Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att utsätta gnagare för elektronisk cigarettånga (E-ånga) och cigarettrök. Exponeringskammare är konstruerade genom att modifiera anestesiekamrar med ett automatiserat pumpsystem som levererar E-ånga eller cigarettrök till gnagare. Detta system kan enkelt modifieras för att rymma många experimentella slutpunkter.
Abstract
Elektroniska cigaretter (E- cigaretter ) används i stor utsträckning och växer i popularitet. Det beräknas att mer än 9 miljoner vuxna använder dem regelbundet. De potentiella negativa hälsoeffekterna av exponering för elektronisk cigarettånga (E-ånga) är dåligt definierade. Medan flera djurmodeller av E- vapor-exponering har utvecklats exponerar få modeller gnagare till kliniskt relevanta mängder nikotin och gör direkta jämförelser med cigarettrök inom samma exponeringssystem. Här presenterar vi en metod för konstruktion och drift av en E- dampkammare och cigarettrökkammare. Kamrarna är konstruerade genom att utrusta anestesikamrar med ett datorstyrt pumpsystem som levererar konsekventa mängder av EIze: 14px; "> - ånga eller cigarettrök till gnagare. Nikotin exponering mäts indirekt genom att kvantifiera serumkotininnivåer före och efter exponering. Detta exponeringssystem kan modifieras för att rymma olika typer av e- cigaretter och tobaks cigaretter och kan Användas för att jämföra effekterna av E- vapor och cigarettrök in vivo .
Introduction
Sedan de kommit in på den amerikanska marknaden 2004 har elektroniska cigaretter (e-cigaretter) expanderat till en miljard dollarindustri, och det beräknas att nästan 9 miljoner vuxna använder dem regelbundet 1 . Under 2014 och 2015 hade flera gymnasieelever använt e-cigaretter än konventionella cigaretter 2 . Det växande antalet användare av e-cigaretter har skapat en forskningsinsats för att utvärdera deras potentiella negativa hälsoeffekter.
E-cigaretter genererar en ånga (kallad "E-damp") genom upphettning av en viskös lösning som vanligen innehåller en blandning av vatten, polyetylenglykol eller vegetabiliskt glycerin, nikotin och smakämnen 3 , 4 . Det har visats att E-ånga innehåller flera skadliga föreningar, inklusive reaktiva syrearter (ROS), nikotin, olika aldehyder och polycykliska aromatiska kolväten 5 ,6. Många av dessa föreningar bildas under förångningsprocessen av E-vätska före inandning 7 . Speciellt är flera av dessa skadliga föreningar också närvarande i cigarettrök, vilket ger upphov till oro för att användningen av E-cigaretter kan ha liknande negativa hälsoeffekter 7 .
Det finns liten konsensus om e-cigaretternas hälsoeffekter. För att ta itu med detta har flera djurmodeller av E-ångexponering utvecklats ( Tabell 1 ). Dessa modeller använder en mängd olika metoder som hel-kropps E-ångexponering och mekanisk ventilation. Medan nuvarande modeller har givit insiktsfulla data gör några få direkta jämförelser med cigarettrök inom samma exponeringssystem ( tabell 1 ). Dessutom, medan flera mänskliga studier har visat att användarna av E-cigaretter och cigarettrökare har serumkotininnivåer mellan 30-200 ng / ml, faller många modeller av exponering för e-ånga och cigarettrök utIde detta intervall 8 , 9 , 10 , 11 , 12 .
Här presenteras en metod för att jämföra effekterna av cigarettrök och E-ångexponering in vivo som ger serumkotininnivåer som liknar humana studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Följande protokoll har utförts under ledning och godkännande av University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
1. Elektrisk cigarett-ångkammarmontering
OBS: Komplett kammare ska placeras i en avluftningsluft under användning. Kammaren här inrymdes i en temperaturstyrd och filtrerad laboratoriemiljö. Undersökare kan välja att övervaka sådana aspekter av systemet för att säkerställa att luftkvaliteten är jämn. Som ett alternativ kan täckning av bildskärmarna med en metallbur hindra gnagare att manipulera samtidigt som monitorn kan prova den inre kammarmiljön.
- Skaffa en anestesikammare med lufttätt avtagbart lock med volymen 20 L.
- Genom att använda en jigsåg som är försedd med ett blad som är lämpligt för att skära materialet, skär ett hål på 10,2 cm i kammarens lock ca 7,6 cm från bakkant avkammare.
- Sätt in den justerbara ventilen i hålet och fäst på plats med eventuellt lim.
OBSERVERA: Se till att limkåpan inte är tillgänglig för gnagare i kammaren, eftersom de kan tugga kåpan. För att förhindra detta problem, applicera caulk på utsidan av kammarmuren för att montera ventilen. - Klipp silikonrör i två 15 cm-segment och fäst ändar på vardera sidan av en T-kontakt.
OBS: Silikonrör har potential att reagera med vissa komponenter i e-ånga eller cigarettrök. Sålunda kan utredare överväga att använda icke-reaktiva rör. - Träng båda silikonrören genom förmade hål nära kammarlockets framsida så att T-kontakten är inuti kammaren. Se till att slangen är fastsatt på locket med antingen limkabel eller elektriskt band.
- Anslut de fria ändarna av silikonröret till utgångsändarna på två mikroluftpumpar. Pumparna ska monteras på kammarens lock med dubbel-Sidigt tejp eller caulk.
OBS: Längden på slangen som är ansluten till pumpens utgångsdel ska vara kort för att begränsa mängden ånguppsamling på rörets insida under användningen. - Med ett nytt silikonrör fäster du ena änden på ingångssidan av en av luftpumparna (Pump A i Figur 1 ) och skär det här röret till ca 4 cm i längd. Det är här den elektroniska cigaretten kommer att sättas in under kammaranvändningen. Se till att rörets diameter gör det möjligt att passa snyggt runt i slutet av e-cig.
- Med ett nytt silikonrör fäster du ena änden på den andra luftpumpens insida sida (Pump B i Figur 1 ). Denna pump kommer introducera rumsluft i kammaren. Som sådan måste rörets ände placeras utanför avloppsugan. Längden på detta rör är inte kritisk, men bör vara så kort som möjligt för att begränsa luftflödesmotståndet.
- Inuti kammaren fäster två små krokar med dubbelsidigt lim för att hålla oxygEn och kolmonoxid gasmonitorer.
Figur 1. Schematisk av elektronisk cigarettångkammare.
Kammaren är inrymd i avloppsugn (ej visad). Rumsluftpumpen (Pump B) introducerar rumsluft från utsidan av avloppsugan i kammaren kontinuerligt vid 2 l / min. E-cig-pumpen (Pump A) puffar 133 ml E-ånga över 4 s, med ett 30 s rastintervall. E-ång- och rumsluftblandning före pumpning i kammaren. Gasmonitorer mäter kontinuerligt kolmonoxid (CO) och syre (O2) koncentrationer inuti kammaren. E-ånga är passivt utmatad genom ventilation i avloppsugan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Cigarettrökkammarmontering
OBS: Praktiskt taget alla märken oF-cigarett kan användas med detta system, men standardiserade forsknings cigaretter som University of Kentucky 1R6F Research Cigarette är kostnadseffektiva, pålitliga och bäst för denna applikation.
- Följ steg 1.1 - 1.6, och steg 1.9.
- Med ett nytt silikonrör fäster du ena änden på cigarettbelysningsanordningen och den andra änden till ingångssidan av luftpumpen (Pump A i Figur 2 ). Cigarettbelysningsanordningen ska placeras inuti spishällen och utanför kammaren under användning.
Obs! Konstruktionen av cigarettbelysningsanordningen kräver kunskap om metalltillverkning och elteknik. Även om en steg-för-steg guide till konstruktion inte kommer att ges här, se kompletterande material för planer. - Fäst en ände med den andra luftpumpen (Pump B i Figur 2 ) med ett nytt silikonrör. Denna pump kommer att introducera rumsluft i kammaren, så måste rörets ände placeras utanför avloppsugan. >
- Skär flera 5 mm breda vertikala slitsar i kammarens främre vägg och montera en datorfläkt på utsidan av kammaren så att den täcker denna öppning. Se till att fläktens framsida är vänd mot kammaren så att fläkten blåser luft in i kammaren genom denna öppning.
Figur 2. Schematisk av cigarettrökkammaren.
Rumsluftpumpen (Pump B) introducerar rumsluft från utsidan av avloppsugan i kammaren kontinuerligt vid 2 l / min. Pump A drar på tänd cigarett i 40 s med hastighet 2 L / min och 20 s senare evakuerar datorfläkten kammaren under 3 min. Rök och rumsluftblandning innan pumpning i kammaren. Gasmonitorer mäter kontinuerligt kolmonoxid (CO) och syre (O2) kammakoncentrationer. Rök är uttömt genom ventilation i avloppsugan.Ftp_upload / 55672 / 55672fig2large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Microcontroller Assembly och Software
- Styr pumpsystemet hos E-cigarettångkammaren och cigarettrökkammaren med separata mikrokontroller. Ladda ner mikrokontrollerprogramvaran och ladda upp operativkoderna som finns i S upplementary Materials . Den elektroniska cigarettångkoden kommer att köra rumsluftpumpen kontinuerligt och aktivera E-cigarettpumpen i en varaktighet på 4 s var 30: e sekund. Cigarettrökkoden kommer att köra rumsluftpumpen kontinuerligt, aktivera cigarettpumpen i 40 s och aktivera datorfläkten 20 s efter att cigarettpumpen har stoppats. Fläkten stängs av efter att ha körts i 3 minuter.
Anm .: Tidpunkten för pumparna och fläkten kan justeras efter behov. Referens tillverkarens instruktioner om hur man laddar upp relevanta koder till mikrokontroller. - Att monteraLe mikrokontroller, koppla sladdtråd, dioder, resistorer och kondensatorer till brödbrädan enligt bild 3 och fäst alligator-clipskablar till motsvarande luftpumpar (och datorfläkt för cigarettrökkammare). Håll mikrokontrollen utanför avluftskåpan om möjligt.
Figur 3. Schematisk av mikrokontroller.
Schematisk av mikrokontroller och brödbräda för att styra tidpunkten för luftpumpar och fläktar. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Djur
- Använd vuxna råttor som väger 450-520 g.
- Grupprotter beroende på exponeringstyp ( t.ex. elektronisk cigarett, cigarettrök, rumsluft pumpas in i kammaren).
- Vid denna tid prIor för exponering, samla 500 μL blod i EDTA-belagda rör från svansvenen med hjälp av sprutan för att mäta baslinjär serumkotininkoncentration.
- Spinn ner blodproverna vid 20 000 xg i 30 minuter vid 4 ˚C och samla serum. Se till att prover kyls på is under hela processen.
- Efter tillverkarens protokoll samlades analysen för cotinin i serumproverna. Prov kan också lagras vid -80 ˚C för senare användning.
5. Användning av den elektroniska cigarettkammaren
- Rengör kammarens insida med 70% etanol, sedan med avjoniserat vatten och låt lufttorka tills kammaren är helt torr (eller ca 30 min).
- Kalibrera gasmonitorer och montera hela bildskärmen på väggen inuti kammaren.
- Placera råttor inuti kammaren. Observera att upp till tre djur kan exponeras samtidigt.
- Se till att e-cigaretten är fulladdat med tillräcklig E-vätska och sätt in E-cigarettenIn i inloppsröret. Det är viktigt att se till att E-cigarettbatteriet och E-vätskenivåerna är tillräckliga under hela 90-minuters exponeringen.
- Sätt på pumparna och starta timern.
- Vid exponering observera gasmonitorerna för att säkerställa att kammaren innehåller> 20% O 2 och 0 ppm CO.
Obs! Om syrnivån faller kan kammaren inte vara väl ventilerad eller syremonitorn kanske inte är korrekt kalibrerad. - När exponeringstiden har nått 90 minuter, ta bort e-cigaretten och fortsätt att köra gaspumparna för att ventilera den återstående ångan. Dessutom kan kammarens överdel lyftas för att påskynda ventilationen.
- När ångan har rensat, ta av råttorna och rengör kammaren.
- Samla 500 μl blod från svansven från varje råtta ca 1 h efter exponering vid avslutandet av försöksprotokollet.
- Följ steg 4.4 - 4.5 för att isolera serum och analys för cotinin.
- Följ steg 5.1 - 5.3.
- Sätt cigaretten i cigarettbelysningsanordningen, med cigarettänden mot värmeelementen.
- Sätt på cigarettbelysningsanordningen tills cigarettstödet börjar smoldera (ca 5 s).
- När cigaretten är tänd, sätt på pumpsystemet, starta timer och observera cigarettbränningen för att slutföra (ca 40 s).
- När cigaretten har bränt, ta försiktigt bort den använda cigaretten från cigarettbelysningsanordningen med tång.
- Se till att CO-nivåerna inte stiger över 1000 ppm och O 2- nivåerna inte faller under 20%. Datorfläktens timing och varaktighet är avgörande för att förhindra ackumulering av kolmonoxid.
- Efter 4 min stäng pumpen av och återgå till steg 6.2 tills råttor utsätts för tobaksrök i 90 minuter (eller cirka 23 cigaretter).
OBS: Kolmonoxidnivåer 4 min efter cigarettburetNing bör falla under 400 ppm, annars kan kolmonoxid börja ackumuleras i kammaren. - När exponeringen är klar fortsätt att lämna pumpsystemet för att ventilera kvarvarande rök. När kolmonoxid faller under 100 ppm, avlägsna råttor från kammaren. Detta bör ta 5-10 min.
- Ta bort råttor och rengör kammaren.
- Samla 500 μL blod från svansvenen ungefär 1 timme efter exponering vid avslutning av försöksprotokollet som med E-cigaretterna.
- Följ steg 4.4 - 4.5 för att isolera serum och analys för cotinin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolmonoxid och syreövervakning
Syrekoncentrationer föll inte under 20% vid e-ångexponering och CO-koncentrationer förblev odetekterbara under hela exponeringen. Gasmonitorer vid exponering för cigarettrök indikerade att syrekoncentrationen var över 20%. Kolmonoxidkoncentrationerna översteg inte 1000 ppm ( Figur 4 ).
Figur 4: Kolmonoxidkoncentrationer i cigarettrökkammare. Kolmonoxidkoncentrationen registrerades var 30: e s under introduktionen av rök från 1R6F-cigaretter. Resultat som visas är medelvärden från 3 på varandra följande 4 min cykler. Kolmonoxidkoncentrationerna översteg inte 1000 ppm. Cigaretten brinner till slutförandet under 40 s, och fläkten är aktiveradD 20 s senare ( dvs fläkten är aktiverad 1 min efter cigarettändning).
Pre- och postexponering serumkotinin
Föreexponering och 1 h efterkonsponering av serumkotinin för E-ånggrupp (n = 3) var 4,2 ± 0,4 ng / ml respektive 171,6 ± 20,5 ng / ml. Föreexponering och 1 h efter klockin för serumexponering för cigarettrökgruppen (n = 3) var 3,9 ± 0,3 ng / ml respektive 98,8 ± 2,1 ng / ml ( Figur 5 ).
Figur 5: Serumnivåer av kotinin efter cigarettrök eller elektronisk cigarettångaxponering. Serumkotinin mättes innan protokollinitiering och 1 h efter en exponeringssession på 90 min. Föreexponering och 1 h post-exponering serumkotinin för e-ånggrupp var 4,2 ± 0,4 ng / ml aNd 171,6 ± 20,5 ng / ml. Föreexponering och 1 h efterkonsponering av serumkotinin för cigarettrökgruppen var 3,9 ± 0,3 ng / ml respektive 98,8 ± 2,1 ng / ml. Skillnaden mellan serumkotininkoncentrationer före och efter exponering var statistiskt signifikant. * P <0,05.
Figur 6: Elektronisk cigarettdammkammare och cigarettrökkammare. Bild av den elektroniska cigarettångan (höger) och cigarettrökkammaren (vänster) i avloppsugan. Röda lådor innehåller mikrokontroller. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Djurmodell | <Stark> Elektronisk cigarett | Tobaks cigarett | Referens | |||
| Exponeringsmetod | Modellorganisme | Märke (nikotin) | Cotinin ng / mL (serum, [urin]) | varumärke | Cotinin ng / mL (serum, [urin]) | |
| Hel kroppsexponering | C57BL / 6J möss | Joytech 510-T (1,8%) | 62,3 ± 3,3, [892,5 ± 234] | N / A | N / A | McGrath-Morrow |
| Mekanisk ventilator | BALB / cJ-möss | Inte rapporterat | [400-500] | Inte rapporterat | [500 - 800] | Ponzoni |
| Hel kroppsexponering | CD-1 möss | Multipel * (0,6-24%) | Inte rapporterat | N /en | N / A | Hwang |
| Hel kroppsexponering | Wistar albino råttor | Ego T (0,9%) | Inte rapporterat | Inte rapporterat | Inte rapporterat | Salturk |
| Hel kroppsexponering | C57BL / 6 möss | NJOY (1,8%) | 267 ± 17 | N / A | N / A | Sussan |
| Hel kroppsexponering | C57BL / 6J möss | CoolCart, Damp Titan | 500 ± 10 | 3R4F Referenscigaretter | 76 ± 7,6 | Husari |
| * Xtreme Vaping, Vapure, Vape Addict Juice, Grimm Creations, Green Smart Living, Free Masons Elixer | ||||||
Tabell 1: Egenskaper hos elektroniska cigarett exponeringsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskrivs en metod för konstruktion av kamrar som exponerar gnagare för E-ånga och cigarettrök på ett kontrollerat sätt ( Figur 6 ). Konstruktion av E-cigarettkammaren är relativt enkel och billig jämfört med kommersiella exponeringssystem 14 , 15 , 16 . De delar och verktyg som krävs för att bygga kammaren är lättillgängliga från kommersiella leverantörer online. På liknande sätt är konstruktionen av cigarettrökkammaren relativt enkel med undantag för cigarettbelysningsanordningen som måste tillverkas (se kompletterande material för planer).
När kamrarna är konstruerade kalibrerar ett kritiskt steg i exponeringssystemet kamrarna för att exponera gnagarna till den önskade mängden nikotin. I både E-cigarettkammaren och cigarettkammaren justeras mängden total exponering tIme är kanske den enklaste metoden för att öka eller minska nikotin exponeringen. Ökad blödningstid i E-cigarettexponeringssystemet kan öka nikotindosen, men drastången från E-cigaretten har under en längre tid visat sig öka nivåerna av ROS, aldehyder och andra farliga föreningar och kan Eller kanske inte återspeglar en e-cigarettanvändares 5 vanliga vanor 5 . Puffens varaktighet och total exponeringstid kan justeras genom att modifiera koden som laddas upp till mikrokontroller. Det bör också noteras att koncentrationen av nikotin i E-cigarettlösningar, liksom spänningen hos E-cigarettvärmeelementet, kan variera avsevärt och bör beaktas vid kalibrering av systemet.
En av de största fördelarna med detta exponeringssystem är dess mångsidighet. Nästan alla märken av e-cig eller e-cig-lösning kan användas med detta system. Detta är en särskilt användbar feaMed tanke på att e-cigarettmarknaden nu omfattar över 400 märken och tusentals e-cigarettlösningar 13 . Dessutom är exponeringssystemet kompatibelt med flera experimentella ändpunkter som möjliggör effekter av E-cigarett på olika organsystem och sjukdomsprocesser som ska studeras. Vi erkänner också att det finns flera begränsningar för detta exponeringsparadigm, såsom den metod genom vilken djuren utsätts för ångan. E-cigarettanvändare inhalerar direkt E-ånga medan man i detta paradigm passerar gnagarna passivt. Dessutom kommer gnagarena även sannolikt att absorbera föreningar i ångan eller röken genom andra vägar ( dvs. direkt absorption av huden och förtäring vid förtäring). Men vi tror att fördelarna med exponeringssystemet är mycket större än gränserna.
Sammantaget ger detta exponeringsparadigm konsekvent och kliniskt relevant exponering för E-ånga och cigarettrök och kan hjälpa tillStödja forskningsinsatsen för att fastställa skadliga hälsoeffekter av e-cigarett och cigarettrök.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning gjordes av Aortic Research Grant (University of Michigan) till Dr Eliason. Författarna skulle också vilja erkänna Nick Scott vid University of Michigan Plant Operations Sign and Graphics Department för att hjälpa till med design och montering av cigarettbelysningsenheten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| blu PLUS Rechargeable Kit | blu eCigs | N/A | |
| 1R6F Reference Cigarettes | Center for Tob Ref Prod UK | N/A | |
| Lexan Anesthesia Chamber 20 L | Jorgensen Laboratories | JOR265 | |
| Arduino UNO | Arduino | 2877 | |
| Diode Rectifier - 1 A; 50 V | Spark Fun | COM-08589 | |
| Resistor 10 KOhm 1/6th W PTH - 20 pack | Spark Fun | COM-11508 | |
| Electrolytic Decoupling Capacitors - 100 uF/25 V | Spark Fun | COM-00096 | |
| Solderless Plug-in BreadBoard | BusBoard Prototype Systems | BB400 | |
| Alligator-Clip Wires | BusBoard Prototype Systems | CA-M-20 | |
| ZipWire | BusBoard Prototype Systems | ZW-MM-10 | |
| Standard Fan 80 ST2 | Cooler Master | R4-S8R-20AK-GP | |
| ARIC 4" adjustable vent | Bestlouver | N/A | |
| ToxiPro Carbon Monoxide (CO) Monitor | Honeywell Analytics | 54-00-10316 | |
| ToxiPro Oxygen (O2) Monitor | Honeywell Analytics | 54-45-90-VD | |
| ToxiPro IQ Express Docking Station | Honeywell/Sperian Biosystems | 54-46-9100 | |
| Command Wall Hook Small Wire 6-Pack | 3M | N/A | |
| Micro Water/Air Pump | Xiamen Conjoin Electronics | CJWP40-A12A1 | |
| 1/4" Silicon Tubing | NewAge | 2801470-100 | |
| T Connector | Bel-Art Scienceware | F196060000 | |
| Plastic Whole Blood tube with spray-coated K2EDTA | Becton, Dickinson and Company | 367841 | |
| Cotinine ELISA kit | Calbiotech | CO096D |
References
- Schoenborn, C. A., Gindi, R. M. Electronic Cigarette Use Among Adults: United States, 2014 Key findings. NCHS. , (2014).
- Singh, T. Tobacco Use Among Middle and High School Students - United States, 2011-2015. MMWR. 65 (14), 361-367 (2016).
- Flora, J. W. Characterization of potential impurities and degradation products in electronic cigarette formulations and aerosols. Regul. Toxicol. Pharmacol: RTP. 74, 1-11 (2016).
- Tierney, P. A., Karpinski, C. D., Brown, J. E., Luo, W., Pankow, J. F. Flavour chemicals in electronic cigarette fluids. Tob. Control. , (2015).
- Sleiman, M. Emissions from Electronic Cigarettes: Key Parameters Affecting the Release of Harmful Chemicals. Environ. Sci. Technol. 50 (17), 9644-9651 (2016).
- Hwang, J. H. Electronic cigarette inhalation alters innate immunity and airway cytokines while increasing the virulence of colonizing bacteria. Int J Mol Med (Berlin, Germany). 94 (6), 667-679 (2016).
- Cheng, T.
- Etter, J. -F. A longitudinal study of cotinine in long-term daily users of e-cigarettes. Drug Alcohol Depend. 160, 218-221 (2016).
- Etter, J. -F. Levels of saliva cotinine in electronic cigarette users. Addiction. 109 (5), 825-829 (2014).
- Marsot, A., Simon, N. Nicotine and Cotinine Levels With Electronic Cigarette: A Review. Int. J. Toxicol. 35 (2), 179-185 (2016).
- Flouris, A. D. Acute impact of active and passive electronic cigarette smoking on serum cotinine and lung function. Inhal. Toxicol. 25 (2), 91-101 (2013).
- Bot, M. Plasma cotinine levels in cigarette smokers: impact of mental health and other correlates. Eur Addict Res. 20 (4), 183-191 (2014).
- Zhu, S. -H. Four hundred and sixty brands of e-cigarettes and counting: implications for product regulation. Tob. Control. 23, Suppl 3. 3-9 (2014).
- CH TECHNOLOGIES. Single Cigarette Smoking Machine SCSM-STEP. , Available from: http://chtechusa.com/products_tag_smoke_single-cigarette-CSM-SCSM.php (2016).
- SCIREQ. inExpose. , Available from: http://www.scireq.com/inexpose (2016).
- TSE Systems. Cigarette Smoke Generators. , Available from: http://www.tse-systems.com/products/inhalation/aerosol-vapor-generation/cigarette-smoke.htm (2016).
