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Aislamiento de la población lateral en la leucemia linfoblástica aguda inducida por linfocitos T de Myc en peces cebra

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DOI:

10.3791/55711

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4 de mayo de 2017

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Section of Hematology-Oncology, The University of Chicago, 2Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

En este artículo

Resumen

A continuación, describimos una técnica para aislar las células de población lateral de un modelo de pez cebra de células T myc inducida por la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T). Este ensayo población lado es muy sensible y se describe, por pez cebra T-ALL, pero puede ser aplicable a otros tipos de células de pez cebra malignas y no malignas.

Resumen

Las poblaciones de células heterogéneas, ya sea de tejidos sanos o malignos, pueden contener una población de células caracterizada por una capacidad diferencial para expulsar el colorante de enlace de ADN Hoechst 33342. Esta "población lateral" de células puede identificarse usando métodos de citometría de flujo después de Hoechst 33342 El colorante es excitado por un láser ultravioleta (UV). La población lateral de muchos tipos de células contiene células progenitoras o similares. Sin embargo, no todos los tipos de células tienen una población lateral identificable. Danio rerio , pez cebra, tienen un robusto modelo in vivo de células T de leucemia linfoblástica aguda (T-ALL), pero si estas T-ALL de pez cebra tienen una población lateral es desconocida. El método descrito aquí describe cómo aislar las células de la población lateral en el pez cebra T-ALL. Para empezar, el T-ALL en el pez cebra se genera a través de la microinyección de los plásmidos tol2 en embriones de una sola fase celular. Una vez que los tumores han crecido a una etapa en la que se expanden en más de la mitad de los aniEl cuerpo de mal, las células T-ALL se puede cosechar. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 y se examinaron por citometría de flujo para células de población lateral. Este método tiene amplias aplicaciones en el pez cebra T-ALL investigación. Si bien no se conocen marcadores de superficie celular en el pez cebra que confirman si estas células de población lateral son células madre de cáncer como, ensayos in vivo de trasplante funcionales son posibles. Además, transcriptómica sola célula podrían aplicarse para identificar las características genéticas de estas células de población lateral.

Introducción

El ensayo población lado capitaliza en la capacidad mejorada de ciertas células dentro de un tejido a flujo de salida el colorante de unión a ADN Hoechst 33342 debido a los altos niveles de la casete de unión a ATP (ABC) transportador de proteínas en la membrana celular. Las células que eflujo el colorante Hoechst 33342 se pueden identificar utilizando análisis de citometría de flujo dual de longitud de onda después de que el colorante es excitado por un láser UV. Este ensayo se utilizó primero para identificar células murinas madre hematopoyéticas (HSCs) 1, pero desde entonces se ha usado para identificar poblaciones de células madre / progenitoras en muchos tejidos y tipos de cáncer (revisado en la referencia 2). Sin embargo, no todas las poblaciones de células tienen una población lado, y no todas las poblaciones laterales están enriquecidas en células madre / progenitoras.

El pez cebra es un poderoso sistema modelo para el estudio genético de los vertebrados cáncer humano 3, 4, con una serie de ventajas sobre mo tradicional murinadels de cáncer. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y son ópticamente transparentes, lo que facilita la transgénesis y la observación in vivo de procesos patológicos, incluyendo la iniciación y progresión del cáncer. Hasta la fecha, el ensayo población lado para detectar potenciales células madre o progenitoras sólo se ha aplicado a la médula renal en el pez cebra para identificar HSCs, y no a cualquier modelos de cáncer de pez cebra 5, 6.

El modelo de pez cebra de las células T de la leucemia linfoblástica aguda (LLA-T) es morfológica y genéticamente similares a humano T-ALL 7, 8, 11. T-ALL es una neoplasia agresiva que, en los seres humanos, representa el 10-15% de los pediátricos y el 25% de los casos de LLA de adultos 9. Mientras que el tratamiento de la LLA-T ha mejorado, la recaída es todavía común y se asocia con un mal pronóstico. T-ALL tumores son hétérogèneY contienen muchas subpoblaciones de células tumorales diferentes, incluyendo células iniciadoras de leucemia (LICs). Los LIC se definen por su capacidad para regenerar el tumor entero a partir de una sola célula y la frecuencia de LIC dentro de una población de células tumorales se puede calcular trasplantando dosis de células variables en receptores a través de un ensayo de trasplante de dilución limitante (LDA). Mientras que los experimentos de LDA se han realizado en el pez cebra para calcular la frecuencia de los LIC 8 , 10 , 11 , esta determinación se hace en retrospectiva y no permite el aislamiento prospectivo de LICs. Por lo tanto, falta un método para aislar prospectivamente una población enriquecida para la actividad de células madre de cáncer. Identificar y aislar las células de la población lateral de pez cebra T-ALLs es el primer paso para abordar esta deficiencia.

El protocolo presentado aquí describe cómo generar eficientemente tumores T-ALL en zebrafish la utilización de transgénesis Tol2 mediada, cosechar las Todas Las células tumorales, y manchar con Hoechst 33342 para identificar la población lado de las células. Future en experimentos in vivo con el pez cebra T-ALL podría incluir si las células de población lateral están enriquecidos para los PRB o tienen otras propiedades stem- o progenitoras-similares.

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Protocolo

Todos los procedimientos con el pez cebra han sido aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Chicago. La Universidad de Chicago está acreditada por la Asociación para la Evaluación y Acreditación de Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC).

1. Generación y aislamiento de la etiqueta fluorescente T-todas las células en el pez cebra

  1. Microinyección en embriones de pez cebra singénicos
    1. El uso de kits disponibles en el mercado, aislar rag2 circular: c-myc y rag2: proteína verde fluorescente (rag2: GFP) de ADN plásmido que contiene repeticiones terminales invertidas reconocido por transposasa Tol2 (véase la Tabla de Materiales para la fuente de ADN de plásmido) 12 y eluir el ADN en agua estéril.
      NOTA: GFP se utiliza en este estudio, pero cualquier proteína fluorescente va a funcionar.
    2. Preparar pCS2-transposasa (Tol2) RNA
      1. Aislar el plásmido de ADN Tol2 usando kits disponibles comercialmente (ver tél Tabla de Materiales para la fuente de ADN plásmido) 12 y se eluye el ADN en agua estéril.
      2. Incubar 1 g de ADN Tol2 a 37 ° C durante 1 h con 5 unidades de la enzima de restricción NotI en el tampón apropiado para linealizar el plásmido. Heat-inactivar la NotI a 65 ° C durante 20 min.
      3. Transcribir el RNA Tol2 con ARN polimerasa SP6 a partir del ADN linealizado utilizando un kit de transcripción de ARN disponible comercialmente 13. Almacenar el ARN en alícuotas de un solo uso a -80 ° C.
    3. Preparar la mezcla de inyección en hielo mediante la adición de 250 ng de rag2: c-myc ADN plásmido, 250 ng de rag2: ADN del plásmido GFP, 150 ng de RNA Tol2, y 0,5 l de rojo de fenol. Ajustar el volumen a 10 l con agua libre de nucleasa.
    4. Inyectar ~ 1 nL de la mezcla de la inyección en la célula de una fase de una célula embrión de pez cebra singénico usando un microinyector y la aguja tirado de un tubo capilar de vidrio, siguiendo previamente estab8 , 14 .
      NOTA: El pez cebra singénico generado por partenogénesis 15 se utiliza aquí para eliminar la heterogeneidad genética y el rechazo inmune después del trasplante. Sin embargo, también se puede usar el pez cebra de tipo salvaje o cualquier cepa deseada.
    5. Elimine los embriones muertos, subdesarrollados o malformados a las 24 h y 48 h después de la inyección 16 .
    6. Colocar los peces inyectados en el sistema de pescado a los 6 días después de la inyección y elevarlos de acuerdo con el protocolo estándar 6 .
  2. Cribado de pez cebra inyectado y monitoreo del crecimiento tumoral
    1. A los 21 días después de la inyección, colocar una sola larva inyectada en una gota de medio embrionario en una placa de Petri y cribar la fluorescencia GFP usando un microscopio epifluorescente (banda de excitación: 470/40, banda de paso de la emisión: 525/50) 8 .
      NOTA: Las larvas de pez cebra que have integrado tanto rag2: c-myc y rag2: GFP tendrá un timo verde fluorescente (pescado positivo) y ya puede exhibir la expansión de células fluorescentes verdes malignas más allá del timo. Todos los peces con un GFP + timo se van a desarrollar una GFP + T-ALL. Las larvas que no demuestran la integración de los plásmidos no tendrá ningún células fluorescentes verdes (peces negativo).
    2. Separar el pescado negativo (basado en una falta de fluorescencia) en un tanque diferente y supervisar los peces de nuevo a los 28 y 35 días después de la inyección. A los 28 y 35 días después de la inyección, anestesiar el pescado con 0,02% tricaína tamponada (MS-222) en agua sistema de pescado antes de la selección.
    3. Colocar cada larva de pez cebra que es positivo para un timo marcado fluorescentemente o un tumor marcado con fluorescencia en un tanque individual para supervisar el crecimiento del tumor tres veces a la semana.
  3. Colección de marcado fluorescentemente T-ALL células de los peces tumor primario
    1. Preparar al menos 20 ml de suero bovino fetal inactivado por calor al 10% en solución salina tamponada con fosfato 0,9 veces (FBS / PBS).
    2. Añadir 1 ml de FBS / PBS a un vial de sal de sodio de heparina (300 unidades).
    3. Seleccione los tumores que llevan peces en más del 50% del cuerpo, o aquellos peces que tienen dificultad para comer o nadar. Sacrificar el pescado sobredosándolos con tricaína o por inmersión en agua helada. Confirme la muerte por falta de movimiento de las branquias y los latidos del corazón.
    4. Use una cuchilla de afeitar para quitar la cabeza del pez.
    5. Lave la cavidad del pez con la solución de heparina para eliminar el exceso de glóbulos rojos.
      1. Usando una pipeta, inyecte 100 μL de solución de heparina (preparada en el paso 1.3.2) en la cavidad corporal del pez. Retire todo el líquido que se derrame (contendrá células sanguíneas) y pipetee en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      2. Use una punta de pipeta fresca para lavar el cuerpo nuevamente. Realizar al menos tres lavados, o hasta que el líquido que se derrame aparezca libre de blOod
      3. Deseche todo el líquido de los lavados en los pasos 1.3.5.1 y 1.3.5.2, ya que no se utilizará en análisis adicionales.
    6. Recoger las células de leucemia.
      1. Inyectar 100 μl de FBS / PBS en la cavidad corporal del pez.
      2. Aplique presión suave al exterior del cuerpo del pez con la punta de la pipeta para exprimir / empujar hacia fuera las células tumorales.
        NOTA: Si este paso se realiza usando un microscopio de disección, las células tumorales que salen de la cavidad corporal serán evidentes.
      3. Recoja el líquido y las células de cada lavado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
      4. Repita los pasos 1.3.6.1-1.3.6.3 hasta que la mayoría de las células tumorales se recogen (normalmente 5-10 veces). Recoger todas las células tumorales en el mismo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga las células a temperatura ambiente.
    7. Mezclar las células tumorales recogidas de la etapa 1.3.6 pipeteándolas suavemente para disociar los grupos de células. Filtrar la suspensión celular a través de un 4Filtro de malla de 0 μm. Lavar el filtro 1-2 veces con 100 μl de FBS / PBS. Mantenga las células a temperatura ambiente.
    8. Mezclar 2 μl de suspensión celular con 18 μl de azul de tripano (0,4%, diluido 1:10 y filtrado) en un tubo nuevo. Cargar 10 μL en un hemocitómetro y contar el número de células fluorescentes vivas (no azules) para calcular el número de células tumorales aisladas.
      NOTA: Las células GFP-negativas no azules son probablemente células T normales, no malignas y no deben contarse. Se requieren al menos 2 x 106 células para teñir las células con Hoechst 33342.

2. Tinción de las células T-ALL marcadas fluorescentemente con Hoechst 33342 para identificar la población lateral

  1. Diluir Hoechst 33342 1:10 con H 2 O libre de nucleasa para obtener la concentración de trabajo de 1 mg / ml. Almacenar el colorante a 4 ° C y en la oscuridad.
  2. Preparar una solución 100 mM de verapamilo disolviendo 49,1 mg en 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO).
    NOTA: El verapamilo es un inhibidor de los transportadores ABC y es un control importante para los experimentos de población lado. Adición de verapamil a muestras inhibirá la capacidad de los transportadores ABC de flujo de salida el colorante Hoechst 33342. Por lo tanto, un verdadero población lado desaparecerá cuando se añade verapamil a la muestra.
  3. Establecer un baño de agua a 28 ° C.
  4. Preparar muestras y los controles en la oscuridad mediante la adición de las células y las soluciones a tubos de clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS).
    1. Preparar las muestras por adición de 10 6 células, 15 l de 1 mg / mL Hoechst 33342, y 2,5 l de DMSO a un tubo de FACS. Ajustar el volumen a 1 ml con FBS / PBS.
    2. Preparar los controles mediante la adición de 10 6 células, 15 l de 1 mg / mL Hoechst 33342, y 2,5 l de 100 mM verapamil a un tubo de FACS. Ajustar el volumen a 1 ml con FBS / PBS.
      NOTA: Un mínimo de 10 6 células / se recomienda la muestra, pero la tinción más células se prefiere, especialmente si el lado populatLas células de ion se clasificarán para su posterior análisis. No exceda de 10 6 células / mL, y mantenga la concentración de Hoechst 33342 a 15 μg / mL. Si se tiñen 10 x 106 células, el volumen de reacción total es de 10 ml.
  5. Incubar en un baño de agua a 28 ° C en la oscuridad durante 120 min.
  6. Después de la incubación, coloque las células inmediatamente sobre hielo y manténgalas en la oscuridad.
  7. Pellet las células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Lavar con 1 ml de FBS / PBS.
  8. Pellet las células a 4 ° C durante 6 min a 300 x g. Retirar el sobrenadante. Resuspender las células en 1 ml de FBS / PBS.
  9. Mantener a 4 ° C hasta la clasificación celular.
  10. 15 min antes de la clasificación celular, añadir 2 μl de stock de yoduro de propidio (1 mg / ml) a cada 1 mL de FBS / PBS (concentración final: 2 μg / mL). Mezclar bien.

3. Utilice FACS para encontrar la población lateral dentro de la población de células T-ALL con marcadores fluorescentes

  1. Analizar las suspensiones de células T-ALL de pez cebra teñidas en un clasificador de células equipado con un láser UV para la excitación de colorante Hoechst 33342 y un láser de 488 nm para la excitación PI y para la detección de las células GFP + T-ALL.
  2. Determinar una puerta para las células vivas, GFP + T-ALL.
    1. Utilice el área de dispersión hacia adelante (FSC) y el área de dispersión lateral (SSC) para eliminar los desechos.
      NOTA: El FSC se utiliza para distinguir el tamaño de la celda y SSC se utiliza para distinguir la granularidad de la celda.
    2. Utilice el ancho FSC y SSC para discriminar los dobletes.
      NOTA: Hay tres componentes identificados por los detectores de citómetro de flujo: área, altura y ancho. El área se usa típicamente para medir la fluorescencia de la célula. Ancho mide el tiempo de vuelo y es dos veces más ancho si dos células se agrupan juntas.
    3. Para las células tumorales vivas, dibuje una puerta alrededor de las células positivas para GFP y negativas para PI usando los detectores apropiados ( por ejemplo , FITC para GFP y PerCP Cy5-5 para PI).
  3. En la puerta de células vivas, medir la fluorescencia de Hoechst 33342 a través de los filtros de paso de banda Hoechst azules y rojas Hoechst (450/50 y 670/30, respectivamente).
    NOTA: La población lado, si está presente, será evidente después de esto está configurado. Es importante destacar que la población lado debe desaparecer en el control de verapamilo con el fin de que sea considerada una verdadera parte de población.
  4. Si la clasificación de las células de población lateral para experimentos adicionales, utilice la punta de la boquilla grande (100 m) y recoger las células en un tubo de FACS que contiene 3 ml de 100% de FBS. Utilice una punta de boquilla más grande (100 m) en lugar de la punta más pequeño (70 m) para mejorar la viabilidad celular después de la clasificación.

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Resultados

Para generar eficientemente fluorescentes myc inducida por T-todos los tumores en el pez cebra, los constructos de ADN circular flanqueadas por sitios transposasa Tol2 pueden co-inyectados con ARN Tol2. Estudios anteriores de la inyección de ADN linealizado en embriones de pez cebra reportan una tasa de transgénesis 5% 8. Con el protocolo ajustarse para incluir transgénesis Tol2 mediada, las tasas de transgénesis que van desde 10-44% pueden observarse (Tab...

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Discusión

El ensayo de población lateral es altamente sensible; Por lo tanto, pequeños cambios en el protocolo pueden resultar en una dificultad en la detección de células de población lateral. En primer lugar, la temperatura durante la etapa de tinción es específica para cada sistema de animal / célula. Para sistemas de mamíferos, el ensayo de población lateral se realiza típicamente a 37ºC. Cuando las células T-ALL de pez cebra se incubaron a 37ºC, muchas de las células murieron, lo que hizo que esta temperatura de incubación f...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la Universidad de Chicago Consejo de la Mujer, el Fondo caso será Wendy, y la Universidad de Chicago Comprehensive Cancer Center Proyectos financiados (P30 CA014599). Nos gustaría dar las gracias a la Citometría de Flujo Core de la Universidad de Chicago, por su ayuda en la creación de este experimento, y así como otros miembros del laboratorio de Jong, en especial Leslie Pedraza y Sean McConnell.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pez cebra singénico (CG2)Véase Mizgireuv et al., 2006
rag2:c-myc plásmidoLangenau Laboratory
rag2:GFP construido en el promotor de Jong Labrag2 del
plásmidoChien Enzima
restricción NotI-HFlaboratorio New England Bio-Labs Inc.R3189S500 unidades en 25 y micro; L
mMessage Machine SP6 Kit de transcripciónAmbionThermo Fisher Scientific - AM134025 reacciones
QIAGEN Plasmid Midi KitQiagen, Inc.12643
Microscopio SteREO Discovery V8Microscopía Carl Zeiss495015-0008-000
Microinyector digitalTritech ResearchMINJ-D
Portaagujas de brazo recto de latónTritech ResearchMINJ-4
Base magnética y soporteTritech ResearchMINJ-HBMB
MicromanipuladorNarishige InternationalMN153
Capilares de vidrioSutter Instrument Co.B100-50-1010 cm sin filamento
Tirador de micropipetas Flaming/BrownSutter Instrument Co.P-97
Puntas de pipeta con microcargadorEppendorf North America Inc.
Solución de rojo de fenolSigma Life ScienceP02900,5% de concentración 100 mL
Pipetas de transferencia de plásticoFisherbrand137119Dgraduada Bulbo de 7,5 mL
Metanosulfonato de tricaína (MS-222)Western Chemical, Inc.Fisher Scientific - NC0342409100 g
Suero fetal bovino (FBS)HyClone Laboratories, Inc.Fisher Scientific - SH3007103500 mL
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco by Life Technologies1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
Sal sódica de heparinaSigma-Aldrich210615 - 300 viales unitarios
40 µ Filtro de malla mFalcon Corning Marca352340Caja de 50
Trypan azulSigma Life ScienceT815420 mL - Solución (0.4%)
Hoechst 33342Life TechnologiesH357010 mL
VerapamiloSigma Life ScienceV46291 g
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma Life ScienceD8418100 mL
Propidium IodideLife TechnologiesP356610 mL
FACSAria Clasificador de células de fusiónBD Biosciences
BD FACSDiva 8.0.1BD Biosciences
FlowJo v10.2FlowJo, LLC
transposasa pCS2 del Laboratorio Langenau de de 930001007

Referencias

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  15. Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish. Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).
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