas, y más largo (> 1 min) para revelar complejos de alta masa molecular contenidaNg IF proteínas. Si monitorea la agregación, examine todo el gel / membrana (incluyendo los fondos de los pocillos de gel).
  6. Ejecutar un gel paralelo y mancha con una mancha de proteínas como un control de carga [ 24] . En los modelos de enfermedad o en los experimentos con lesiones, se debe utilizar la tinción de proteína total como un control de carga, en oposición a las inmunotransferencias para proteínas de "limpieza" ( por ejemplo , actina, GAPDH) porque estas últimas cambian bajo diferentes condiciones de estrés.

4. Preparación de extractos solubles en detergentes y salinas de FIs específicos de tejidos

  1. Añadir 1 ml de tampón Triton X-100 enfriado con hielo en un homogeneizador de tubo de vidrio y colocarlo sobre hielo.
  2. Retire un pequeño trozo de tejido (~ 25 mg) del almacenamiento de nitrógeno líquido y colóquelo directamente en el homogeneizador de vidrio. Utilice un mazo de politetrafluoroetileno para homogeneizar (50 golpes) y evite hacer burbujas. Mantenga el homogeneizador y el lisado en todo momento fríos.
  3. Transferir el lisado a un micrómetro de 1,5 mlOcentrifugar en hielo y centrifugar a 20.000 xg durante 10 minutos en una centrífuga previamente enfriada (4 ° C).
  4. Recoger la fracción sobrenadante en un tubo separado. Esta es la fracción soluble en Triton X, que puede usarse para la inmunoprecipitación (ip) y el análisis del conjunto soluble en detergente de las proteínas IF. Tenga en cuenta que los pasos 4.1-4.4 pueden repetirse para lograr un extracto IF más limpio del tejido cerebral.
  5. Añadir 1 mL de High Salt Buffer a la pastilla de tejido, transferir a un homogeneizador limpio y dounce 100 golpes. Transferir el homogenado de nuevo al tubo de microcentrífuga y colocar el tubo en un agitador giratorio en la habitación fría durante 1 h.
  6. Centrifugar los homogeneizados a 20.000 xg durante 20 minutos a 4 ° C. Deseche el sobrenadante.
  7. Añadir 1 mL de tampón PBS / EDTA enfriado con hielo al gránulo y homogeneizar el gránulo (20 carreras) en un homogeneizador limpio como paso final de limpieza *. Se transfiere a un nuevo tubo y se centrifuga a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para obtener la proteína IF-Rico extracto de sal alto (HSE).
    * Opcionalmente, vórtice en lugar de homogeneización en este paso.
  8. Desechar el sobrenadante y disolver los gránulos en 300 μl de tampón de muestra de SDS no reductor que ha sido precalentado. Romper el gránulo inicialmente pipeteando y agitando vorticialmente, y luego calentar las muestras durante 5 min a 95 ° C.
  9. Vortex y pipeta según sea necesario para asegurar que el pellet se disuelva. Puede tomar varios minutos para disolver completamente los gránulos.
  10. Almacene todas las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

5. Lisis automatizada de tejidos para la extracción de proteínas IF en experimentos de alto volumen

  1. Para la extracción de ARN, colocar un tampón de lisis (600 μl de tampón por 25 mg de tejido) en un tubo que contenga matriz de lisado D (usa pequeñas esferas cerámicas) y pulsar dos veces durante 25 s en la lisadora de tejidos. Se separa el lisado de la matriz por centrifugación a 20.000 xg y se procede al siguiente paso de forma aislada.
  2. Para la extracción de proteínas, coloque TritEn X-100 (o tampón de muestra de SDS, si se prepara el lisado total) en un tubo de lisis con matriz de lisis SS (utilice un solo cordón de acero inoxidable). Después de probar matrices múltiples, esto se seleccionó porque produce extractos de proteínas IF que son de calidad similar al método tradicional douncing. Tenga en cuenta que el método automatizado no es óptimo para el páncreas y el bazo, y el protocolo de homogeneización estándar debe utilizarse para estos tejidos.
  3. Para proceder con la preparación del Extracto de Alta Sal, retire el cordón de acero inoxidable del tubo usando un imán y centrifugue los tubos a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Continúe con el paso 4.4 (arriba) del protocolo manual.
  5. Almacene todas las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

6. Inmuno-enriquecimiento de proteínas IF modificadas después de la traducción

  1. Preparar tampón PBST (Tween-20 al 0,02% en PBS). Para hacer 50 ml, añada 10 μl de Tween-20 a 50 ml de PBS, pH 7,4.
  2. Preparar el anticuerpo PTM(1-10 mu g de anticuerpo en 200 mu l de PBST). En general, 3 μg de anticuerpo / reacción es una buena condición inicial que se puede optimizar más si es necesario.
  3. Para cada reacción, colocar alícuotas de 50 μl de perlas magnéticas en un tubo de microcentrífuga, colocar en el imán y aspirar la solución de almacenamiento de perlas.
  4. Conjugar las perlas con el anticuerpo de inmunoprecipitación re-suspender en la solución de anticuerpo e incubar en el rotador (end-over-end, para asegurar la mezcla de pequeños volúmenes) a temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Colocar los tubos en el imán y aspirar la solución de anticuerpos.
  6. Enjuagar las perlas conjugadas con anticuerpo una vez en 200 μL de PBST y eliminar el tampón de lavado.
  7. Añadir 0,6-1 ml del lisado de tejido a las perlas, mezclar por pipeteado suave e incubar durante 3 h en el rotador en una habitación fría.
  8. Coloque los tubos en el imán, elimine el lisado y lave las perlas cinco veces con 200 μl de PBST. Después de la última etapa de lavado, recoger las perlas en 100 _6; L de PBS (no Tween-20) y transferir a un tubo nuevo y limpio. Coloque el tubo en el imán.
  9. Aspirar el PBS y agregar 100 μl de tampón de muestra no reductor. Eliminar 50 μL y agregar 2-ME (5%) para hacer muestras reductoras. Calentar las muestras a 95 ° C durante 5 min.
  10. Separar la fracción ip de las perlas en el imán y recogerlo en un nuevo tubo.
  11. Almacene las muestras a -20 ° C hasta su análisis.

7. Preparación de muestras de proteínas IF para el análisis de espectrometría de masas

  1. Programe una consulta con un experto en proteómica antes de iniciar un estudio, ya que el análisis de espectrometría de masas implica un tiempo y un costo significativos.
  2. Tome las precauciones especiales para evitar la contaminación. Manipular todos los geles con guantes limpios e incubar en recipientes limpios, lavados sólo con DDH 2 O (evitar el jabón).
  3. Ejecutar 20-50 μL de la muestra HSE (de las secciones 4 y 5) en un gel de SDS-PAGE de acuerdo con las condiciones estándar.
  4. Mancha con una mancha de proteína durante 1 h. Enjuagar varias veces y eliminar la mancha en ddH 2 O durante la noche. Las bandas de proteínas IF deben ser fácilmente visibles después de la des-tinción.
  5. Coloque el gel entre los protectores de láminas de plástico, escanee y marque las bandas que serán escindidas y enviadas para análisis.
  6. Excise las bandas de la proteína IF usando una nueva maquinilla de afeitar limpia.
  7. Colocar las bandas de gel en tubos de microcentrífuga limpia y transferir a una instalación de espectrometría de masas.

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Resultados

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Un nuevo método rápido para la alta extracción basada en sal de las proteínas de IF de múltiples tejidos de ratón utilizando lysing matriz.

El método tradicional 25 , 26 de aislar el grueso de la fracción de proteína de filamento intermedio del tejido epitelial se modificó aquí para incluir 9 órganos diferentes y ...

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Discusión

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Los métodos que permiten la caracterización bioquímica de las proteínas IF pueden ser útiles para entender numerosos fenómenos fisiopatológicos en los sistemas de mamíferos, ya que las proteínas IF son a la vez marcadores y moduladores del estrés celular y tisular 29 . El principio detrás del método actual se basa en los procedimientos iniciales desarrollados en los años 70 y 80 para aislar, separar y reconstituir las proteínas IF de las células y tejidos, empleando generalmente soluciones de sal...

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por el NIH otorga NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS], y P30 DK034987 [a UNC-Chapel Hill]. Los autores agradecen a Deekshita Ramanarayanan por su ayuda con los experimentos de qPCR y western blot.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009perlas de inmunoprecipitación
PBSThermoFisher Scientific10010049para tampones
Purelink Minikit de ARNThermoFisher Scientific12183018extracción de ARN de tejido Conjunto de
ADNasa PurelinkThermoFisher Scientific12185010Aen columna Digestión de ADN
Dynamag-2Imán ThermoFisher Scientific12321Dpara usar con dynabeads
Reactivo de tinción azul GelCode Tinciónde gel compatible con espectrometría de masasThermoFisher Scientific24592
Pierce ECL Sustrato de Western BlottingThermoFisher Scientific32106para uso en Western blot
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidadThermoFisher Scientific4368813para su uso en el análisis de la expresión génica
Proflex Sistema de PCR de 32 pocillos Proflex 3 x 32 pocillosPCRThermoFisher Scientific
4484073 membrana de transferencia de PVDF ThermoFisher Scientific88520para Western blot
Power Up Mezcla maestra SYBRThermoFisher ScientificA25778para análisis de qPCR
RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020solución para el almacenamiento de tejidos antes del aislamiento del ARN
Novex 4-20% Gel de tris glicinaThermoFisher ScientificXP04205BOXGel de proteínas prefabricado
Anti-Queratina 8 anticuerpo (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428para la detección de Western blot de K8
Anti-VimentinaThermoFisher ScientificMA511883para la detección de Western blot de vimentina
Tampón de transferencia de tris glicina (25x)ThermoFisher ScientificLC3675para la transferencia húmeda de geles de proteínas
2x Tampón de muestras SDSThermoFisher ScientificLC2676para la preparación muestras de gel de proteínas
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisher ScientificLC26755para correr geles de proteínas Cuentas de
lisado - Matrix DMP Biomedicals116913100Perlas de lisis y tubos de matriz para la disrupción de tejidos y la extracción de ARN
Perlas de lisado - Matrix SSMP Biomedicals116921100Perlas de lisis y tubos de matriz para la disrupción de tejidos y la extracción de proteínas
Espectrofotómetro NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEmedición de proteínas y ácidos nucleicos
Homogeneizador Precellys 24Bertin InstrumentsEQ03119Homogeneizador de tejidos automatizado
Sistema de

Referencias

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