Aislamiento de proteínas de filamento intermedio de múltiples tejidos de ratón para estudiar las modificaciones postraduccionales asociadas al envejecimiento

Resumen

En este método, presentamos procedimientos bioquímicos para el aislamiento rápido y eficiente de proteínas de filamento intermedio (IF) de múltiples tejidos de ratón. Se pueden usar IFs aisladas para estudiar los cambios en las modificaciones postraduccionales por espectrometría de masas y otros ensayos bioquímicos.

Resumen

Los filamentos intermedios (IF), junto con filamentos de actina y microtúbulos, forman el citoesqueleto, un elemento estructural crítico de cada célula. El funcionamiento normal de las IF proporciona a las células resistencia mecánica y al estrés, mientras que un citoesqueleto disfuncional de IF compromete la salud celular y se ha asociado con muchas enfermedades humanas. Las modificaciones postraduccionales (PTMs) regulan críticamente la dinámica de IF en respuesta a cambios fisiológicos y bajo condiciones de estrés. Por lo tanto, la capacidad de supervisar los cambios en la firma PTM de IFs puede contribuir a una mejor comprensión funcional y, en última instancia, condicionamiento del sistema IF como un respondedor de estrés durante la lesión celular. Sin embargo, el gran número de proteínas IF, que están codificadas por más de 70 genes individuales y se expresan de una manera dependiente de los tejidos, es un reto importante para clasificar la importancia relativa de diferentes PTMs. Con este fin, los métodos que permiten el monitoreo de PTMs sobre las proteínas IFA nivel de todo el organismo, y no para miembros aislados de la familia, puede acelerar el progreso de la investigación en esta área. Aquí presentamos métodos bioquímicos para el aislamiento de la fracción total, soluble en detergente y resistente al detergente de las proteínas IF de 9 tejidos de ratón diferentes (cerebro, corazón, pulmón, hígado, intestino delgado, intestino grueso, páncreas, riñón y bazo). Demostramos además un protocolo optimizado para el aislamiento rápido de las proteínas IF utilizando matriz de lisis y homogeneización automatizada de diferentes tejidos de ratón. El protocolo automatizado es útil para perfilar IFs en experimentos con alto volumen de muestra (tal como en modelos de enfermedad que implican múltiples animales y grupos experimentales). Las muestras resultantes pueden utilizarse para diversos análisis de aguas abajo, incluyendo el perfilado de PTM basado en espectrometría de masas. Utilizando estos métodos, proporcionamos nuevos datos para demostrar que las proteínas IF en diferentes tejidos de ratón (cerebro e hígado) experimentan cambios paralelos con respecto a su expresiónY los PTM durante el envejecimiento.

Introducción

Las IF son una familia de proteínas que en los seres humanos están codificadas por 73 genes y categorizadas en seis tipos principales: los tipos I a IV son citoplásmicos ( por ejemplo, queratinas epiteliales y capilares (K), mi- cito desmina, neurofilamentos, proteína glicolar fibrilar (GFAP) y otros); Tipo V son las láminas nucleares; Y el tipo VI son IFs en la lente ocular ¹ . En cuanto a su organización molecular, las proteínas IF tienen tres dominios comunes: un dominio "varado" de bobina en espiral altamente conservado y dominios globulares de "cabeza" y "cola". Los tetrámeros de proteínas IF se unen para formar precursores....

Protocolo

El protocolo es aprobado y realizado de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) en la Universidad de Carolina del Norte.

1. Preparaciones

1. Preparar tampón Triton-X (Triton X-100 al 1%, ácido etilendiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar el volumen en solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 ml: mezclar 5 ml cada uno de Triton X-100 y 500 mM de EDTA en 490 ml de PBS, pH 7,4. Guarde la solución tampón Triton-X a 4 ° C.
2. Preparar tampón de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 0,5%, aumentar el volumen en H _ { ₂ } O dobl....

Resultados

Un nuevo método rápido para la alta extracción basada en sal de las proteínas de IF de múltiples tejidos de ratón utilizando lysing matriz.

El método tradicional ^{25 , 26} de aislar el grueso de la fracción de proteína de filamento intermedio del tejido epitelial se modificó aquí para incluir 9 órganos diferentes y .......

Discusión

Los métodos que permiten la caracterización bioquímica de las proteínas IF pueden ser útiles para entender numerosos fenómenos fisiopatológicos en los sistemas de mamíferos, ya que las proteínas IF son a la vez marcadores y moduladores del estrés celular y tisular ²⁹ . El principio detrás del método actual se basa en los procedimientos iniciales desarrollados en los años 70 y 80 para aislar, separar y reconstituir las proteínas IF de las células y tejidos, empleando generalmente soluciones de sal.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dynabeads Protein G	ThermoFisher Scientific	10009	perlas de inmunoprecipitación
PBS	ThermoFisher Scientific	10010049	para tampones
Purelink Minikit de ARN	ThermoFisher Scientific	12183018	extracción de ARN de tejido Conjunto de
ADNasa Purelink	ThermoFisher Scientific	12185010A	en columna Digestión de ADN
Dynamag-2	Imán ThermoFisher Scientific	12321D	para usar con dynabeads
Reactivo de tinción azul GelCode Tinción	de gel compatible con espectrometría de masas	ThermoFisher Scientific	24592
Pierce ECL Sustrato de Western Blotting	ThermoFisher Scientific	32106	para uso en Western blot
Kit de transcripción inversa de ADNc de alta capacidad	ThermoFisher Scientific	4368813	para su uso en el análisis de la expresión génica
Proflex Sistema de PCR de 32 pocillos Proflex 3 x 32 pocillos	PCR	ThermoFisher Scientific
4484073 membrana de transferencia de PVDF	ThermoFisher Scientific	88520	para Western blot
Power Up Mezcla maestra SYBR	ThermoFisher Scientific	A25778	para análisis de qPCR
RNAlater	ThermoFisher Scientific	AM7020	solución para el almacenamiento de tejidos antes del aislamiento del ARN
Novex 4-20% Gel de tris glicina	ThermoFisher Scientific	XP04205BOX	Gel de proteínas prefabricado
Anti-Queratina 8 anticuerpo (TS1)	ThermoFisher Scientific	MA514428	para la detección de Western blot de K8
Anti-Vimentina	ThermoFisher Scientific	MA511883	para la detección de Western blot de vimentina
Tampón de transferencia de tris glicina (25x)	ThermoFisher Scientific	LC3675	para la transferencia húmeda de geles de proteínas
2x Tampón de muestras SDS	ThermoFisher Scientific	LC2676	para la preparación muestras de gel de proteínas
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)	ThermoFisher Scientific	LC26755	para correr geles de proteínas Cuentas de
lisado - Matrix D	MP Biomedicals	116913100	Perlas de lisis y tubos de matriz para la disrupción de tejidos y la extracción de ARN
Perlas de lisado - Matrix SS	MP Biomedicals	116921100	Perlas de lisis y tubos de matriz para la disrupción de tejidos y la extracción de proteínas
Espectrofotómetro NanoDrop Lite	ThermoFisher Scientific	ND-LITE	medición de proteínas y ácidos nucleicos
Homogeneizador Precellys 24	Bertin Instruments	EQ03119	Homogeneizador de tejidos automatizado

Sistema de