Artículo de método

Agujas personalizadas para microinyecciones en el cerebro de roedor

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DOI:

10.3791/55751

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24 de enero de 2018

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1Department of Medical Sciences, Section of Pharmacology, and National Institute of Neurosciences, University of Ferrara, 2Laboratory for the Technologies for Advanced Therapies (LTTA), University of Ferrara

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Describimos aquí un protocolo para la microinyección en el cerebro de roedor que utiliza agujas de cuarzo. Estas agujas no producen daño tisular detectable y asegurar la entrega confiable incluso en regiones profundas. Además, pueden ser adaptados a las necesidades de investigación por diseños personalizados y se pueden volver a utilizarse.

Resumen

Microinjertos se han utilizado durante mucho tiempo para la entrega de medicamentos o toxinas dentro de áreas específicas del cerebro y, más recientemente, se han utilizado para entregar productos de terapia génica o celular. Desafortunadamente, las técnicas de microinyección actuales usan agujas de acero o vidrio que son subóptimas por múltiples razones: en particular, agujas de acero pueden causar daño tisular, y agujas de vidrio pueden doblar cuando baja profundamente en el cerebro, falta la región objetivo. En este artículo se describe un protocolo para preparar y utilizar agujas de cuarzo que combinan un número de características útiles. Estas agujas no producen daño tisular detectable y, siendo muy rígido, asegurar una entrega confiable en la región del cerebro deseado aun cuando estén usando coordenadas profundos. Por otra parte, es posible personalizar el diseño de la aguja haciendo varios agujeros del diámetro deseado. Múltiples orificios facilitan la inyección de grandes cantidades de solución dentro de un área más grande, mientras que grandes agujeros facilitan la inyección de las células. Además, estas agujas de cuarzo se pueden limpiar y volver a utilizarse, tal que el procedimiento se convierte en rentable.

Introducción

Microinjertos se han utilizado durante mucho tiempo para la entrega de compuestos farmacológicamente activos para modular la actividad neuronal en áreas específicas del cerebro. Además, se han utilizado para inyectar toxinas cerca de poblaciones neuronales particulares, imitar neurodegenerativas eventos característicos de ciertas enfermedades, por ejemplo 6-hidroxi-dopamina en el sistema de dopamina nigroestriatal para imitar la enfermedad de Parkinson 1 , 2 o la inmunotoxina 192 IgG saporin a lesión del sistema colinérgico3. Más recientemente, se han utilizado procedimientos de microinyección para ofrecer injertos vectores o células virales para la terapia génica o celular cerebral experimental trastornos4,5.

El tipo clásico de agujas empleadas en estos estudios se hace del acero inoxidable. Aunque fácil y práctico uso, agujas de acero tienen una serie de problemas6: son relativamente grandes y pueden causar daño a los tejidos, con pérdida de la barrera hemato - encefálica y la activación de astrocitos; por otra parte, pueden producir perforación del tejido cerebral que se mete en la aguja, creando un obstáculo o incluso completamente evitando el flujo de la solución deseada. Más recientemente, las agujas de vidrio preparados ad hoc de los capilares se han introducido en usan7,8. Estos no causan activación daño ni astrositos de tejido importante, pero son relativamente flexibles y pueden doblar cuando en estructuras profundas, reduciendo la precisión de la localización (observaciones personales).

Por lo tanto hay una necesidad de reducir tanto como posibles daños (sobre todo al realizar experimentos para curar daños) aumentando la precisión y la reproducibilidad (es decir, asegurar que se entrega toda la solución y asegurar la correcta localización). Por otra parte, sería deseable utilizar diseños diferentes para asegurar la distribución óptima de la solución inyectada en áreas cerebrales con diferentes geometrías. En este artículo se describe un protocolo para preparar y utilizar agujas de cuarzo de microinyecciones en el cerebro de roedor. Debido al alto punto de fusión, cuarzo tubos capilares no se tiró en un extractor convencional y por lo tanto, no se han utilizado en el pasado para generar las agujas. Cuarzo, sin embargo, ofrece algunas ventajas importantes sobre vidrio, en particular de alta rigidez y ruptura de resistencia9. Debido a su rigidez, agujas de cuarzo son ideales para las inyecciones en las regiones del cerebro ventral. Debido a su alta resistencia a la rotura puede ser modelados para incluir múltiples agujeros, obtener diseños que pueden resultar más efectivos aún cuando las regiones del cerebro con geometrías complejas10.

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Protocolo

Todos los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité de ética de la Universidad de Ferrara para animales de experimentación y por el Ministerio italiano de salud. La llegada (investigación Animal: presentación de informes en Vivo experimentos11) se han seguido las directrices.

1. preparación de agujas de cuarzo

  1. Limpie y esterilice los tubos capilares de cuarzo (véase Tabla de materiales), colocando de 5 min en agua destilada, 5 minutos en el 99% de etanol y 5 min en éter dietílico.
  2. Salir de los capilares debajo de la campana por al menos 1 h a dejar que se seque completamente.
  3. Preparar las agujas utilizando un tirador láser según los parámetros que permiten la producción de una aguja lo suficientemente larga, suficientemente fina, dependiendo de las necesidades individuales.
    Nota: Utilizamos un tirador láser (véase Tabla de materiales). Utilizar un programa de dos líneas para tirar. La primera línea utiliza alta potencia, la longitud de exploración más grande (correspondiente al valor de filamentos) y no hay fuerza de tracción. Esta combinación de parámetros conduce a la fusión de la porción más grande del tubo capilar con la velocidad más baja de la extensión, permitiendo la conformación de una aguja larga con interno y externo de gran tamaño y reducido caña. De esta manera, la aguja conserva una alta resistencia mecánica y diámetro interno ancho que permite el paso de células o partículas virales sin obstrucción. Velocidad y retardo de esta línea de programa deberían dejar la extensión capilar antes de que la punta sea demasiado pequeña y larga, falta la mecánica requerida y las características de forma. La segunda línea del programa tracción se ejecuta automáticamente, una vez que los enfría el cuarzo (5 s). Parámetros de potencia, fuerza de tracción y filamento son funcionales para cortar una punta con la menor longitud posible de la punta y caña fuerte, evitando la separación de las dos agujas con una ruptura de la punta. Habitualmente, con nuestros equipos utilizamos las siguientes: (a) línea 1 = potencia 990, filamento 5, velocidad 130, retardo 110, tire 0; (b) línea 2 = potencia 970, filamento 3, velocidad 0, retraso 70, tire de 0.
  4. Poner las agujas en un plato de Petri previamente limpiados con etanol 70%.
    1. Cubrir el plato con una capa de parafina de plástico.
  5. Cortar los tubos capilares en el disector de micro.
    1. En la puesta en marcha, que el láser ejecutar un proceso de autocalibración para verificar la potencia y la energía suministrada. Luego configure los parámetros de corte.
      Nota: Utilizamos un disector de micro (véase Tabla de materiales) y los siguientes parámetros: energía del pulso (63 μj), diámetro de la viga del laser del 20% de la máxima apertura del laser (abertura máxima: 1,0 μm) y la velocidad de corte de 10% de la velocidad máxima (máxima velocidad: 30 μm/s).
    2. Firmemente fijar la aguja en la mesa del microscopio y colocar su punta en el centro de la pantalla del ordenador.
    3. En la barra de menú, haga clic en el icono de lápiz y utilizar para dibujar una marca para el corte por láser de la aguja.
      Nota: El corte debe ser en un ángulo de unos 45 ° con respecto a la superficie de la aguja.
    4. En la función de barra lateral, seleccione la bandera que contiene el botón "START CUT" para permitir que el láser cortar el lugar marcado previamente.
    5. Si es necesario, cortar agujeros lado repitiendo los procedimientos descritos en 1.5.2-3; no hay necesidad para volver a colocar la aguja (figura 1).
  6. La corte de limpieza.
    1. Conecte la aguja a una bomba de vacía a través de un tubo de plástico.
    2. Encienda la bomba y ajustar manualmente el caudal hacia adelante a velocidad moderada (3 μl/min).
    3. Aspirar el etanol al 99% primero y luego el agua destilada para quitar impurezas debido a corte.
    4. Aspire el etanol al 99% para facilitar el secado.
      Nota: Cada paso debe durar al menos 3 minutos.
  7. Almacenar las agujas en un plato de Petri debidamente cubierto hasta el día de la cirugía.
  8. Las agujas pueden ser reutilizadas; al final del experimento, limpiar con lejía y el etanol para eliminar los residuos de tejido solución y posible. Para una limpieza más completa, poner las agujas en un recipiente de almacenamiento de información de micropipeta con la punta hacia abajo, llene la jarra con agua destilada hasta que las puntas están cubiertas, hervir durante 1,5 minutos quitar cualquier tejido sobrante y luego lave con etanol.

2. procedimiento

  1. Siguiendo las instrucciones proporcionadas por el manual del usuario bomba, seleccione el menú de configuración para calibrar la bomba según el diámetro/volumen de la jeringa de microinyección y la tasa de flujo de 0,3 μl/min.
  2. Llene una jeringa de 10 mL (equipada con una aguja embotada (p. ej., aguja de Hamilton, 30 G) y un tubo de politetrafluoroetileno corto) con agua estéril y utilizarla para llenar la jeringa de la microinyección (después con mucha precaución quitar el pistón) y la inyección kit de piezas de montaje para la bomba manual microinyección (MMP).
    Nota: El kit MMP se utiliza para montar firmemente la aguja en el marco estereotáctico (figura 2). El kit incluye: un tubo de politetrafluoroetileno, acoplamiento luer para tubería, soporte de pipeta y juntas para pipetas con diferentes diámetros exteriores.
  3. Conectar la aguja con el kit MMP.
    1. Ras más agua en todo el sistema a través de la jeringa de 10 mL y comprobar si el agua sale de la aguja.
      Nota: Asegúrese de eliminar cualquier burbuja de aire dentro del sistema repitiendo los pasos de relleno.
  4. Desconecte la jeringa de 10 mL de la jeringa de microinyección empujando lentamente el émbolo para dejar una gota de agua en la parte superior de la jeringa de microinyección. Inserte el émbolo en la jeringa de microinyección.
  5. Conecte la jeringa de microinyección en la bomba y ajustar la velocidad de flujo de 0,3 μl/min.
    Nota: Espere hasta que una gota que se escapa de la punta de la aguja y luego dejarlo ir para otro 3 minutos.
  6. Ajuste el flujo de 0,1 μl/min e iniciar el procedimiento de la cirugía. La bomba debe ser permanente mientras se realiza la cirugía.
    Nota: Para los experimentos reportados en este artículo, utilizamos ratas Sprague Dawley macho de 300 g (3 meses de edad). Sin embargo, el procedimiento es aplicable a otras especies de ratones, en particular.
  7. Inducir la anestesia general utilizando un método aprobado por las regulaciones locales.
    Nota: Utilizamos una mezcla de inyección intraperitoneal (i.p.) de 85 mg/kg ketamina y 8 mg/kg xilacina para 20-50 min de anestesia. Es importante que pinches cola o dedo del pie se utilizan para asegurar que el animal está totalmente sedado. Nivel de anestesia y signos vitales básicos son evaluados antes de la cirugía comienza y controlar cada 10 minutos mientras se realiza la cirugía. Temperatura del cuerpo del animal se mantiene constante antes, durante y después de procedimientos quirúrgicos con un agua recirculación de almohada. Los animales son monitoreados hasta que se recuperó completamente (por ejemplo, son verticales y ambulatoria). Además, los animales reciben analgésicos (tramadol, 5 – 7 mg/kg i.p.) postoperatoriamente cada 24 h durante tres días.
    1. Afeitarse la cabeza del animal y preparar adecuadamente el campo quirúrgico para cirugía aséptica. Realizar una exfoliación de dos etapas con solución a base yodo (Betadine) seguido de etanol al 70%. Además, para mantener la asepsia, envolver el sitio quirúrgico con un paño quirúrgico (en el vídeo se ha omitido para fines de demostración).
  8. Colocar la rata en el marco estereotáxicas sobre un agua recirculación de manta. Para proporcionar alivio del dolor adicional, en el sitio de la cirugía se aplica solución de lidocaína 0.5% (no sobrepasar los 7 mg/kg). Pre esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos utilizando una desinfección del grano esterilizador o líquido frío por immerging del equipo en cualquiera de los dos 2% glutaraldehído más 7.05% de fenol (Sporodicin o Cidex) seguido de enjuague con agua estéril o solución salina. La desinfección debe realizarse incluso entre los procedimientos. Hacer un corte longitudinal sobre el cráneo usando un escalpelo esterilizado. Ser suave para evitar el sangrado excesivo. Abrir el cuero cabelludo con una espátula plana y aplicar clips quirúrgicos en las aletas de la piel para mantenerla abierta. Muy suavemente, separar el periostio para exponer el bregma y el área del cráneo a través del cual se insertará la aguja.
  9. Monte el brazo en el marco de estereotáctica (mientras que el flujo es continuo) y mover la punta de la aguja exactamente encima de bregma, prestando atención de no romper la punta. Anotar las coordenadas anteroposterior y mediolateral de la bregma y traducir a las coordenadas deseadas. Guiados por un estereomicroscopio, baje la aguja hasta que su punta casi toque el cráneo, marcar la perforación punto después de levantar un poco el brazo estereotáctica.
  10. Taladro (taladro punta Ø: 0.8mm; taladro velocidad: 1.000 rpm) el cráneo en el punto marcado. Debe tener cuidado de no penetrar la duramadre durante el procedimiento de perforación. Durante la perforación, goteo de solución salina estéril para evitar el daño del hueso y la necrosis.
  11. Cortar un pequeño trozo de la película de parafina de plástico y colóquelo en el cráneo. Usando la pipeta de 10 μl, haga una gota de la solución que se inyecta en la película de plástico de la parafina. Parar la bomba, un poco recuperar el empuje de la bomba y crear una pequeña burbuja de aire en el tubo capilar tirando suavemente el émbolo de la jeringa de microinyección.
  12. Baje el brazo estereotáctico hasta la punta de la aguja alcance la caída. Dibujar la muestra tirando (muy lentamente) el pistón de la jeringa de microinyección, evitando cualquier formación de burbujas. Vuelva a colocar el empujador bomba en contacto con el pistón y encienda la bomba con un caudal de 0,3 μl/min esperar hasta la formación de una gota (unos minutos) antes de proceder al siguiente paso.
    Nota: En el presente experimento ejemplo líquido cefalorraquídeo artificial (aCSF) fue infundida en el cuerpo estriado (AP: + 1,5, ML: ±2.7; DV:-5.0) y en el hipocampo dorsal (AP: -3.5, ML: ±2.1; DV: -3.5; en mm de dura), 2 μl/sitio. Para facilitar la comparación entre los métodos de inyección de dos, cada área del cerebro fue infundida con una aguja de cuarzo en un hemisferio y una punta Roma 26 G o una aguja de acero inoxidable de punta bisel 30 G en el otro.
  13. Reducir el flujo de 0,1 μl/min, nick la duramadre con una aguja de punta biselada de acero inoxidable y lentamente baje el brazo estereotáctico en el eje dorso-ventral, entrar en el tejido cerebral. Cuando se alcanza la posición deseada, ir por un adicional de 0,1 mm, detenga la bomba, levantar el brazo estereotáctico por 0,1 mm y empezar otra vez la bomba en el flujo de 0,3 μl/min.
    Nota: La razón para mantener un flujo lento al bajar la aguja debe asegurar una presión positiva que evita la penetración de pequeños fragmentos de tejido en la aguja sí mismo. Tal caso pudieran obstruir la punta, afectando la entrega de la solución. Puesto que la tasa de flujo es muy lenta bajar la aguja y la velocidad de bajada es cerca de 10 s/mm, esto implica que las cantidades de solución que permanecen a lo largo de la pista de la aguja son insignificantes en comparación con los inyecta en el sitio de destino. Esta precaución puede evitarse al usar agujas con orificios laterales.
  14. Iniciar el temporizador y esperar el tiempo necesario según el volumen a inyectar (por ejemplo, s de 6 min 40 si inyección de 2 μL). Vigilar el movimiento de burbujas durante la inyección. Al final, pare la bomba y espere 5 minutos antes de recuperar lentamente la aguja. Cuando la aguja del cuarzo se extrae completamente, arranque la bomba otra vez y busque la formación de una gota en la punta de la aguja.
  15. Selle la abertura en la superficie del cráneo con cera de hueso, retire las pinzas hemostáticas y suturar el cuero cabelludo, cubra el área alrededor de la herida con una crema antibiótica (p. ej., neosporin) y devolver el animal a la jaula del hogar.
    Nota: Siguiendo el protocolo de eutanasia aprobado por el Comité de ética institucional, para los experimentos descritos en este artículo, los animales fueron profundamente anestesiados con una inyección i.p. de 43 mg/kg ketamina y xilacina de 7 mg/kg y decapitados. Los cerebros fueron quitados, fijarse en formol durante 48 h y embebido de parafina. Secciones coronales (8 μm) de los cerebros fueron cortadas usando un micrótomo.

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Resultados

Se comparó el daño inducido por microinyección directa en el hipocampo dorsal de rata y estriado con una aguja de cuarzo (punta de diámetro externo de 60 μm; orificio de lado uno 20 μm de diámetro, tipo C, figura 1) en comparación con dos clásico, extremo romo de 26 G y bisel borde de 30 G agujas de acero inoxidable. Para ello, inyectamos 2 μl de la aCSF en la derecha y la izquierda dorsal hipocampo y cuerpo estriado con respectivamente el cuarzo y la aguja d...

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Discusión

La técnica descrita en este artículo cumple con las necesidades descritas en la Introducción para la optimización de microinyecciones que se realizan para diversos fines12. Las agujas que se describe aquí reducen el daño a un nivel mínimo, esencialmente no detectables; varianza con agujas de vidrio (que son propensos a la curva), agujas de cuarzo son rígidas y aseguran un golpe confiable de la región del cerebro deseado incluso en coordenadas profundos. Por otra parte, el agujero ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo ha sido apoyado por una subvención de la Comunidad Europea [Proyecto FP7-PEOPLE-2011-IAPP 285827 (EPIXCHANGE)].

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Capilares de cuarzoSutter Instruments, Novato, CA USAQ100-50-10Sin filamento
ExtractorSutterP2000
Tarro de almacenamiento de micropipetasWorld Precision Instruments (WPI), Sarasota, FL, EE.UUE210
Microdisector láserLeica Microsystems, Wetzlar, AlemaniaLMD6500
Jeringa HamiltonHamilton ILS Innovative Labor Systeme GmbH, StŸ tzerbach, Alemania19138-U
Bomba de microinfusiónUniventor, Zejtun, MaltaModelo 864
Kit de bomba de microinyección manualWPIArtículo#: MMP-KITKit que permite montar las micropipetas de forma segura en el marco estereotáctico
Taladro de precisiónProxxon28510 MicroMot 50/EEje de transmisión con rodamiento de bolas de velocidad variable
Artficial Cerebral Líquido cefalorraquídeoTocris3525
agujas 26 g romas y 30 g biselHamilton26 g romo: 19138-U
30 g Bisel: 20757
MicrotomoLeica, AlemaniaLEICA RM212RT
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Referencias

  1. Kirik, D., Rosenblad, C., Björklund, A. Characterization of behavioral and neurodegenerative changes following partial lesions of the nigrostriatal dopamine system induced by intrastriatal 6-hydroxydopamine in the rat. Exp Neurol. 152 (2), 259-277 (1998).
  2. Paolone, G., Brugnoli, A., Arcuri, A., Mercatelli, D., Morari, M. Eltoprazine prevents levodopa-induced dyskinesias by reducing striatal glutamate and direct pathway activity. Mov Disord. 30 (13), 1728-1738 (2015).
  3. Paolone, G., Lee, T. M., Sarter, M. Time to pay attention: attentional performance time-stamped prefrontal cholinergic activation, diurnality, and performance. J Neurosci. 32 (35), 12115-12128 (2012).
  4. Shoichet, M. S., Winn, S. R. Cell delivery to the central nervous system. Adv Drug Deliv Rev. 42, 81-102 (2000).
  5. Simonato, M., et al. Progress in gene therapy for neurological disorders. Nature RevNeurol. 9, 277-291 (2013).
  6. Björklund, H., Olson, L., Hahl, D., Schwarcz, R. Short-and Long-Term Consequences of Intracranial Injections of the Excitotoxin, Quinolinic Acid, as Evidenced by GFA Immunohistochemistry of Astrocytes. Brain Res. 317, 267-277 (1986).
  7. Paradiso, B., et al. Localized delivery of fibroblast growth factor-2 and brain-derived neurotrophic factor reduces spontaneous seizures in an epilepsy model. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (17), 7191-7196 (2009).
  8. Falcicchia, C., et al. Silencing Status Epilepticus-Induced BDNF Expression with Herpes Simplex Virus Type-1 Based Amplicon Vectors. PLoS One. 11 (3), 1-17 (2016).
  9. Munoz, J. L., Coles, J. A. Quartz micropipettes for intracellular voltage microelectrodes and ion-selective microelectrodes. J Neurosci Meth. 22 (1), 57-64 (1987).
  10. Sutter Instruments. P-2000: Laser-Based Micropipette Puller. , Available from: http://www.sutter.com/MICROPIPETTE/p-2000.html (2017).
  11. Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Animal research: reporting in vivo experiments: the ARRIVE guidelines. J Cereb Blood Flow Metab. 31, 991-993 (2011).
  12. Torres, E. M., Trigano, M., Dunnett, S. B. Translation of cell therapies to the clinic: characteristics of cell suspensions in large-diameter injection cannulae. Cell Transplant. 24, 737-749 (2015).

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