Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.
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Artículo de método
Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de
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Resumen
Resumen
La bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae es el agente etiológico de la enfermedad gastrointestinal infecciosa del cólera. Debido a la prevalencia global y severidad de esta enfermedad, V. Cholerae ha sido ampliamente estudiado tanto en el medio ambiente como en el laboratorio, requiriendo un mantenimiento adecuado y técnicas de cultivo. Classical y El Tor son dos biotipos principales que componen el V. Cholerae O1 serogrupo, cada uno con características genotípicas y fenotípicas únicas que proporcionan mecanismos confiables para la caracterización del biotipo y requieren condiciones de cultivo de inducción de virulencia distintas. Independientemente del biotipo de la cepa causante de cualquier infección o brote dado, el tratamiento estándar para la enfermedad incluye la terapia de rehidratación complementada con un régimen de antibióticos. Sin embargo, la clasificación del biotipo puede ser necesaria para los estudios de laboratorio y puede tener impactos más amplios en el campo biomédico.A principios de 2000 se identificaron aislamientos clínicos que muestran rasgos genotípicos y fenotípicos de los biotipos clásicos y de El Tor. Los híbridos recién identificados, denominados variantes de El Tor, han causado que la identificación del biotipo de aislamiento clínico y medioambiental se vuelva más compleja que los protocolos de identificación de ensayos únicos tradicionales anteriores. Además de describir V. Cholerae mantenimiento general y técnicas de cultivo, este manuscrito describe una serie de genes específicos ( ctxB y tcpA ) basada en la PCR pantallas genéticas y ensayos fenotípicos (polimixina B resistencia, el metabolismo de citrato, la actividad proteolítica, la actividad hemolítica, la motilidad y el metabolismo de la glucosa a través de Voges- Proskauer) usados colectivamente para caracterizar y / o distinguir entre biotipos clásicos y de El Tor. En conjunto, estos ensayos proporcionan un enfoque sistemático eficiente para ser utilizado como una alternativa o, además, a costosos experimentos de trabajo intensivo en la caracterizaciónCión de V. Cholerae clínicos (y medioambientales) aislados.
Introducción
El cólera es una enfermedad del intestino delgado distal causada por el consumo de alimentos o agua contaminados que contienen la bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae . Los síntomas del cólera incluyen vómitos y diarrea acuosa incontrolable, lo que lleva a la deshidratación severa, que si no se trata adecuadamente, dará lugar a la muerte. V. Los cólera se pueden dividir en más de 200 serogrupos basados en la estructura del antígeno O del lipopolisacárido de la superficie celular. Sin embargo, sólo 2 serogrupos, O1 y O139, han mostrado potencial epidémico o pandémico 1 ,
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Protocolo
Nota: Las consideraciones de tiempo para cada ensayo deben realizarse ya que las preparaciones individuales de los medios requieren diferentes tiempos. Por ejemplo, los medios sólidos de placa de agar deben dejarse enfriar y secar suficientemente (1-2 días). Las consideraciones de tiempo adicionales ( es decir, la colonia única y el crecimiento de la noche a la mañana) se especifican en cada protocolo y se encuentran en la Tabla 2 .
1. Preparación de los medios
- 1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- Se pesan 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na $ ₂
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Resultados
Para el mantenimiento adecuado y el uso de cualquier cepa bacteriana, se recomienda conocer el tiempo de duplicación de la cepa (s) de interés. En este caso, las tasas de crecimiento variables de V comúnmente utilizado . Cholerae se demostraron a través de una curva de crecimiento, y los tiempos aproximados de duplicación se calcularon mediante regresión lineal. WT El Tor N16961 y El Tor variante MQ1795 demostraron tiempos de duplicación más cortos (~ 1 h y ~ 1.......
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Discusión
De los más de 200 identificados V. Cholerae , sólo O1 y O139 tienen potencial epidémico. El serogrupo O1 se puede dividir en dos biotipos: clásicos y El Tor. Sin embargo, han surgido cepas híbridas, denominadas variantes El Tor 13 , 17 , que poseen el fondo del biotopo El Tor, y tienen características clásicas 8 , 9 , 10 , .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Investigación apoyada por New Hampshire-INBRE a través de un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA), P20GM103506, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del NIH.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1 kb Escalera de ADN | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
| 60% de glicerol | Calbiochem 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352 | |
| Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | |
| http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch Agar con infusión cerebro-corazón | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Agarosa | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
| Anhidro K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
| Placas de agar sanguíneo | Remel | R01200 | Tienda a 4 & grados; C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
| Ácido Bórico | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
| Bromotimol Azul | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
| Ácido cítrico · H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | |
| https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 Kit de solución de desoxinucleótidos (dNTP) | New England Biolabs | N0446S | Tienda a -20 & grados; C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
| EDTA disódico | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
| ADN limpio & Concentrador&comercio; -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
| GelGreen Tinción de ácido nucleico | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/ |
| Genesys 10SUV-VIS Espectrofotómetro | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
| Gentra Puregene Levadura/Kit | Qiagen 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation | |
| HCl Fisher | Scientific | A144-212 | Corrosivo; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
| KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
| KH< sub>2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
| KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
| Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
| Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
| MgSO4· 7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
| Mini-Sub Cell GT Sistema de electroforesis horizontal | Bio Rad Labs 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 | |
| MR-VP Caldo | Difco | 216300 | |
| http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
| NaCl | Fisher Scientific | S271-10 https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
| NaNH4HPO4· 4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
| NanoDrop Lite Espectroftómetro | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
| Leche en polvo descremada | Nestlé Clavel N | /A | N/A |
| Peptona | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| placas de Petri (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
| Placas de Petri (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID Sal |
| de sulfato de polimixina B | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Almacene a 2-4 ° C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
| Taq ADN polimerasa | New England Biolabs | M0273S | Tienda en -20 ° C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| Taq Tampón de reacción | New England Biolabs | M0273S | Tienda a -20 ° C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
| termociclador Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
| Cloruro de trifeniltetrazolio | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
| Triptona | Becto, Dickinson y Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| Extracto de levadura | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
| α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |
Referencias
- Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
- Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera....
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