Incremento dependiente del tiempo en la respuesta de la red a la estimulación de cultivos de células neuronales en matrices de microelectrodos

Micro-electrodo arrays (MEAs) se puede utilizar para investigar la toxicidad de los medicamentos, los paradigmas de diseño para la próxima generación de medicina personalizada, y estudiar la dinámica de la red en culturas neuronales [ ^1] . En contraste con métodos más tradicionales -como el patch-clamping, que sólo puede registrar la actividad de una sola célula, o grabación de campo con una pipeta de vidrio, que puede registrar las respuestas extracelulares de las neuronas que rodean el electrodo en un solo sitio-MEAs puede simultáneamente Registro de múltiples sitios en un cultivo celular sin requerir la ardua tarea de colocar cada electrodo individualmente. Esto permite el estudio de las interacciones dinámicas entre grupos de células que forman una red dentro de esa cultura. Además, los efectos de la estimulación eléctrica sobre los patrones de disparo de red ^{2 , 3 , 4 , 5} y el control de red ^{6 <}/ Sup> en cultivos neuronales han sido bien documentados, y numerosas configuraciones de estimulación eléctrica y controles pueden aplicarse fácilmente dentro de la misma configuración experimental, permitiendo explorar una amplia gama de dinámicas espacio-temporales.

Una de las dinámicas clave de interés en estos estudios in vitro ha sido la medida en que las redes cultivadas muestran propiedades indicativas de aprendizaje ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13} . El Laboratorio Peixoto examinó previamente los efectos de señales de entrenamiento de alta frecuencia, como se describe en Ruaro et al. ¹⁴ , en las redes de ratón neuronas plateado en microelectrode arrays [ ^15] . En estos experimentos, las redes mostraron un aumento en la respuesta followinG de entrenamiento inducido por la estimulación eléctrica. El aumento de la respuesta se consideró una forma de aprendizaje a través del reconocimiento de estímulo, por lo que las redes respondieron de manera coherente a un cambio en el estímulo después de la aplicación de una estimulación específica ( es decir, el entrenamiento) del protocolo.

Este protocolo demuestra cómo cultivar células neuronales en MEAs, registrar exitosamente de más del 95% de los platos chapados, establecer un protocolo para entrenar a las redes para responder a patrones de estimulación, clasificar una sola unidad de actividad, trazar histogramas e interpretar los resultados de Experimentos. Se demuestra el uso de un sistema patentado (véase la Tabla de Materiales ) para la estimulación y registro de cultivos neuronales, así como la aplicación de paquetes de software (ver Tabla de Materiales ) para ordenar unidades neuronales . Una interfaz de usuario gráfica diseñada a medida (consulte la Tabla de materiales ) se utiliza para visualizar los post-sTimulus, intervalos entre ráfagas y duración de ráfaga, así como para comparar la respuesta celular con la estimulación antes y después de un protocolo de entrenamiento.

Todos los procedimientos con animales siguen las directrices de los NIH y / o la Política de Servicios de Salud Pública sobre el Cuidado Humano y el Uso de Animales de Laboratorio y están bajo un protocolo de uso y cuidado de animales aprobado institucionalmente en la Universidad George Mason.

1. Preparación del material

1. Autoclave los siguientes materiales: pipetas de vidrio de 5,75 pulgadas de largo dispuestas verticalmente en 2 vasos de 500 mL, aproximadamente 24 trozos de papel de filtro (150 mm de diámetro, cada uno cortado en 8 cuñas, el tamaño de poro no importa), 1000 μl de pipeta filtrada Puntas, 200 μl de puntas de pipeta filtradas, 10 μl de puntas de pipeta filtradas y agua desionizada (DI) para los lavados (al menos 200 ml).
2. Prepare los reactivos y los medios.
   1. Preparar todos los reactivos y medios en la biofilia utilizando técnicas asépticas.
   2. Preparar la poli-D-lisina (PDL) según la Tabla 1 .
      1. Mezclar el PDL con agua DI estéril a una c finalOncentración de 50 μg / ml, como sigue. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir 96 ml de agua DI estéril a una botella de reactivo de vidrio esterilizada en autoclave.
      2. Use una pipeta serológica estéril para agregar 4 mL de agua DI estéril al vial del fabricante que contenga PDL. Disolver el PDL por pipeteado. Utilice la misma pipeta para transferir la solución de PDL a la botella de reactivo de vidrio que contiene los 96 ml de agua DI estéril.
      3. Tape la botella firmemente antes de quitarla de la biofundidad y vórtice la solución. En la biofundidad, divida la solución en alícuotas de 5 mL; Congelar cualquier solución no utilizada a -20 ° C. El PDL descongelado puede volver a congelarse una vez. Deseche la solución descongelada si se vuelve a congelar antes.
   3. Preparar la solución de laminina según la Tabla 2 .
      1. Mezclar la laminina con PBS hasta una concentración final de 20 μg / ml, como sigue. Utilice una pipeta serológica estéril para transferir 49 ml de PBS a un tubo de centrífuga de 50 ml.
      2. Utilice una serologica estérilL pipetear para agregar 1 ml de PBS al vial del fabricante que contenga el peso apropiado de laminina. Disolver la laminina por pipeteado. Utilice la misma pipeta para transferir la solución de laminina al tubo de centrífuga de 50 ml que contiene los 49 ml de PBS.
      3. Tape el tubo con fuerza antes de retirarlo de la biofundidad y vórtice la solución. En la biofundidad, divida la solución en alícuotas de 5 ml; Congelar cualquier solución no utilizada a -20 ° C. La laminina descongelada no se puede volver a congelar; Descartar cualquier solución descongelada no utilizada.
   4. Prepare el medio de almacenamiento, según la tabla 3 .
      NOTA: El medio de almacenamiento se utiliza para almacenar el tejido durante un máximo de un mes a los niveles ambientales de CO ₂ . Se puede comprar (véase la tabla de materiales), o se puede preparar usando la receta general de: medio de almacenamiento de células de CO ₂ ambiente + 2% de suplemento sin suero para el cultivo de células neurales + medio de cultivo celular de 0,5 mM que contiene un medio estabilizado Forma de L-glutamina (ver tabla de materiales).
      1. Para hacer 10 mL de medio de almacenamiento, transfiera 10 mL de medio de almacenamiento para tejido embrionario sin CaCl2 a un tubo de centrífuga de 15 mL. Añadir 210 μl de suplemento libre de suero para el cultivo de células neurales y 55 μL de una forma estabilizada de L-glutamina. Mezclar suavemente por inversión.
      2. Como el medio de almacenamiento es sensible a la luz, protéjalo cubriendo los tubos de centrífuga de 15 ml con papel de aluminio. Alícuota de 2 ml de medio de almacenamiento por tubo para un total de 5 alícuotas. Guarde en un refrigerador por hasta 2 semanas o hasta que esté listo para usar, pero no congele.
   5. Preparar DMEM 5/5 medio, según la Tabla 4 .
      1. Descongelar alícuotas de suplemento sin suero para cultivo de células neurales, suero de caballo (HS), suero bovino fetal (FBS) y ácido ascórbico. Descongelar una alícuota de pen-strep, si es necesario, para controlar la contaminación bacteriana. Pipetear cada ingrediente en un tubo de centrífuga de 50 ml. Asegúrese de que las puntas de la pipeta no toquen ninguna superficie u objeto.Ts
      2. Dentro de la biofundidad, conecte el filtro al tubo de vacío con el vacío todavía apagado. Vierta la mezcla en la tapa del filtro y ciérrela. Encienda el vacío en la biofundidad y deje que el filtro de medio a la parte inferior del recipiente. Desconecte el filtro de la aspiradora antes de apagar la aspiradora.
      3. Apriete la tapa del contenedor de material estéril, etiquétela y guarde cualquier medio no utilizado a 4 ° C durante un mes. Abra el recipiente dentro de la biofilia para mantener el medio estéril.
   6. Preparar el medio DMEM +, según la Tabla 5 .
      1. Descongelar alícuotas de suero libre de suplemento para el cultivo de células neurales y ácido ascórbico (y pen-strep, si es necesario). Pipetear cada ingrediente en un tubo de centrífuga de 50 ml. Repita los pasos 1.2.5.2-1.2.5.3 para el proceso restante.

2. Array / preparación del plato

NOTA: Los MEA utilizados en el procedimiento son arrays de 60 canales oSe organizó en un cuadrado de 8 x 8. La distancia interelectrodo es 200 μm, y cada electrodo tiene 10 μm de diámetro. El material conductor de las pistas es de titanio, y los electrodos están hechos de TiN. El anillo de vidrio alrededor de los electrodos tiene 6 mm de alto, con un diámetro exterior de 24 mm. Se utiliza una tapa hecha de polioximetileno (POM) para cubrir el MEA, y una película fluorada de etileno propileno (FEP) permeable a los gases / líquido-impermeable se utiliza para evitar la contaminación durante las sesiones de grabación y estimulación.

1. El día antes del chapado.
   1. Hacer que los MEA no utilizados sean hidrófilos exponiéndolos al plasma; Esto no suele ser necesario después del primer uso. Asegúrese de que los cubreobjetos de vidrio utilizados para los cultivos de control también reciben un tratamiento con plasma.
      NOTA: Las placas de Petri plásticas (35 mm) también se pueden utilizar como platos de control y no necesitan ningún tratamiento previo.
      1. Administrar el tratamiento con plasma usando un grabador de plasma durante 40-60 s a media potencia (50 W), wiLa presión de la cámara ajustada a 100-150 mT.
   2. Inmediatamente llene los MEA con agua DI. Sumergir los cubreobjetos en una placa de Petri llena de agua DI. Deje el agua DI en contacto con las superficies tratadas durante aproximadamente 15 min.
   3. Dentro de la biofundidad, la succión del agua DI. Llene los MEAs al borde con etanol al 70%. Retire el agua DI de la placa de Petri que contiene los cubreobjetos y llene la placa de Petri con etanol hasta que los cubreobjetos estén completamente sumergidos. Deje reposar durante 10-15 minutos.
   4. Etiquetar todas las placas de Petri y platos de control con el MEA ID #, la fecha de la cirugía, el tipo de célula y las iniciales. Luego, coloque cada MEA en su placa de Petri marcada.
   5. Coloque los MEAs en placas individuales de Petri y retire el etanol usando succión al vacío. Llene los MEA con agua DI estéril para eliminar cualquier etanol residual. Utilice succión al vacío para eliminar el agua DI. Deje que los MEAs se sequen al aire dentro de la biofundidad.
   6. Añadir 40-70 μL de 50 μg / mL de poli-D-lisinaE (PDL, de alto peso molecular, al menos 50 kDa) al centro de cada MEA y 0,2 ml a los controles usando puntas de pipeta estériles.
      NOTA: Asegúrese de no tocar el centro del MEA con la pipeta, ya que esto podría dañar los electrodos. La cantidad exacta de PDL dispensada depende de la hidrofilia de la superficie.
   7. Coloque un pedazo pequeño de papel de seda de laboratorio en cada plato y se humedece con agua estéril para evitar la evaporación de PDL durante la noche. Cubra todos los platos antes de quitarlos de la biofilia. Colocar los platos en una incubadora a 37 ° C durante la noche.
2. Plating día.
   1. En el día de recubrimiento, descongelar 1 alícuota de laminina (20 μg / ml); Cada MEA requiere 40-50 μL de laminina, y cada placa de control requiere 0,2 ml de laminina. Calcular el volumen de laminina necesario sobre la base del número de MEA y controles a utilizar.
   2. Transferir todos los platos de la incubadora a la biofundidad.
   3. Rellenar todos los MEA con estérilDI utilizando una pipeta serológica estéril y dejar que se sienten durante 10 - 15 min. Aspirar el agua DI utilizando pipetas Pasteur estériles y repetir el proceso dos veces.
   4. Añadir 40 - 50 μL de laminina descongelada al centro de cada MEA y 0,2 ml de laminina a las placas de control usando puntas de pipeta estériles. Cubra todos los MEA y los platos de control en la biofundidad y transfiéralos a una incubadora a 37 ° C durante 1 h.
      1. Retire con cuidado el exceso de laminina del centro de los MEAs utilizando succión con pipetas estériles de Pasteur y deje que la superficie se seque al aire antes de recubrirla.
   5. Dejar los platos en la biofundidad, o colocarlos en una incubadora hasta que estén listos para planchar las células.
      NOTA: Los platos pueden permanecer en la incubadora hasta el día siguiente. Sin embargo, si se necesita más tiempo, es aconsejable limpiar los platos y comenzar de nuevo desde el paso de poli-D-lisina (PDL) (paso 2.1.6).

3. Remoción de Embriones y CerebroExtracción

1. Vierta el medio L-15 (Leibovitz) en 4 de las placas de Petri de 100 mm. Cubrirlos y colocarlos en un congelador de -20 ° C hasta que el medio tenga una consistencia lodosa pero no esté congelado sólido (~ 40-60 min).
2. Haga esto aproximadamente de 40 min a 1 h antes de la disección.
   NOTA: Esto enfriará los embriones y el cerebro rápidamente, de modo que tengan una consistencia firme y no se desintegren al extraer.
3. Preparar el área de disección para la remoción de embriones.
   1. Coloque una bandeja con hielo cerca de un fregadero y coloque los instrumentos quirúrgicos y los materiales para la remoción de embriones. Estos incluyen 4 placas de Petri con fría L-15 "slush", toallas de papel, una botella de spray con 70% de etanol, pinza de pulgar de punta fina, fórceps fino, tijeras quirúrgicas pequeñas y tijeras grandes ( Figura 1 ).
4. Preparar el área de disección para la extracción cerebral.
   1. Coloque una placa de Petri de vidrio faEn una bandeja llena de hielo.
   2. Coloque los instrumentos quirúrgicos y los materiales para la extracción del cerebro, incluyendo toallas de papel, pequeñas tijeras quirúrgicas, una espátula delgada de doble punta, una botella de spray llena de etanol al 70% y una bolsa de plástico para la eliminación de la canal.
5. Ponte una bata de laboratorio, una mascarilla y guantes. Rocíe todas las superficies de trabajo, incluyendo los guantes, con etanol al 70%.
   NOTA: Aunque esto no es un procedimiento estéril, lo mejor es reducir las posibilidades de contaminación tanto como sea posible.
6. Eutanasia de un ratón E17 de embarazo cronometrado siguiendo las directrices NIH ¹⁶ y / o la Política de Servicios de Salud Pública sobre el Cuidado Humano y el Uso de Animales de Laboratorio y bajo un protocolo de uso y cuidado de animales aprobado institucionalmente para la asfixia de CO ₂ . Asegúrese de liberar el gas de CO ₂ lentamente en la cámara durante un período de 3 a 5 minutos para evitar la inducción de pánico o discotecaMfort en el ratón.
7. Decapitar el ratón y colocarlo en una toalla de papel, con el lado ventral hacia arriba. Rocíe su parte inferior del abdomen con etanol al 70%. Usando las pequeñas tijeras quirúrgicas, hacer un corte en forma de V a través de la piel y la grasa subcutánea de la parte inferior del abdomen, extendiendo el corte a los extremos distales de la cavidad torácica y exponer el útero.
8. Usando fórceps, levante cuidadosamente el útero entre los embriones. Corte el tejido conectivo con tijeras de disección hasta que el útero entero esté libre. Enjuagar brevemente el útero con etanol al 70% para eliminar la sangre y colocarla en una de las 4 placas de Petri llenas de L-15 fría.
9. Liberar cada embrión del útero y del saco embrionario interior usando un par de pinzas de punta fina. Asegúrese de que el cordón umbilical ha sido cortado y el saco placentario retirado. Coloque los embriones liberados en el segundo plato lleno de frío L-15. Decapitar los embriones con fórceps y tijeras. Usando fórceps, transfiera las cabezas a una tercera placa de Petri y los cuerposA un cuarto, ambos llenos de frío L-15.

4. Extracción de la corteza frontal

1. En una biofundidad, coloque una cuña de papel de filtro autoclavado en la platina de Petri de vidrio enfriado. Coloque una cabeza de embrión en el papel de filtro. Agarre el cráneo colocando un par de fórceps a través de las cavidades oculares con la mano no dominante. Retire la piel y el tejido muscular subyacente con un par de tijeras de iris.
2. Coloque el filo de la parte inferior de la tijeras del iris en la base del cráneo. Manteniendo la más baja contra la superficie interna del cráneo, lejos del cerebro, corte a través de la placa occipital y luego a lo largo de la línea media entre las placas parietales. Continúe cortando rostralmente, entre las placas cartilaginosas del cráneo frontal.
3. Comenzando en el centro de la placa occipital, haga un corte perpendicular a la izquierda ya la derecha del corte central.
4. Retire el cerebro deslizando cuidadosamente una pequeña espátula entre la superficie ventralDel cerebro y las placas inferiores del cráneo hasta que esté completamente bajo el cerebro. Levante la espátula hacia arriba; Todo el cerebro saldrá intacto.
5. Coloque unas gotas de medio L-15 sobre el papel de filtro para que el cerebro no se pegue al papel y deslice suavemente el cerebro de la espátula sobre el papel de filtro, con el lado ventral hacia abajo. Cuidadosamente cortar el bulbo olfativo con la punta de la espátula.
6. Usando una espátula limpia, disecar el lóbulo frontal en un patrón trapezoidal. Transferir el tejido a un tubo de centrífuga de 15 ml que contiene el medio de almacenamiento. Repita lo anterior con los embriones restantes. Asegúrese de usar una cuña fresca de papel de filtro cada vez ( es decir, una cuña de papel de filtro por cabeza).

5. Disociación celular

1. En la biofundidad, ensamble los ítems listados en la Tabla 6 .
2. Utilice una pipeta serológica estéril para agregar 5 mL de DMEM + a un vial de papaína; Calentado DMEM + se puede utilizar para disolver mejor la papaína. SuavementePipetear para mezclar la solución.
3. Utilice una micropipeta estéril para añadir 0,5 ml de DMEM + a un vial de ADNasa. Evite pipetear con fuerza mientras se hace la solución de DNasa, porque la DNasa es sensible a la desnaturalización por cizallamiento.
4. Transferir 2,5 ml de solución de papaína a un tubo de centrífuga estéril y añadir 125 μ l de la DNasa en el mismo tubo. Mezcle la solución invirtiendo suavemente el tubo de centrífuga tapado aproximadamente 8 veces.
5. Usando una pipeta estéril de diámetro ancho, retire el tejido del tubo que contiene el medio de almacenamiento y colóquelo en una placa estéril de 35 mm de Petri. Recoja lo menos posible. Utilice una pipeta estéril para quitar el mayor exceso de almacenamiento posible, sin quitar el tejido. El tejido no debe flotar en medio, pero debe estar húmedo.
6. Utilice dos cuchillas de bisturí estériles para picar el tejido. Utilice una pipeta serológica estéril para agregar 2,5 ml de la mezcla de ADNasa / papaína al tejido fino en la placa de Petri. Remueva suavemente la placa de Petri paraTodo el tejido está libre en la solución y no se adhiere al fondo del plato. Colocar el plato en una incubadora a 37 ° C durante 15 min.
7. En la biofunción, utilice una pipeta de transferencia estéril de ánodo ancho para transferir todos los medios y tejidos a un tubo estéril de criogenia de 5 ml. Coloque la punta de la misma pipeta de transferencia de diámetro ancho cerca de la parte inferior del tubo. Triturar suavemente lentamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10-15 veces.
8. Evite formar burbujas mientras se pipetea. Repita el proceso con una pipeta de transferencia de pequeño calibre hasta obtener una mezcla homogénea. Si el tejido no está disociado, tritura con una pipeta de 1.000 μl.
9. Añadir 2 mL de DMEM 5/5 calentado a la mezcla celular disociada. Cubra el tubo de centrífuga mientras esté en la biofilia. Mezclar suavemente por inversión. Centrifugar a aproximadamente 573 xg durante 5 min a temperatura ambiente (20-25 ° C).
10. En la biofunción, utilice una pipeta serológica estéril para eliminar y descartar todo el sobrenadante, sin romper elbolita. Utilice una pipeta estéril para agregar 1 mL de DMEM 5/5 calentado al gránulo en el tubo para volver a suspender las células. Utilice una pipeta de transferencia estéril de pequeño calibre para romper el gránulo, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo hasta que la mezcla sea homogénea.
    NOTA: Evite formar burbujas mientras pipetea. Si se recoge muy poco tejido, añada sólo 0,5 ml de DMEM 5/5.
11. Dentro de la biofundidad, utilice una pipeta estéril para transferir 10 μL de la suspensión celular a un tubo de microcentrífuga. Fuera de la biofundidad, añada 10 μl de azul Trypan a los 10 μl de suspensión celular en el tubo de microcentrífuga.
    NOTA: Este paso no requiere esterilidad.
12. Cargar 10 μL de la suspensión de células azules Trypan en un chip hemocitómetro desechable para contar las células.

6. Plating Cells

1. En la biofundidad, use una micropipeta estéril para transferir 50 μl de suspensión celular al centro de cada matriz y cada placa de Petri de control. Utilice un piPunta de pette por plato. Asegúrese de colocar las celdas exactamente en el centro de la matriz. Vuelva a humedecer el papel de seda del laboratorio que estaba en el plato con agua estéril, o coloque nuevo papel de seda en cada plato. Cubrir los platos.
2. Colocar las cápsulas de Petri cubiertas en un incubador ajustado a 37 ° C y 10% de CO ₂ durante 3-4 h.
3. En la biofundidad, agregue suavemente 1 mL de DMEM 5/5 calentado a cada MEA.
   NOTA: Evite lavar las celdas lejos de la matriz central al agregar el medio (¡importante!). Con mucho cuidado, use una micropipeta estéril para agregar una gota a la vez alrededor de los bordes interiores.
4. Coloque un tapón que contenga una membrana FEP permeable a los gases en cada MEA. Regrese a la incubadora durante dos días.
   NOTA: La tapa previene la contaminación y la evaporación. Siga la técnica aséptica, secando las tapas en la biofundidad con etanol 100% antes de ponerlas en el MEA. Los cultivos deben estar cubiertos dentro de la biofundidad y deben permanecer tapados en todo momento.

7. PrincipalesMantener las Culturas

1. Después de dos días, realice un reemplazo completo del medio con DMEM + calentado.
   1. Transfiera sólo unos cuantos platos de la incubadora a la biofundidad a la vez para evitar estresar las culturas durante demasiado tiempo.
   2. Utilice una micropipeta estéril de 1 ml para extraer todo el medio del plato colocando cuidadosamente la punta de la pipeta en la pared interior del plato, evitando tocar las células en el centro. Utilice solamente una punta de pipeta por plato para evitar la propagación de contaminación.
   3. Utilice una micropipeta estéril para dispensar 1 mL de DMEM + caliente, colocando cuidadosamente la punta de la pipeta en la pared interior del plato.
2. Realice 50% de cambios de medio con DMEM + calentado, como se describió anteriormente, 2-3 veces por semana y con no más de 4 días entre las comidas.
   1. Utilice una micropipeta estéril de 1 ml para extraer 500 μl de medio del plato. Utilice una micropipeta estéril para dispensar 500 μl de DMEM + caliente. <Li

8. Inspecciones visuales y grabación

1. Inspeccione las muestras de platos cada dos días bajo un microscopio para buscar la cobertura de la célula sobre la matriz (utilizando aumentos de 4X y 10X) y la contaminación (usando aumento de 20X), ya sea bacteriana o fúngica.
   NOTA: La Figura 3a muestra un ejemplo de cobertura celular óptima, mientras que la Figura 3b muestra un cultivo con una pobre densidad celular.
2. Dos semanas después del chapado, pruebe una muestra de los platos MEA para la actividad espontánea. Registro de MEAs, como se describe a continuación, durante 3-5 min. Los picos serán detectados si la actividad está presente ( Figura 4 ).
   NOTA: Depende del experimentador determinar cuándo comenzar las pruebas basándose en el tipo de experimento y la hipótesis investigada.
   1. Para registrar la actividad en un MEA, utilice el siguiente equipo: fuente de alimentación, amplificador, headstage / preamplificador, El controlador de temperatura y el generador de estimulación (ver la tabla de materiales y la Figura 5 ).
   2. Antes de sacar los cultivos de la incubadora, enchufe el controlador de temperatura y encienda el sistema encendiendo la fuente de alimentación (según las instrucciones del fabricante), permitiendo que la placa de base calentada del preamplificador alcance 35 ° C.
   3. Coloque el cultivo tapado en el preamplificador para que la línea negra en el pozo MEA se alinee con la tierra de referencia. Asegúrese de que los pines del preamplificador estén alineados, de que la parte superior del preamplificador esté asegurada y de que la tapa de cultivo esté todavía encendida.
   4. Una vez que el cultivo se coloca en la placa, desactive la opción "Cambiar MEA" en el software de adquisición de datos (consulte la tabla de materiales para los nombres de software y las guías de usuario). Además, desmarque la casilla "Blanking" antes de realizar grabaciones.
   5. Seleccione "Descargar" en "MEA_Select" después de tLa cultura se coloca en el sistema. Compruebe que el programa muestre "Descargar OK" antes de continuar.
   6. Pulse "Start" en el entorno del software para comenzar a visualizar las señales. En la ventana principal, seleccione: "Spikes" → "Detección" → "Automático", cambie el valor "Std Dev" a "5" y haga clic en "refrescar" para restablecer el umbral.
      NOTA: La ventana "Spikes" muestra picos que pasaron el umbral.
   7. En la ventana principal, seleccione "Grabadora" → "Grabadora" → "Examinar". Cambie la ruta y el nombre del archivo para identificar la fecha, hora, plato y experimento. Ajuste el límite de tiempo ( por ejemplo, a 5 min). Haga clic en "Detener", "Grabar" y "Reproducir". Tenga en cuenta que la grabación se detiene automáticamente.
   8. Abra el software de estimulación. Seleccione "Grabadora" → "Grabadora" → "Examinar" para crear un archivo yE límite Haga clic en "Detener", "Grabar" y "Reproducir" para grabar de nuevo. Haga clic en "Descargar e iniciar" (en el software de estimulación) para que la estimulación se entregue al plato.
   9. Seleccione el botón "Cambiar MEA" en el control de software para cambiar los platos.
      NOTA: No mantenga el cultivo fuera de la incubadora por más de 30 minutos a la vez sin un sistema para mantener una atmósfera de CO ₂ alrededor del cultivo. Si se requieren sesiones de grabación más largas, utilice un adaptador comercial para suministrar CO ₂ .

9. Redes de Formación

NOTA: La Figura 6 muestra una descripción general de los pasos 9.1-9.3, descritos a continuación.

1. Registre una línea de base de 5 minutos de actividad espontánea del cultivo celular (como se describe en el paso 8). Una vez que se ha establecido la línea de base, administrar una estimulación de sondeo de 5 minutos antes del entrenamiento consistente en un bifásico de 0,5 HzPulso con una duración de pulso de 200 μs y una amplitud de impulso de 900 mV ( Figura 7a ) a través de los electrodos de estimulación seleccionados, como se muestra en la Figura 8 (ver el manual del software en la tabla de materiales para detalles sobre cómo seleccionar los electrodos de estimulación).
2. Al completar la estimulación previa al entrenamiento, administrar un protocolo de "entrenamiento" a las redes usando los mismos electrodos que en la estimulación de sondeo. Entregar los trenes de alta frecuencia una vez cada 2 s, como se describe en Hamilton et al. ¹⁵ ( Figura 7b y Figura 7c ).
   NOTA: La señal de entrenamiento consta de 40 trenes de impulsos. Cada tren de impulsos consta de 100 pulsos bifásicos, con 4 ms entre pulsos, una duración de impulso de 200 μs y una amplitud de impulso de 900 mV.
3. Después de concluir el período de entrenamiento, administrar una estimulación de 5 min post-entrenamiento a las células,Idéntica a la estimulación previa a la formación. Una vez finalizada la estimulación post-entrenamiento, registre 5 min de actividad espontánea post-estimulación de la red (como se describe en el paso 8).
4. Utilizar un grupo de control separado de MEAs para tener en cuenta posibles cambios en la respuesta de la red debido a fluctuaciones naturales oa la no estacionariedad del sistema. Administrar el mismo protocolo experimental descrito anteriormente a esos grupos de control, con la excepción de que los grupos de control reciben un período de entrenamiento falso en el que no se administra una señal de entrenamiento real.

10. Análisis de datos

Nota: Los archivos de datos se guardan y luego se clasifican en unidades neuronales utilizando un software de clasificación propietario (consulte la tabla de materiales). Se utiliza una interfaz gráfica de usuario (GUI) personalizada para cargar las unidades y analizar los patrones de actividad en los cultivos, los intervalos entre ráfagas, la duración de la ráfaga y el histograma de tiempo posterior al estímulo (PSTH) (ver tabla de materiales). El PSTH esEl gráfico más importante a analizar, ya que muestra la actividad de la red en tamaños bin (de longitud variable), proporcionando así una representación visual de la respuesta de la red a la estimulación presentada.

1. Convierta los archivos de datos .mcd al formato .plx utilizando un software de clasificación propietario (consulte la tabla de materiales para los nombres de software y las guías de usuario). Exporte el archivo .plx a un nuevo archivo .plx dentro del mismo programa. Clasificar los canales en unidades neuronales ( Figura 9 ). Una vez finalizada la clasificación, exporte los datos como un archivo .nex.
2. Abra el archivo .nex en el software apropiado (consulte la Tabla de materiales ) y guárdelo como un archivo .mat que se analizará con la GUI hecha a medida, que está disponible gratuitamente (consulte Tabla de materiales ).
   NOTA: La interfaz gráfica de usuario (ver la tabla de materiales) traza PSTHs de acuerdo con la entrada del usuario ( es decir, población PSTH, PSTH promedio sesgado, o canal P individualSTH), lo que permite una visión general del experimento de estimulación y la comparación inmediata entre los archivos post y pre-estímulo. También traza el PSTHs inicial versus final, que compara la respuesta de la red con los primeros 6 y los 6 últimos estímulos. La interfaz gráfica de usuario realiza varias otras funciones, como la velocidad de pico, el intervalo entre picos, los picos por ráfaga, el intervalo entre ráfagas y la duración de la ráfaga, tanto para los archivos de estimulación como para los archivos con actividad espontánea.
3. Primero, seleccione un archivo .mat con variables que contengan trenes de punta y una variable que contenga el artefacto de estimulación; El script analizará los datos y la GUI principal aparecerá con un gráfico de PSTH a la derecha ( Figura 10 ).
   1. Haga clic en los botones de electrodos activos para ver el PSTH individual (en azul) en comparación con el PSTH promedio (en rojo).
      NOTA: Los electrodos activos serán coloreados para mostrar un mapa de calor, donde los valores más altos (más rojos) representan un mayorPico de PSTH, indicando una respuesta más fuerte a la estimulación.
   2. Seleccione una opción de análisis mediante el menú emergente. Seleccione el botón "Promedio sesgado" para seleccionar un subconjunto de electrodos y trazar el promedio de ese subconjunto; Esto es útil para comparar el comportamiento de la sub-red dentro de una cultura.
      NOTA: Hay varias opciones de análisis diferentes seleccionadas a través del menú emergente, y todas se explican en el botón "ayuda" del software.
   3. Seleccione el botón "Grabar gráfico" para guardar el gráfico actualmente mostrado como un archivo jpeg con alta resolución. Seleccione el botón "Tabla de datos" para exportar los datos a una hoja de cálculo.

Utilizando el procedimiento presentado aquí ( Figura 11 ) , los MEA de 60 canales colocados con células neuronales de ratón E17 se incubaron hasta que los cultivos cubrieron las matrices en una alfombra sana de células ( Figura 12 y Figura 3a ) . Después de 3 semanas de incubación a 10% de CO $ ₂ $ y 37 ° C, se comprobó la actividad espontánea de los cultivos utilizando un sistema de registro comercial (véase Tabla de Materiales ). La temperatura se mantuvo a 37 ° C durante el procedimiento de registro usando un controlador de temperatura, ya que la temperatura afecta a la actividad neuronal ya las velocidades de disparo.

Pruebas de actividad
Las redes espontáneamente activas normalmente presentan patrones de señales variables. Una cultura activa promedio puede registrar la actividad en unAproximadamente el 40% de los electrodos. De estos sitios de electrodos activos, casi la mitad registra señales espontáneas, con velocidades de disparo de 5 a 10 Hz. En la Figura 4a se muestra un gráfico raster representativo de la actividad espontánea. Las marcas indican las temporizaciones de los potenciales de acción registrados de 9 electrodos activos durante una ventana de 20 s, a una velocidad de adquisición de 25 kHz y un rango de filtro de paso de banda entre 300 Hz y 3 kHz. La Figura 4b muestra el ruido basal y la señal extracelular cruda filtrada durante 8 ráfagas de actividad antes del procedimiento de clasificación. Para separar los potenciales de acción del ruido, los umbrales para cada canal se ajustan a 5 veces la desviación estándar del ruido de la línea base y se calculan sobre una ventana de 500 ms 15 .

Antes del análisis, los picos registrados para cada electrodo se clasificaron sin conexión para distinguir entre fisioActividad lógica y artefactos de estimulación usando un algoritmo de k-means y análisis de componentes principales. Las señales que se habían identificado como respuestas fisiológicas se agruparon para crear una respuesta poblacional en cada electrodo ( Figura 13 y Figura 9 ) 15 .

Entrenamiento de redes neuronales con estimulación eléctrica
Las redes fueron entrenadas usando la estimulación eléctrica aplicada al cultivo directamente a través de los electrodos de MEA usando un generador de estímulo (véase la tabla de materiales). En este conjunto de resultados representativos, se utilizó una configuración en forma de "L" que constaba de 13 electrodos ( Figura 8 ), aunque se pueden aplicar muchas otras configuraciones. La estimulación de sondeo y entrenamiento se basó en parámetros definidos en Ruaro et al. 14 .

Inicialmente se estableció una línea de base registrando 5 minutos de actividad espontánea antes de la estimulación. Una vez que se estableció la línea base, se administró una estimulación de 5 min de pre-entrenamiento que consistía en un pulso bifásico de 0,5 Hz con una duración de pulso de 200 μs y una amplitud de impulso de 900 mV ( Figura 7a ) a través de los sitios de estimulación seleccionados ( es decir, -conformado). A continuación, se administró un protocolo de entrenamiento a las redes cada 2 s usando el mismo conjunto de electrodos. La señal de entrenamiento estaba compuesta por 40 trenes de impulsos, cada uno conteniendo 100 pulsos bifásicos, con un período entre pulsos de 4 ms, una duración de impulso de 200 μs y una amplitud de impulso de 900 mV ( Figura 7b y Figura 7c ). Este período de entrenamiento fue seguido por una fase de 5 minutos post-entrenamiento, similar a la estimulación previa a la formación. El protocolo fue entoncesConcluyó con un registro de 5 minutos de la actividad espontánea post-estimulación.

El mismo protocolo experimental se aplicó a un grupo control de cultivos para dar cuenta de las fluctuaciones naturales en la respuesta de la red. Sin embargo, la única diferencia en el protocolo de control fue la aplicación de un período de entrenamiento simulado, durante el cual no se administró ninguna señal de entrenamiento real.

Los análisis estadísticos de los conjuntos de datos ( es decir, entrenamiento versus control) se realizaron con un ANOVA unidireccional, con la variable "entrenamiento" como un factor entre sujetos. La latencia se utilizó como un factor dentro del sujeto. Si se encontró una interacción significativa, se realizó el procedimiento post-hoc de Tukey. Los resultados mostraron una respuesta de pre-entrenamiento dentro de los 20 ms post-estímulo, aunque el rango de actividad fue inconsistente después de la primera respuesta. Sin embargo, la actividad de post-entrenamiento exhibió no sólo ar Esponse dentro de los primeros 20 ms post-estímulo, como se vio durante el pre-entrenamiento, pero también exhibió actividad significativa 30-50 ms post-estímulo ( Figura 14 y Figura 15 ] [ 15] . También hubo una correlación estadísticamente significativa de "frecuencia de pico" versus "tiempo después de estímulo" y de "fiabilidad de pico" versus "tiempo después de estímulo". La "fiabilidad del punto" se puede definir como la probabilidad de ver una respuesta de la red a una estimulación, donde a cada estímulo se le asigna un valor máximo de 1. La figura 16 muestra casi un aumento del 50% en la frecuencia del pico, así como un 30 -50% de aumento en la fiabilidad de los picos de las redes entrenadas en comparación con el control en el rango de 20-50 ms post-estímulo. Estos resultados sugieren que el entrenamiento cambió fundamentalmente la dinámica de la red.

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Figura 1 : Herramientas y materiales utilizados para la eliminación de embriones. ( A ) Bandeja llena de hielo. ( B ) Platos de Petri llenos de frío L-15 "slush". ( C ) Toalla de papel. ( D ) Botella de spray con etanol al 70%. ( E ) Pinzas finas (x2). ( F ) Pequeñas tijeras quirúrgicas. ( G ) Pinza del pulgar con punta roma. ( H ) Tijeras grandes. ( I ) Bolsa para el cuerpo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 : Herramientas y materiales utilizados para la extracción del cerebro. Un B ) Placa de Petri que contiene cabezas de embriones. ( C ) Tubo de centrífuga con soporte de almacenamiento. ( D ) Plato de Petri de cristal invertido. ( E ) Papel de filtro autoclavado. ( F ) con 70% de etanol. ( G ) Pipeta de plástico. ( H ) tijeras de iris. ( I ) Pinzas finas. ( J ) Espátula delgada de dos extremos. ( K ) Toalla de papel. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3 : Culturas óptimas versus no óptimas. ( A ) muestra una alfombra sana de células que cubren las matrices, en contraste con ( B ),En los que existe una proliferación celular deficiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4 : Resultados representativos de la actividad espontánea. ( A ) Trama raster representativa de la actividad espontánea. Las marcas indican los potenciales de acción registrados de 9 electrodos activos durante una ventana de 20 s a una velocidad de adquisición de 25 kHz y un rango de filtro de paso de banda entre 3 kHz y 300 Hz. ( B ) potencial de acción extracelular filtrado representativo de un sitio activo. Figura modificada a partir de la referencia 15 . Haga clic aquí para ver una versión más grandeN de esta cifra.

Figura 5 : Configuración de grabación. ( A ) Generador de estimulación. ( B ) Regulador de temperatura. ( C ) Fuente de alimentación. ( D ) Amplificador. ( E ) Headstage / preamplificador. ( F ) MEA tapado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6 : Representación esquemática del protocolo de entrenamiento eléctrico. Registre una línea de base inicial durante 5 min y una estimulación de la sonda durante 3 min. Aplicar estímulos tetánicos Encendido durante 90 s, que no se registra. Aplicar y registrar una segunda estimulación de la sonda durante 3 min y una línea de base final durante 5 min. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7 : Sondar los parámetros de la señal de estimulación y entrenamiento. ( A ) La estimulación de palpación consiste en impulsos bi-fásicos de ± 900 mV administrados a una frecuencia de 0,5 Hz. ( B ) Los trenes de impulsos consisten en 100, ± 900 mV pulsos bi-fásicos a una frecuencia de 250 Hz. ( C ) La señal de entrenamiento consta de 40 trenes de impulsos administrados cada 2 s. Figura modificada a partir de la referencia 15 ."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8 : Representación de la configuración de la forma "L". Los cuadrados representan electrodos individuales de un MEA. Los cuadrados azules indican los electrodos usados ​​para la estimulación, mientras que todos los otros se utilizan para la grabación. Figura modificada a partir de la referencia 15 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9 : Distinguir las unidades de los artefactos de ruido y estimulación. Los varios paneles superiores ( A - D ) La forma de onda amarilla es la única unidad detectada aquí. ( E ) La forma de onda verde es la única unidad. ( F ) Ejemplo de un canal que fue grabado de un electrodo que también se usó para la estimulación, donde no se pueden detectar unidades razonablemente debido a la saturación del amplificador. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10 : Histograma de tiempo post-estímulo (PSTH). Una interfaz gráfica de usuario (ver Tabla de Materiales ) representa los PSTH de acuerdo con la entrada del usuario ( es decir, PSTH de la población, PSTH promedio sesgado, o individualCanal PSTH), lo que permite una visión general del experimento de estimulación y para la comparación inmediata entre los archivos post y pre-estímulo. También traza el PSTHs inicial versus final; Esto compara la respuesta de la red a los 6 primeros y los 6 últimos estímulos. La interfaz gráfica de usuario realiza varias otras funciones, como la velocidad de pico, el intervalo entre picos, los picos por ráfaga, el intervalo entre ráfagas y la duración de la ráfaga, tanto para los archivos de estimulación como para los archivos con actividad espontánea. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11 : Descripción general de la preparación y el recubrimiento celular. ( A ) Se eutanasia un ratón embarazado E17 con CO 2 . ( B ) El ratón es decapitatY el útero es removido. ( C ) Los embriones son liberados y decapitados. ( D ) El cerebro se extrae de cada embrión y se extraen los lóbulos frontales. ( E ) Las células están disociadas. ( F ) Las células disociadas se suspenden en medio. ( G ) Las celdas suspendidas están chapadas en matrices de múltiples electrodos de 60 canales (MEAs). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12 : Cultivos neuronales colocados sobre matrices de microelectrodos. Las neuronas de ratón embrionarias se colocan en placas de 60 canales MEA, lo que permite el registro simultáneo de la actividad neuronal a través de la red de cada electrodo. (Figura modificadaDe la referencia 15 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13 : Programa de clasificación utilizado para ordenar las formas de onda de cada canal. El programa de clasificación (véase Tabla de Materiales ) carga un archivo de datos y muestra todas las unidades adquiridas inicialmente para cada canal. Uno de varios métodos se selecciona para asignar señales a unidades específicas. En este ejemplo, se seleccionó el algoritmo de agrupación de k-medios y se identificó la unidad amarilla (denominada "unidad a" en la ventana inferior). Otro programa (véase Tabla de materiales ) se utiliza para exportar el archivo .nex en un archivo .mat, que es el archivo de entrada para la GUI personalizada (consulte Tabla de Materiales y Figura 10 ). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 14 : Actividad de red alterada en respuesta a la estimulación después de un período de entrenamiento. Trama raster representativa de la actividad de ocho electrodos. La línea roja vertical indica el tiempo del estímulo, y las marcas negras indican los potenciales de acción. En el pre-entrenamiento ( A ), hay una respuesta inmediata al impulso de estímulo a través de los canales. En el post-entrenamiento ( B ), la red muestra una respuesta de actividad más prolongada, así como la respuesta inmediata a la estimulación [ 15] ..jove.com / files / ftp_upload / 55726 / 55726fig14large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 15 : Las redes entrenadas han alterado significativamente las frecuencias de punta. La frecuencia de la saturación de la red para las redes de control se calcula integrando el número de picos de más de 50 ms inmediatamente después de cada estimulación y división por ese período. Se muestra el promedio de 12 redes entrenadas y 10 de control (las barras de error indican el error estándar de la media). El asterisco (*) indica una diferencia estadística ( p-valor <0,05) entre los dos conjuntos de datos. Figura modificada a partir de la referencia 15 . Haga clic aquí para ver unaVersión ger de esta figura.

Figura 16 : Las respuestas mediadas sinápticamente se modifican significativamente en redes entrenadas. ( A ) La fiabilidad de los picos, medida en bins de 10 ms y normalizada a las redes de control, no muestra cambios para la activación directa de neuronas cerca de electrodos (0-20 ms). Por lo tanto, no hay diferencia estadística entre los controles y las redes entrenadas para esos contenedores. Por otro lado, las respuestas de mayor latencia (30-50 ms), son mediadas sinápticamente, lo que indica que este método proporciona una investigación más detallada de la fiabilidad que en la Figura 15 , anterior. ( B ) La frecuencia de pico poblacional repite el comportamiento de la fiabilidad y no muestra modificación para la activación directa (0-20 ms), mientras que una estadísticaSe encuentra una diferencia estadísticamente significativa para las respuestas a más largo plazo (30-50 ms). Este comportamiento es consistente con los resultados promediados en la figura 15 anterior. Las barras de error son el error estándar de la media, calculado para 10 redes de control y 12 redes entrenadas. (*) Valor p <0,05; (**) valor p <0,001. Figura modificada a partir de la referencia 15 . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Preparación de PDL - Lista de Materiales y Reactivos.

Tabla 2: Preparación de Laminina - Lista de Materiales y Reactivos.

Tabla 3: Preparación del medio de almacenamiento - Lista de materiales y reactivos.

Tabla 4: Preparación del medio DMEM 5/5 - Lista de materiales y reactivos.

Tabla 5: Preparación del medio DMEM + - Lista de materiales y reactivos.

Tabla 6: Disociación de células - Lista de materiales y reactivos.

Los autores no tienen nada que revelar.