Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos

Resumen

Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.

Resumen

Una red microvascular funcional es de importancia fundamental para la supervivencia y la integración de construcciones de tejido de ingeniería. Para este fin, se han establecido varias estrategias angiogénicos y prevascularization. Sin embargo, la mayoría de los enfoques basados en células incluyen pasos que consumen tiempo in vitro para la formación de una red microvascular. Por lo tanto, no son adecuados para los procedimientos de un solo paso intraoperatorias. fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo (AD-MVF) representan unidades de vascularización prometedores. Ellos pueden ser fácilmente aisladas de tejido graso y exhiben una morfología de microvasos funcional. Por otra parte, volver a montar rápidamente en nuevas redes microvasculares después de la implantación in vivo. Además, ad-MVF han demostrado inducir la linfangiogénesis. Por último, son una fuente rica de células madre mesenquimatosas, que pueden contribuir además a su alto potencial de la vascularización. En estudios previos se ha demostrado la notable vascularizatien la capacidad de ad-MVF en sustitutos de hueso y piel de ingeniería. En el presente estudio, se presenta en un protocolo estandarizado para el aislamiento enzimático de ad-MVF de tejido adiposo murino.

Introducción

La ingeniería de tejidos se centra en la fabricación de tejidos y órganos sustitutos que mantener, restaurar o aumentar la función de inoperable en homólogos in vivo ^{1, 2.} El destino de las construcciones de ingeniería tisular depende fundamentalmente de una vascularización adecuada ^3. Redes microvasculares dentro de estas construcciones deben ser organizados jerárquicamente con arteriolas, capilares y vénulas para permitir la perfusión de la sangre eficiente después de inosculation a la vasculatura ⁴ del destinatario. La generación de este tipo de redes es uno de los desafíos clave en la ingeniería de tejidos. Para este fin, un amplio espectro de estrategias de vascularización experimentales se ha introducido en las últimas dos décadas ^{5, 6.}

enfoques angiogénicos estimulan el crecimiento interno de microvasos los destinatarios de forma TISS ingenieríaues por medio de modificación andamiaje estructural o fisicoquímicas, tales como la incorporación de factores de crecimiento ^7. Sin embargo, para la vascularización de las grandes construcciones tridimensionales, las estrategias dependientes de la angiogénesis están marcadamente limitados por bajas tasas de crecimiento de desarrollo de microvasos ^8.

Por el contrario, el concepto de prevascularization apunta a la generación de redes microvasculares funcionales dentro del tejido construye antes de su implantación ^9. Prevascularization convencional implica el co-cultivo de células formadoras de vasos, tales como células endoteliales, células murales o células madre ^10, dentro de andamios. Después de la formación de la red microvascular, las construcciones prevascularizados entonces se pueden implantar en los defectos del tejido. Digno de mención, este enfoque prevascularization es difícil de aplicar en un entorno clínico, ya que se basa en la compleja y lenta in vitro </ em> los procedimientos que se encuentran restringidos por los principales obstáculos regulatorios ^9. En consecuencia, todavía hay una necesidad para el desarrollo de nuevas estrategias prevascularization que son más adecuados para una amplia aplicación clínica.

Tal estrategia prevascularization puede ser la aplicación de los fragmentos de microvasculares derivadas de tejido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representan unidades de vascularización potentes que pueden ser cosechados en grandes cantidades desde el tejido graso de ratas ^{11, 12} y ¹³ ratones. Se componen de arteriolar, capilar, y segmentos de vasos venulares, que exhiben una morfología de microvasos fisiológica con un lumen y la estabilización de células perivasculares ^{14, 15.} Esta característica única permite la implantación inmediata de andamios ad-MVF cabeza de serie en defectos de tejidos sin cultivo previo. Allí, el ad-MVF volver a montar rápidamente ena las redes microvasculares funcionales. Además, ad-MVF representan una fuente rica de células madre mesenquimales ^16, que pueden contribuir adicionalmente a su capacidad regenerativa llamativo. En consecuencia, ad-MVF se utilizan cada vez más en diferentes campos de la ingeniería de tejidos ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

El aislamiento de ad-MVF originalmente se ha establecido en ratas ^{11, 12.} En este documento, se describe un protocolo, que permite el aislamiento normalizado de murino ad-MVF de almohadillas de grasa del epidídimo. Esto puede proporcionar más conocimientos sobre los mecanismos moleculares que subyacen a la función ad-MVF mediante el uso de modelos de ratones transgénicos.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el uso de animales de experimentación y siguieron las directrices institucionales (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemania).

1. Preparación de instrumentos quirúrgicos

1. Mantener listas las tijeras de disección, fórceps quirúrgicos, tijeras pequeñas de preparación, unas pinzas finas y una placa de Petri estéril con medio de Eagle modificado de 15 ml Dulbecco (DMEM; 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 0,1 mg / ml de estreptomicina ) para la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo.
2. Exponer los instrumentos quirúrgicos a una solución desinfectante durante 5 min. Alternativamente, esterilizarlos (esterilización con vapor; 121 ° C, 20 min).

2. Animales y anestesia

1. Elegir con cuidado la cepa de los ratones como se indica para el estudio y la sujeto bajo investigación.
   NOTA: En este estudio se utilizó de tipo salvaje C57BL ratones macho / 6 como donantes para la recolección de grasa del epidídimo. De interés, ad-MVF puede ser también aislado de transgénicos proteína verde fluorescente (GFP) -positivos animales donantes (C57BL / 6-Tg (CAG-EGFP) 1Osb / J) ^22. Esto tiene la gran ventaja de que los fragmentos son fácilmente detectables por tinción inmunohistoquímica de GFP después de la implantación en ratones de tipo salvaje GFP-negativo ^14.
2. Anestesiar a los animales con una inyección intraperitoneal de xilazina (15 mg / kg) y ketamina (75 mg / kg). Asegúrese de que los animales se anestesiaron profundamente mediante la realización de una pizca dedo del pie sin respuesta. lubricante ojo no se indica como los animales donantes se sacrifican después de la cosecha de grasa.
   NOTA: Asegúrese de que la analgesia y la esterilidad quirúrgica están de acuerdo con las directrices respectivas del país e institución donde se planifican los experimentos.

Le "> 3. La recolección de grasa del epidídimo de ratón

1. Transferir el animal a un mesa de operaciones. Colocar el animal en posición supina bajo un estereomicroscopio quirúrgico y confirmar anestesia profunda utilizando pizca dedo del pie.
2. Inmovilizar las patas con cinta adhesiva a un paño quirúrgico y desinfectar el abdomen con solución desinfectante.
3. Separar la piel abdominal libre de la capa muscular subyacente con las tijeras de disección.
4. Realizar una laparotomía media con las tijeras de disección y lateralmente desplegar las solapas de la pared abdominal.
5. Bilateralmente identificar testículo, epidídimo y la almohadilla de grasa del epidídimo usando las pinzas finas (Figura 1). No hagan daño a las estructuras intestinales para evitar la contaminación fecal de las almohadillas de grasa.
6. Cosechar las almohadillas de grasa del epidídimo con las pequeñas tijeras de preparación y las pinzas finas bajo el microscopio estereoscópico. Mantener un margen de seguridad de varios mm entre el epidídimo y la grasa sereducir el riesgo de la cosecha del epidídimo accidental.
   NOTA: Este procedimiento también puede realizarse sin un microscopio estereoscópico. Sin embargo, esto puede aumentar aún más el riesgo de lesiones accidentales del epidídimo y cordón espermático.
7. Transferencia de las almohadillas de grasa del epidídimo en una placa Petri que contiene 15 ml de DMEM pre-calentado a 37 ° C para el transporte al laboratorio de células.
8. Sacrificio del animal por incisión de la aorta abdominal o dislocación cervical.

4. Aislamiento de ad-MVF

1. Preparar tres placas de Petri estériles con 15 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS), tubos estériles de polipropileno de 14 ml (PP), un 50-ml matraz de Erlenmeyer estéril, tubos cónicos de microcentrífuga estéril de 1,5 ml y tijeras finas esterilizados.
2. Lavar las almohadillas de grasa tres veces en placas de Petri con 15 ml de PBS bajo una campana de flujo laminar.
3. La transferencia de la grasa en un tubo de 14 ml PP. Determinar el volumen de tejido graso cosechado (en ml) por medio de tél escala tubo. Picar el tejido graso mecánicamente con las tijeras finas hasta que se obtiene una suspensión de tejido homogéneo.
4. Transferir el tejido picado con dos volúmenes de colagenasa NB4G (0,5 U / ml PBS) en un matraz de 50 ml Erlenmeyer por medio de 10 ml de medición pipeta. El volumen total se convierte en tres veces el volumen de tejido de grasa medida en la etapa 4.3. Realizar la digestión del tejido en una incubadora durante 10 min bajo agitación vigorosa por medio de un agitador automático (tamaño de la barra de agitación magnética: 25 mm) a 37 ° C y las condiciones atmosféricas humidificado con un 5% de _CO2.
5. Observar una pequeña fracción (10 l) del tejido digerido bajo un microscopio para juzgar si la digestión se puede detener. Determinar que el digestato contiene principalmente "libre" ad-MVF al lado de las células individuales, lo que indica el punto apropiado para detener el proceso de digestión enzimática (Figura 2).
   NOTA: Este paso requiere experiencia con el procedimiento y es fundamental para la calidadde aislado ad-MVF. Prolongada resultados digestión de las grasas en una suspensión de una sola célula sin ad-MVF.
6. Neutralizar la enzima con dos volúmenes de PBS / 20% de FCS. El volumen total se convierte en tres veces el volumen de la suspensión de células de los vasos en el paso 4.4. Transferir la suspensión celular del vaso de nuevo en nuevos tubos de PP.
7. Incubar la suspensión durante 5 min a 37 ° C para separar ad-MVF de grasa restante por la gravedad. A continuación, retire con cuidado el sobrenadante principal de grasa con una pipeta de precisión de 1 ml. Repita este ciclo varias veces con una pipeta de precisión de 100 l hasta que la suspensión parece estar libre de grasa.
8. Coloque un filtro de 500 micras en la parte superior de un tubo de centrífuga cónico de 50 mL. Transferir la suspensión celular de vasos con una pipeta de medición de 10 ml a partir de los 14 ml tubos de PP sobre la membrana de filtro para eliminar restante coágulos de grasa. Transferir la suspensión se filtró en nuevos tubos de 14 ml de PP de acuerdo con el número de individuales ad-MVF aísla para los experimentos planificados.
   NOTA: Porque en vitro ensayos centrados en la formación de la red microvascular, puede ser beneficioso para purificar adicionalmente la suspensión celular del vaso para mejorar la calidad de imagen durante los análisis microscópicos. Para este propósito, la suspensión puede ser, además, se filtró una vez con un filtro de 20 micras para eliminar las células individuales de la ad-MVF recogidos en el filtro.
9. Centrifugar la suspensión de células de los vasos (600 xg, 5 min, temperatura ambiente) para obtener un pellet que contiene ad-MVF.
10. Después de la centrifugación, eliminar el sobrenadante hasta que 1 se deja mL. Resuspender el precipitado con ad-MVF en este 1 ml y transferir la suspensión a un tubo de microcentrífuga cónica 1,5-mL.
11. Centrifugar la suspensión ad-MVF en el tubo de microcentrífuga (600 xg, 5 min) para obtener un pellet.
12. Eliminar el sobrenadante para resuspender el sedimento en el volumen final requerido de PBS / 20% de FCS.
    NOTA: El número de ad-MVF por aislamiento puede ser evaluada por recuento microscópico. Para este propósito, 1/10 de la célula-vesse definitival suspensión se diluye 1:10 en PBS y 100 l de esta dilución se transfieren a un pocillo de una placa de 96 pocillos. El número entero de ad-MVF que exhibe una morfología recipiente-como se después se contaron y se extrapoló a todo el aislado. La concentración y la purificación ad-MVF requerida se pueden adaptar individualmente a la respectiva aplicación in vitro o in vivo de la ad-MVF en. Esto puede incluir la incorporación de ad-MVF en geles de colágeno para el análisis in vitro de la formación de la red microvascular o la siembra de ad-MVF en andamios para la implantación in vivo en defectos de tejidos.

Resultados

En el presente estudio hemos realizado seis procedimientos de aislamiento ad-MVF con el tejido de grasa de 7 a 12 meses de edad, de tipo salvaje macho C57BL / 6 ratones (peso corporal medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 ilustra la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo murino con posterior aislamiento mecánica y enzimática ad-MVF. El tiempo requerido para la recolección de grasa fue de 30 min y para el aislamiento de ad-MVF fue de 120 min. En total, el procedim...

Discusión

En este estudio se presenta un protocolo bien establecido para el aislamiento de ad-MVF. La obtención de ad-MVF del tejido adiposo murino es un procedimiento sencillo con unos pocos pasos críticos. Ratones muestran diferentes subcutáneo y los depósitos de grasa intraabdominal. Como se ha descrito anteriormente para las ratas, la fuente de grasa más adecuado para el aislamiento de ad-MVF son las almohadillas de grasa del epidídimo debido a su tamaño, estructura homogénea y una contaminación mínima con los vasos sanguíneo...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml	VWR, Kelsterbach, Alemania	700-5239
100-µ Pipeta de precisión L	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	4920000059
pipeta dosificadora de 10 mL	Costar, Corning Inc., Nueva York, EE. UU.	4488
Tubos de PP de 14 mL Greiner	bio-one, Frickenhausen, Alemania	187261
pipeta de precisión de 1 mL	Eppendorf, Hamburgo, Alemania	4920000083
500-µ filtro m (pluriStrainer 500 & m)	HISS Diagnostics, Friburgo, Alemania	43-50500-03
Tubo de centrífuga cónico de 50 ml	Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania	227261
matraz Erlenmeyer de 50 ml	VWR, Kelsterbach, Alemania	214-0211
placa de 96 pocillos	Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania	65518
solución de desprendimiento de células (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA, EE. UU	. 00-4555-56
Ratones C57BL/6	Charles River, Colonia, Alemania	027
Ratones C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, EE. UU.	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Alemania	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Alemania	553354
Colagenasa NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania	17465.02	Lote probado por el fabricante para su actividad enzimática
Tijeras de disección	Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemania	BC 601
Colorante de unión al ADN (Bisbenzimida H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania	B2261
Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Alemania	P04-03600
Suero fetal para terneros (FCS)	Biochrom GmbH, Berlín, Alemania	S0615
Pinzas finas	S& T AG, Neuhausen, Suiza	FRS-15 RM-8
Tijeras finas	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, EE. UU.	503261
Sustituto cutáneo dérmico (Integra)Integra	Life Sciences, Sain Priest, Francia	62021
Ketamina	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Alemania	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA, EE. UU	. 53-4724-80
Octeniderm (solución desinfectante);	LKE & Mayer, Norderstedt, Alemania	118211
Penicilina/estreptomicina	Biochrom, Berlín, Alemania	A2213
Placa de Petri	Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania	664160
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Grupo Lonza, Basilea, Suiza	17-516F
pluriStrainer 20-µ m (20 y micro; filtro m)	HISS Diagnostics, Friburgo, Alemania	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Alemania	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Alemania	553930
Tijeras de preparación pequeñas S	& T AG, Neuhausen, Suiza	SDC-15 R-8S
Pinza quirúrgica	Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemania	BD510R
Cinta (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Alemania	1671801
Xilacina	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	El marcaje intracelular requiere adicionalmente Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania; #554722)