En este método, las células musculares primarias humanas se cultivan in vitro para obtener miotubos diferenciados y se miden las tasas de captación de glucosa. Proporcionamos un protocolo detallado para cuantificar las tasas en los estados basales y estimulados con insulina usando [3H] 2-desoxi-D-Glucosa radiomarcada.
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Artículo de método
Medición de la Absorción de Glucosa y Respuesta a la Estimulación de la Insulina en
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Resumen
Resumen
El músculo esquelético es el mayor depósito de glucosa en mamíferos y contribuye en gran medida a la homeostasis de la glucosa. Evaluación de la sensibilidad a la insulina de las células musculares es de gran importancia para todos los estudios dedicados a explorar el metabolismo de la glucosa muscular y la caracterización de las alteraciones metabólicas. En las células musculares, las proteínas del transportador de glucosa tipo 4 (GLUT4) se trasladan a la membrana plasmática en respuesta a la insulina, permitiendo así la entrada masiva de glucosa en la célula. La capacidad de las células musculares para responder a la insulina mediante el aumento de la tasa de captación de glucosa es una de las lecturas estándar para cuantificar la sensibilidad de las células musculares a la insulina. Los miotubos primarios humanos son un modelo in vitro adecuado, ya que las células mantienen muchas características del fenotipo del donante, incluyendo la sensibilidad a la insulina. Este modelo in vitro también es adecuado para la prueba de cualquier compuesto que pueda afectar la capacidad de respuesta a la insulina. Las mediciones de la tasa de captación de glucosa en myotubes diferenciados reflejanSensibilidad a la insulina.
En este método, las células musculares primarias humanas se cultivan in vitro para obtener miotubos diferenciados, y se miden las tasas de captación de glucosa con y sin estimulación con insulina. Proporcionamos un protocolo detallado para cuantificar las tasas de transporte de glucosa pasiva y activa usando [3H] 2-desoxi-D-Glucosa radiomarcada ([3H] 2dG). Se proporcionan métodos de cálculo para cuantificar las tasas basales activas y estimuladas con insulina, así como el doble de estimulación.
Introducción
El músculo esquelético es el mayor depósito de glucosa en mamíferos y contribuye en gran medida a la homeostasis de la glucosa. Este tejido sensible a la insulina es el sitio primario de la captación de glucosa que se desencadena por la estimulación de insulina [ 1] .
En la diabetes tipo 2, la resistencia a la insulina se observa en varios tejidos, incluyendo el músculo esquelético, y conduce a una concentración de glucosa sanguínea por encima de lo normal. Por lo tanto, es de gran relevancia determinar el nivel de sensibilidad a la insulina de este tejido y sus células, ya sea que se pretenda caracterizar un defec....
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Protocolo
1. Preparación de medios y soluciones de cultivo celular
- Preparación de medios de cultivo
- Preparar el medio de proliferación (PM) suplementando el medio F-10 de Ham con glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final), 2% de suero de ternera fetal (FCS) y suero al 2%.
- Preparar el medio de diferenciación (DM) mediante la adición de medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con glutamina (2 mM), penicilina / estreptomicina (5 μg / mL final) y FCS al 2%.
- Preparación de soluciones de captación de glucosa
Precaución: El manejo de materiales radiactivos sólo es perm....
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Resultados
El día 3, los mioblastos llegan a confluencia ( Figura 1A ). Los mioblastos en esta etapa son típicamente mononucleados. Se cambió el medio y al día 8 se completó la diferenciación ( Figura 1B ) (sección de protocolo 2). Después de 5 días de diferenciación, los miotubos están alineados y típicamente polinucleados. Los miotubos primarios humanos se sometieron a un tratamiento con palmitato o BSA sólo antes de la medición de la ta.......
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Discusión
La captación de glucosa es una medida biológica clave para probar activadores o inhibidores en el cultivo celular y cómo afectan el uso de glucosa, y la capacidad de la célula para responder a la insulina. El método descrito aquí ha demostrado ser rápido y fiable y ha sido ampliamente utilizado en muchos estudios utilizando miotubos primarios de sujetos sanos y / o pacientes afectados metabólicamente 6 , 7 , 10 ,
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores reconocen a Anne Charrié en el servicio de Radiobiología (Hospital Lyon-Sud) y en Fond National Suisse (FNS) por su apoyo financiero.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Célula muscular primaria humana | Preparación interna a partir de biopsias de músculo esquelético humano Preparación | interna a partir de biopsias de músculo esquelético humano | Si no está disponible, use una fuente comercial |
| Célula muscular primaria humana | Promocell | C-12530 | Debe cultivarse con medios asociados C23060 y C23061 |
| Placa de 6 pocillos | Corning | 356400 | BioCoat Placas de colágeno I multipocillos |
| Ham's F10 | Dutscher | L0145-500 | 1 g/L de glucosa |
| Glutamina | Dutscher | X0551-100 | |
| penicilina/estreptomicina 100x | Thermo fisher scientific | 15140122 | |
| Sustituto de suero UltroserG | Pall France | 15950.017 | sustituto de suero en texto |
| DMEM baja glucosa | Dutscher | L0064-500 | 1 g/L de glucosa |
| Suero fetal para terneros | Eurobio | CVFSVF00-01 | |
| solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco | Dutscher | L0625-500 | contiene mg2+ (0,5 mM) y Ca2+ (0,9 mM) |
| Solución de insulina humana | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 2-desoxi-D-glucosa | Sigma-Aldrich | D6134 | |
| Albúmina bovina | euromedex | 04-100-812-E | |
| sin ácidos grasos BSA | Roche | 10.775.835.001 | |
| palmitato | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Desoxi-D-glucosa, 2-[1,2-3H (N)] | PerkinElmer | NET328A001MC | Actividad específica: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq |
| Citocalasina B | Sigma-Aldrich | c2743 | |
| PICO PRIAS VIAL 6 mL | PerkinElmer | 6000192 | |
| ultima gold MW CA | PerkinElmer | 6013159 | líquido de centelleo |
| bê Contador de ta | PerkinElmer | 2900TR |
Referencias
- Stump, C. S., Henriksen, E. J., Wei, Y., Sowers, J. R. The metabolic syndrome: role of skeletal muscle metabolism. Ann Med. 38 (6), 389-402 (2006).
- DeFronzo, R. A., Tobin, J. D., Andres, R. Glucose clamp technique: a method for quantifying insulin secretion and resistance. ....
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Reimpresiones y permisos
