A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.
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Artículo de método
Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
Las poblaciones de células heterogéneas, ya sea de tejidos sanos o malignos, pueden contener una población de células caracterizada por una capacidad diferencial para expulsar el colorante de enlace de ADN Hoechst 33342. Esta "población lateral" de células puede identificarse usando métodos de citometría de flujo después de Hoechst 33342 El colorante es excitado por un láser ultravioleta (UV). La población lateral de muchos tipos de células contiene células progenitoras o similares. Sin embargo, no todos los tipos de células tienen una población lateral identificable. Danio rerio , pez cebra, tienen un robusto modelo in vivo de células T de leucemia linfoblástica aguda (T-ALL), pero si estas T-ALL de pez cebra tienen una población lateral es desconocida. El método descrito aquí describe cómo aislar las células de la población lateral en el pez cebra T-ALL. Para empezar, el T-ALL en el pez cebra se genera a través de la microinyección de los plásmidos tol2 en embriones de una sola fase celular. Una vez que los tumores han crecido a una etapa en la que se expanden en más de la mitad de los aniEl cuerpo de mal, las células T-ALL se puede cosechar. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y se examinaron por citometría de flujo para células de población lateral. Este método tiene amplias aplicaciones en el pez cebra T-ALL investigación. Si bien no se conocen marcadores de superficie celular en el pez cebra que confirman si estas células de población lateral son células madre de cáncer como, ensayos in vivo de trasplante funcionales son posibles. Además, transcriptómica sola célula podrían aplicarse para identificar las características genéticas de estas células de población lateral.
Introducción
El ensayo población lado capitaliza en la capacidad mejorada de ciertas células dentro de un tejido a flujo de salida el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 debido a los altos niveles de la casete de unión a ATP (ABC) transportador de proteínas en la membrana celular. Las células que eflujo el colorante Hoechst 33342 se pueden identificar utilizando análisis de citometría de flujo dual de longitud de onda después de que el colorante es excitado por un láser UV. Este ensayo se utilizó primero para identificar células murinas madre hematopoyéticas (HSCs) 1, pero desde entonces se ha usado para identificar poblaciones de células madre / progen....
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Protocolo
Todos los procedimientos con el pez cebra han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Chicago. La Universidad de Chicago está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).
1. Generación y aislamiento de la etiqueta fluorescente T-todas las células en el pez cebra
- Microinyección en embriones de pez cebra singénicos
- El uso de kits disponibles en el mercado, aislar rag2 circular: c-myc y rag2: proteína verde fluorescente (rag2: GFP) de ADN plásmido que contiene repeticiones t....
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Resultados
Para generar eficientemente fluorescentes myc inducida por T-todos los tumores en el pez cebra, los constructos de ADN circular flanqueadas por sitios transposasa Tol2 pueden co-inyectados con ARN Tol2. Estudios anteriores de la inyección de ADN linealizado en embriones de pez cebra reportan una tasa de transgénesis 5% 8. Con el protocolo ajustarse para incluir transgénesis Tol2 mediada, las tasas de transgénesis que van desde 10-44% pueden observarse (Tab.......
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Discusión
El ensayo de población lateral es altamente sensible; Por lo tanto, pequeños cambios en el protocolo pueden resultar en una dificultad en la detección de células de población lateral. En primer lugar, la temperatura durante la etapa de tinción es específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, el ensayo de población lateral se realiza típicamente a 37ºC. Cuando las células T-ALL de pez cebra se incubaron a 37ºC, muchas de las células murieron, lo que hizo que esta temperatura de incubación f.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Chicago Consejo de la Mujer, el Fondo caso será Wendy, y la Universidad de Chicago Comprehensive Cancer Center Proyectos financiados (P30 CA014599). Nos gustaría dar las gracias a la Citometría de Flujo Core de la Universidad de Chicago, por su ayuda en la creación de este experimento, y así como otros miembros del laboratorio de Jong, en especial Leslie Pedraza y Sean McConnell.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Pez cebra singénico (CG2) | Véase Mizgireuv et al., 2006 | ||
| rag2:c-myc plásmido | Langenau Laboratory | ||
| rag2:GFP construido en el promotor de Jong Lab | rag2 del | ||
| plásmido | Chien Enzima | ||
| restricción NotI-HF | laboratorio New England Bio-Labs Inc. | R3189S | 500 unidades en 25 y micro; L |
| mMessage Machine SP6 Kit de transcripción | Ambion | Thermo Fisher Scientific - AM1340 | 25 reacciones |
| QIAGEN Plasmid Midi Kit | Qiagen, Inc. | 12643 | |
| Microscopio SteREO Discovery V8 | Microscopía Carl Zeiss | 495015-0008-000 | |
| Microinyector digital | Tritech Research | MINJ-D | |
| Portaagujas de brazo recto de latón | Tritech Research | MINJ-4 | |
| Base magnética y soporte | Tritech Research | MINJ-HBMB | |
| Micromanipulador | Narishige International | MN153 | |
| Capilares de vidrio | Sutter Instrument Co. | B100-50-10 | 10 cm sin filamento |
| Tirador de micropipetas Flaming/Brown | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Puntas de pipeta con microcargador | Eppendorf North America Inc. | ||
| Solución de rojo de fenol | Sigma Life Science | P0290 | 0,5% de concentración 100 mL |
| Pipetas de transferencia de plástico | Fisherbrand | 137119D | graduada Bulbo de 7,5 mL |
| Metanosulfonato de tricaína (MS-222) | Western Chemical, Inc. | Fisher Scientific - NC0342409 | 100 g |
| Suero fetal bovino (FBS) | HyClone Laboratories, Inc. | Fisher Scientific - SH3007103 | 500 mL |
| solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco by Life Technologies | 1001-023 | pH 7.4 (1x) - 500 mL |
| Sal sódica de heparina | Sigma-Aldrich | 2106 | 15 - 300 viales unitarios |
| 40 µ Filtro de malla m | Falcon Corning Marca | 352340 | Caja de 50 |
| Trypan azul | Sigma Life Science | T8154 | 20 mL - Solución (0.4%) |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 10 mL |
| Verapamilo | Sigma Life Science | V4629 | 1 g |
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma Life Science | D8418 | 100 mL |
| Propidium Iodide | Life Technologies | P3566 | 10 mL |
| FACSAria Clasificador de células de fusión | BD Biosciences | ||
| BD FACSDiva 8.0.1 | BD Biosciences | ||
| FlowJo v10.2 | FlowJo, LLC |
Referencias
- Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo. J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).
- Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S.
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Reimpresiones y permisos
