Se presenta un protocolo para aislar fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo que representan unidades de vascularización prometedores. Se pueden aislar rápidamente, no requieren en el procesamiento vitro y, por tanto, puede ser utilizado para prevascularization de un solo paso en diferentes campos de la ingeniería de tejidos.
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Artículo de método
Aislamiento de murino tejido adiposo derivado de microvascular Fragmentos como Unidades Vascularización para ingeniería de tejidos
En este artículo
Resumen
Resumen
Una red microvascular funcional es de importancia fundamental para la supervivencia y la integración de construcciones de tejido de ingeniería. Para este fin, se han establecido varias estrategias angiogénicos y prevascularization. Sin embargo, la mayoría de los enfoques basados en células incluyen pasos que consumen tiempo in vitro para la formación de una red microvascular. Por lo tanto, no son adecuados para los procedimientos de un solo paso intraoperatorias. fragmentos microvasculares derivadas de tejido adiposo (AD-MVF) representan unidades de vascularización prometedores. Ellos pueden ser fácilmente aisladas de tejido graso y exhiben una morfología de microvasos funcional. Por otra parte, volver a montar rápidamente en nuevas redes microvasculares después de la implantación in vivo. Además, ad-MVF han demostrado inducir la linfangiogénesis. Por último, son una fuente rica de células madre mesenquimatosas, que pueden contribuir además a su alto potencial de la vascularización. En estudios previos se ha demostrado la notable vascularizatien la capacidad de ad-MVF en sustitutos de hueso y piel de ingeniería. En el presente estudio, se presenta en un protocolo estandarizado para el aislamiento enzimático de ad-MVF de tejido adiposo murino.
Introducción
La ingeniería de tejidos se centra en la fabricación de tejidos y órganos sustitutos que mantener, restaurar o aumentar la función de inoperable en homólogos in vivo 1, 2. El destino de las construcciones de ingeniería tisular depende fundamentalmente de una vascularización adecuada 3. Redes microvasculares dentro de estas construcciones deben ser organizados jerárquicamente con arteriolas, capilares y vénulas para permitir la perfusión de la sangre eficiente después de inosculation a la vasculatura 4 del destinatario. La generación de este tip....
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Protocolo
Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con el Instituto Nacional de Salud directrices para el uso de animales de experimentación y siguieron las directrices institucionales (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemania).
1. Preparación de instrumentos quirúrgicos
- Mantener listas las tijeras de disección, fórceps quirúrgicos, tijeras pequeñas de preparación, unas pinzas finas y una placa de Petri estéril con medio de Eagle modificado de 15 ml Dulbecco (DMEM; 10% de suero de ternera fetal (FCS), 100 U / ml de penicilina, 0,1 mg / m....
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Resultados
En el presente estudio hemos realizado seis procedimientos de aislamiento ad-MVF con el tejido de grasa de 7 a 12 meses de edad, de tipo salvaje macho C57BL / 6 ratones (peso corporal medio: 35 ± 1 g). La Figura 1 ilustra la recolección de las almohadillas de grasa del epidídimo murino con posterior aislamiento mecánica y enzimática ad-MVF. El tiempo requerido para la recolección de grasa fue de 30 min y para el aislamiento de ad-MVF fue de 120 min. En total, el procedim.......
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Discusión
En este estudio se presenta un protocolo bien establecido para el aislamiento de ad-MVF. La obtención de ad-MVF del tejido adiposo murino es un procedimiento sencillo con unos pocos pasos críticos. Ratones muestran diferentes subcutáneo y los depósitos de grasa intraabdominal. Como se ha descrito anteriormente para las ratas, la fuente de grasa más adecuado para el aislamiento de ad-MVF son las almohadillas de grasa del epidídimo debido a su tamaño, estructura homogénea y una contaminación mínima con los vasos sanguíneo.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Agradecimientos
Estamos muy agradecidos por la excelente asistencia técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann y Ruth Nickels. Este estudio fue financiado por una beca de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundación Alemana de Investigación) - LA 2682 / 7-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml | VWR, Kelsterbach, Alemania | 700-5239 | |
| 100-µ Pipeta de precisión L | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 4920000059 | |
| pipeta dosificadora de 10 mL | Costar, Corning Inc., Nueva York, EE. UU. | 4488 | |
| Tubos de PP de 14 mL Greiner | bio-one, Frickenhausen, Alemania | 187261 | |
| pipeta de precisión de 1 mL | Eppendorf, Hamburgo, Alemania | 4920000083 | |
| 500-µ filtro m (pluriStrainer 500 & m) | HISS Diagnostics, Friburgo, Alemania | 43-50500-03 | |
| Tubo de centrífuga cónico de 50 ml | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania | 227261 | |
| matraz Erlenmeyer de 50 ml | VWR, Kelsterbach, Alemania | 214-0211 | |
| placa de 96 pocillos | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania | 65518 | |
| solución de desprendimiento de células (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA, EE. UU | . 00-4555-56 | |
| Ratones C57BL/6 | Charles River, Colonia, Alemania | 027 | |
| Ratones C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, EE. UU. | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemania | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemania | 553354 | |
| Colagenasa NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemania | 17465.02 | Lote probado por el fabricante para su actividad enzimática |
| Tijeras de disección | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemania | BC 601 | |
| Colorante de unión al ADN (Bisbenzimida H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania | B2261 | |
| Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Alemania | P04-03600 | |
| Suero fetal para terneros (FCS) | Biochrom GmbH, Berlín, Alemania | S0615 | |
| Pinzas finas | S& T AG, Neuhausen, Suiza | FRS-15 RM-8 | |
| Tijeras finas | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, EE. UU. | 503261 | |
| Sustituto cutáneo dérmico (Integra)Integra | Life Sciences, Sain Priest, Francia | 62021 | |
| Ketamina | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Alemania | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA, EE. UU | . 53-4724-80 | |
| Octeniderm (solución desinfectante); | LKE & Mayer, Norderstedt, Alemania | 118211 | |
| Penicilina/estreptomicina | Biochrom, Berlín, Alemania | A2213 | |
| Placa de Petri | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemania | 664160 | |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Grupo Lonza, Basilea, Suiza | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µ m (20 y micro; filtro m) | HISS Diagnostics, Friburgo, Alemania | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemania | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemania | 553930 | |
| Tijeras de preparación pequeñas S | & T AG, Neuhausen, Suiza | SDC-15 R-8S | |
| Pinza quirúrgica | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemania | BD510R | |
| Cinta (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Alemania | 1671801 | |
| Xilacina | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemania | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | El marcaje intracelular requiere adicionalmente Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemania; #554722) |
Referencias
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J.
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Reimpresiones y permisos
