Artículo de método

Técnicas de laboratorio utilizadas para mantener y diferenciar los biotipos de Vibrio cholerae Aislados Clínicos y Ambientales

DOI:

10.3791/55760

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30 de mayo de 2017

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1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito describe técnicas adecuadas de mantenimiento de Vibrio cholerae además de una serie de ensayos bioquímicos, utilizados colectivamente para una diferenciación rápida y confiable entre V clínico y ambiental. Cholerae biótipos en un entorno de laboratorio.

Resumen

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La bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae es el agente etiológico de la enfermedad gastrointestinal infecciosa del cólera. Debido a la prevalencia global y severidad de esta enfermedad, V. Cholerae ha sido ampliamente estudiado tanto en el medio ambiente como en el laboratorio, requiriendo un mantenimiento adecuado y técnicas de cultivo. Classical y El Tor son dos biotipos principales que componen el V. Cholerae O1 serogrupo, cada uno con características genotípicas y fenotípicas únicas que proporcionan mecanismos confiables para la caracterización del biotipo y requieren condiciones de cultivo de inducción de virulencia distintas. Independientemente del biotipo de la cepa causante de cualquier infección o brote dado, el tratamiento estándar para la enfermedad incluye la terapia de rehidratación complementada con un régimen de antibióticos. Sin embargo, la clasificación del biotipo puede ser necesaria para los estudios de laboratorio y puede tener impactos más amplios en el campo biomédico.A principios de 2000 se identificaron aislamientos clínicos que muestran rasgos genotípicos y fenotípicos de los biotipos clásicos y de El Tor. Los híbridos recién identificados, denominados variantes de El Tor, han causado que la identificación del biotipo de aislamiento clínico y medioambiental se vuelva más compleja que los protocolos de identificación de ensayos únicos tradicionales anteriores. Además de describir V. Cholerae mantenimiento general y técnicas de cultivo, este manuscrito describe una serie de genes específicos ( ctxB y tcpA ) basada en la PCR pantallas genéticas y ensayos fenotípicos (polimixina B resistencia, el metabolismo de citrato, la actividad proteolítica, la actividad hemolítica, la motilidad y el metabolismo de la glucosa a través de Voges- Proskauer) usados ​​colectivamente para caracterizar y / o distinguir entre biotipos clásicos y de El Tor. En conjunto, estos ensayos proporcionan un enfoque sistemático eficiente para ser utilizado como una alternativa o, además, a costosos experimentos de trabajo intensivo en la caracterizaciónCión de V. Cholerae clínicos (y medioambientales) aislados.

Introducción

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El cólera es una enfermedad del intestino delgado distal causada por el consumo de alimentos o agua contaminados que contienen la bacteria Gram-negativa acuática Vibrio cholerae . Los síntomas del cólera incluyen vómitos y diarrea acuosa incontrolable, lo que lleva a la deshidratación severa, que si no se trata adecuadamente, dará lugar a la muerte. V. Los cólera se pueden dividir en más de 200 serogrupos basados ​​en la estructura del antígeno O del lipopolisacárido de la superficie celular. Sin embargo, sólo 2 serogrupos, O1 y O139, han mostrado potencial epidémico o pandémico 1 , 2 . Además, el serogrupo O139 se ha aislado principalmente en Asia sudoriental 3 , 4 , mientras que el serogrupo O1 se distribuye en todo el mundo. Además, el serogrupo O1 puede dividirse en 2 biotipos principales: clásico y El Tor. El biotipo clásico fue responsable de la primera 6 pandemia de cóleraS entre 1817 y 1923. La séptima pandemia en curso es el resultado del biotipo El Tor, que ha desplazado globalmente al biotipo clásico en el medio ambiente 5 , 6 , 7 . Recientemente han surgido cepas que contienen características distintivas de los biotipos clásicos y de El Tor 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 y han sido denominadas variantes de El Tor 13 , 17 . Algunas variantes de El Tor han demostrado una elevada capacidad de virulencia con una progresión de la enfermedad más rápida y severa que la observada anteriormente, enfatizandoLa necesidad de un enfoque más amplio para la identificación de agentes y la prevención y el tratamiento de enfermedades 8 , 9 , 18 . Mientras que la identificación del biotipo no determina inmediatamente el tratamiento, los avances adicionales en el desarrollo de la vacuna y los futuros agentes terapéuticos pueden beneficiarse de la distinción del biotipo.

La primera serie de protocolos enumerados aquí permitirá a los investigadores mantener correctamente V. Cholerae en un laboratorio. La consistencia y el posterior análisis requieren la preparación de las poblaciones y el crecimiento de aislamientos, que no dependen del biotipo. Sin embargo, para inducir óptimamente la expresión de genes de virulencia, se requieren técnicas de cultivo específicas independientes del biotipo 19 . Además, la preparación para varios ensayos genéticos y bioquímicos se describen en este manuscrito.

La toxina del cólera (CT) y la toxina co-rePilus gulado (TCP) son dos factores de virulencia principales controlados por el regulador maestro ToxT en ambos biotipos de la V. Cholerae O1 serogrupo 20 . La TC es una toxina bipartita compuesta por cinco CtxB Subunidades que rodean una única subunidad CtxA, y es responsable de la pérdida rápida de electrolitos asociada con el cólera. El TCP es un pilus tipo IV codificado por el operón tcp ( tcpABQCRDSTEF ), y está implicado en la unión y colonización del intestino delgado distal. TcpA es el primer gen del operón tcp que codifica las subunidades de pilina individuales esenciales para la construcción del pilus 8 . La secuencia génica para ctxA se conserva completamente entre biótipos clásicos y El Tor, mientras que ctxB y tcpA difieren a través de los dos biotipos pero se conservan dentro de cada biotipo 8 . CtxB se conserva completamente entre biotipos excepto en dos bases positivas(115 y 203). En el biotipo El Tor, la timina reside en las posiciones base 115 y 203, mientras que el biotipo clásico contiene citosina en estas bases. TcpA se conserva completamente dentro de cada biotipo, pero difieren en múltiples bases entre los biotipos. Estas distinciones genéticas sirven como marcadores de identificación de biotipos primarios y después de la secuenciación del producto de amplificación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que incluye estos sitios, las secuencias aisladas pueden compararse con el O395 clásico de tipo salvaje (WT) o con el El Tor N16961 de WT para determinar el fondo del biotipo De CT y TCP, respectivamente, en un aislado de V. cholerae .

Numerosos protocolos han sido desarrollados para caracterizar las distinciones fenotípicas entre los biotipos clásicos y El Tor 21 , 22 , 23 . La polimixina B es un antibiótico peptídico que compromete la integridad de la membrana celular externa en gram negativos bacY la resistencia a la polimixina B se pueden visualizar a través del ensayo de resistencia a la polimixina B 21 . El citrato es un sustrato primario del ciclo de Kreb, y la capacidad de metabolizar el citrato como fuente única de carbono se puede determinar usando el ensayo del metabolismo del citrato [ 22] . HapR codifica un regulador global y el quórum maestro de sensores de regulación en V. cholerae, HapR, que se une a diversas regiones promotoras y regula el gen y operón expresión [ 24] . Algunas cepas patógenas de V. cholerae tienen una mutación natural de cambio de marco en el gen hapR que ha causado que esta regulación dependiente de la densidad de la expresión del gen de la virulencia se pierde [ 24 , 25] . Medir la actividad de la proteasa regulada por HapR usando medios de agar de leche permite al investigador identificar si un aislado particular contiene un HapR 23 funcional. losEnsayos de hemólisis para determinar la capacidad de una cepa de secretar enzimas hemolíticas que lisan los glóbulos rojos; El grado de hemólisis se puede visualizar en placas de agar sangre [ 23] . La motilidad se asocia a menudo con virulencia en V. cholerae y puede analizarse utilizando placas de agar de motilidad [ 23] . El ensayo de Voges-Proskauer prueba la capacidad de una cepa de fermentar la glucosa como única fuente de carbono y producir la acetoin del subproducto 21 . Con la aparición de las variantes de El Tor, es difícil predecir los resultados de cualquier ensayo fenotípico dado sin exámenes genotípicos extensivos, y antes de deducir el biotipo de fondo de V. Cholerae , se recomienda realizar este ensamblaje de los ensayos 23 y comparar los resultados con cepas de referencia como en la Tabla 2 .

Aquí, hemos avanzado una serie de protocolos, utilizando colectivamente el citadoLos ensayos genotípicos y fenotípicos para un enfoque más completo de la caracterización de V. Biótipos de cholerae . Además, hemos descrito las distinciones genotípicas y fenotípicas de la V conocida. Cholerae El Tor variantes (MQ1795 y BAA-2163), en comparación con las cepas de referencia de biótipo de uso común (WT clásico O395, WT El Tor C6706, y WT El Tor N16961, Tabla 1 ). La aparición de las variantes de El Tor ha planteado retos a la fiabilidad de los protocolos de caracterización de biotipos de ensayos únicos empleados anteriormente; Sin embargo, este sistema de identificación de múltiples ensayos permitirá una caracterización más fiable de la V clínica y ambiental. Cólera aislados.

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Protocolo

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Nota: Las consideraciones de tiempo para cada ensayo deben realizarse ya que las preparaciones individuales de los medios requieren diferentes tiempos. Por ejemplo, los medios sólidos de placa de agar deben dejarse enfriar y secar suficientemente (1-2 días). Las consideraciones de tiempo adicionales ( es decir, la colonia única y el crecimiento de la noche a la mañana) se especifican en cada protocolo y se encuentran en la Tabla 2 .

1. Preparación de los medios

  1. 1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
    1. Se pesan 4,0 g de NaCl, 0,1 g de KCl, 0,72 g de Na $ ₂ $ HPO $ ₄ $ y 0,12 g de KH $ ₂ $ PO $ ₄ $ . Se combinan los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, se ajusta el volumen a 500 ml con agua desionizada, se ajusta el pH a 7,2 usando un pHmetro y se añade HCl gota a gota a la solución y se esteriliza en autoclave o filtro con un filtro de 0,22 μm. 1x PBS se puede almacenar a temperatura ambiente indefinidamente.
      PRECAUCIÓN: El HCl es un ácido concentrado y se debe manipular deA regulaciones institucionales, locales, estatales y federales. Para instrucciones de manipulación adecuadas, consulte la hoja de datos de seguridad proporcionada por el fabricante.
  2. Caldo Luria-Bertani (LB)
    1. Se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl. Combine los componentes en una botella de 1 litro, ajuste el volumen a 500 ml con agua desionizada, autoclave y guarde a temperatura ambiente por hasta 6 meses. Para las condiciones clásicas de inducción de virulencia del biotipo, ajuste el pH a 6,5 ​​usando HCl antes del autoclavado.
  3. AKI que contiene 0,03% (p / v) de NaHCO $ ₃ $
    1. Para el componente 1 (medio AKI): pesar 7,5 g de peptona, 2,0 g de extracto de levadura y 2,5 g de NaCl. Combine los componentes en una botella de 1 l, ajuste el volumen a 450 ml con agua desionizada y autoclave. El medio AKI puede ser almacenado a temperatura ambiente por hasta 6 meses.
    2. Para el componente 2 (NaHCO $ ₃ $ ): se pesan 1,5 g de NaHCO $ ₃ $ y se ajusta el volumenA 50 ml con agua desionizada en una vesícula estéril. El filtro esteriliza NaHCO3 usando un filtro de 0,22 μm. El NaHCO 3 debe prepararse inmediatamente antes de su uso.
    3. Combine asépticamente los dos componentes creando una relación 1:10 filtrando el Componente 2 en el Componente 1 antes de usarlo.
  4. Placas de Agar Luria-Bertani (LB)
    1. Se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 7,5 g de agar. Se combinan los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, se ajusta el volumen a 500 ml con agua desionizada, se autoclave y se prepara en placas de Petri estériles de 100 mm x 15 mm estándar. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 6 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C.
  5. Placas de agar de LB suplementadas con polimixina B
    1. Para el componente 1 (agar LB): se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 7,5 g de agar. Combinar los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajustar el volumen a 500 ml wiAgua desionizada y autoclave.
    2. Para el componente 2 (polimixina B): disolver la polimixina B en agua desionizada en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml hasta una concentración de 50.000 UI / μl y esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 μm.
    3. Una vez que el Componente 1 se enfríe al tacto, pero no se solidifica todavía, agregue asépticamente 500 μl de Componente 2 al Componente 1 creando una concentración final de 50 UI / μl y mezcle bien. Preparar en placas de Petri estériles de tamaño estándar de 100 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 3 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C.
  6. Minimal Citrate Medium Agar Plates
    1. Para el componente 1 (agar con azul de bromotimol): pesar 7,5 g de agar y 0,02 g de azul de bromotimol. Combinar los constituyentes en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajustar el volumen a 450 ml con agua desionizada y autoclavar la mezcla.
    2. Para el componente 2 (10x VBMM): pesa 1.0 g de MgSO $ ₄ $ 7H $ ₂ $ O, 10,0 g de ácido cítrico H $ ₂ $ O, 50,0 g de K $ ₂ $ HPO $ ₄ $ anhidro y 17,5 g de NaNH $ ₄ $ HPO $ ₄ $ 4H $ ₂ $ O. Combinar los constituyentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, Con agua desionizada y autoclave o filtro esterilizar usando un filtro de 0,22 μm. 10x VBMM se puede almacenar a temperatura ambiente hasta 6 meses.
    3. Añadir 50 ml de Componente 2 al Componente 1 y preparar en placas de Petri estériles de 100 mm x 15 mm estándar vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta 6 meses, con la tapa hacia arriba a 4 ° C.
  7. Placas de agar de leche
    1. Para el Componente 1 (leche): pese 8,0 g de leche desnatada sin grasa instantánea en un matraz Erlenmeyer de 1 l, ajuste el volumen a 200 ml con agua desionizada y autoclave.
    2. Para el componente 2 (agar con infusión corazón-cerebro): pesan 3,68 g de infusión corazón-cerebro y 6,0 g de agar. Combinar el conEn un matraz Erlenmeyer de 500 ml, ajustar el volumen a 200 ml con agua desionizada y autoclave.
    3. Combine los dos componentes vertiendo el Componente 2 en el Componente 1, después de esterilizar en autoclave y mezcle bien. Preparar en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm. Las placas de leche se pueden almacenar hasta una semana envueltas en plástico, con la tapa hacia abajo a 4 ° C. Se preparan en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri.
  8. Placas de Agitación de Motilidad
    1. Para el componente 1 (agar LB): se pesan 5,0 g de triptona, 2,5 g de extracto de levadura, 2,5 g de NaCl y 2,0 g de agar. Combinar los componentes en un matraz Erlenmeyer de 1 L, ajustar el volumen a 500 ml con agua desionizada y autoclave.
    2. Para el componente 2 (cloruro de trifeniltetrazolio al 1% (p / v), TTC): pesar 0,25 g de TTC. Ajustar el volumen a 25 ml con agua desionizada en una vesícula estéril y esterilizar el filtro con un filtro de 0,22 μm. Almacenar hasta 6 meses a temperatura ambiente envueltoEn papel de aluminio para minimizar la exposición a la luz.
    3. Añadir 2,5 ml de TTC estéril al 1% (p / v) a medios autoclavados.
    4. Vierta medios tan gruesos como sea posible (≥50 mL / placa) en grandes placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm. Los medios plateados se pueden almacenar envueltos en plástico hasta por una semana, con la tapa hacia arriba a 4 ° C. Se preparan en placas de Petri estériles de 150 mm x 15 mm vertiendo medios de agar mezclados en las placas de Petri.
  9. Voges-Proskauer (VP)
    1. Para el Componente 1 (Caldo de Metil Red-Voges-Proskauer, MR-VP): pesar 1,7 g de medio MR-VP en un matraz Erlenmeyer de 500 mL, ajustar el volumen a 100 mL con agua desionizada y autoclave. El caldo estéril MR-VP se puede almacenar a temperatura ambiente durante un máximo de 6 meses.
    2. Para el componente 2 (alfa ( alpha) naftol al 5% (p / v)): pesar 1,0 g de alpha - naftol en una vesícula estéril y ajustar el volumen a 20 ml con etanol al 95%. Α-naftol se puede almacenar a temperatura ambiente por hasta 1 semana envuelto en papel de aluminio para minimizar la luz expOsure
    3. Para el componente 3 (hidróxido de potasio al 40% (p / v): KOH): pesar 20,0 g de KOH en una vesícula estéril, ajustar el volumen a 50 ml con agua desionizada estéril. KOH se puede almacenar hasta 6 meses a temperatura ambiente en un recipiente de plástico.

2. Mantenimiento y Crecimiento de V. Cepas de cholerae

  1. Preparación y Uso de Cultivos Almacenados Congelados
    1. Pellet 1,8 ml de líquido durante la noche de cultivo durante 2 min por centrifugación (≥ 8.600 xg) en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 ml, eliminar sobrenadante y volver a suspender el sedimento celular en 900 μ l de caldo LB fresco pipeteado.
    2. Añadir 900 μl de glicerol estéril al 60% (v / v) al cultivo y mezclar por vórtex.
    3. Transferir la mezcla a un tubo criogénico estéril de 2 ml y almacenar indefinidamente a -80 ° C.
    4. Para usar, eliminar una pequeña cantidad de material congelado usando un bucle de inoculación estéril y raya para colonias individuales en LB agAr placas. Inmediatamente devuelva el material congelado a -80 ° C después del uso para evitar que las culturas se descongelen completamente. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
  2. Crecimiento de cultivos durante la noche en medio líquido
    1. Streak para colonias individuales (según la sección 2.1.4) a partir de material congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocular 4 mL de caldo LB líquido en un tubo de cultivo estéril de 10 mL con una sola colonia tocando la superficie de la colonia única con un palillo de aplicación estéril y transfiriendo la colonia al caldo líquido.
    3. Incubar con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12 a 16 h a 37ºC.
  3. Curva de crecimiento
    1. Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2.
    2. Hacer una dilución 1: 100 del cultivo durante la noche transfiriendo 250 μl de cultivo durante la noche a 25 mL de caldo LB fresco en un matraz erlenmeyer de 250 mL estéril.
    3. Medir la densidad óptica de los cultivos líquidos a 600 nm (DO 600 ) cada hora comenzando en el momento de la inoculación (T 0 ).
    4. Incubar una dilución de 1: 100 del cultivo durante la noche con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante hasta 30 h a 37 ° C, o hasta que el cultivo alcance la máxima densidad.
    5. Gráfica de la DO 600 vs tiempo y el uso de regresión lineal para determinar el tiempo aproximado de duplicación de cada cepa.
  4. Condiciones de inducción de la Virulencia del Bitipo de El Tor
    1. Streak para colonias individuales de stock congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo, durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocular 10 ml de medio AKI que contiene NaHCO 3 al 0,03% (p / v) con una sola colonia.
    3. Incubar el cultivo sin aireación a 37 ° C durante 3,5 h.
    4. Quitar 7 ml de cultivo e incubar los 3 ml restantes de cultuCon aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 4 h adicionales.
  5. Condiciones de inducción de virulencia del biotipo clásico
    1. Streak para colonias individuales de stock congelado sobre placas de agar LB. Incubar las placas con la tapa hacia abajo durante 12 a 16 h a 37 ° C.
    2. Inocular 4 ml de caldo LB líquido (pH 6,5) con una sola colonia.
    3. Incubar con aireación en una incubadora agitadora a 225 rpm durante 12 a 16 h a 30 ° C.
  6. Pellet de celdas de lavado en 1x PBS
    1. Pellet 1,8 mL de cultivo durante la noche durante 2 min por centrifugación (≥8,600 xg) en un tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta. Re-suspender el sedimento celular en 1,8 mL 1x PBS por pipeteado.
    2. Repita el procedimiento de lavado tres veces seguido de una resuspensión final en 1,8 ml 1x PBS.

3. Caracterización de V. Biótipos de cholerae

  1. PAGPantallas Genéticas basadas en CR usando ctxB y tcpA
    1. Diseñar un conjunto de cebadores, que recolectan aproximadamente 50-70 pb aguas arriba y aguas abajo de los sitios de inicio y de parada de traslación de ctxB y tcpA , respectivamente.
    2. Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2.
    3. Aísle el ADN cromosómico usando un kit disponible comercialmente diseñado para bacterias Gram-negativas. El ADN cromosómico purificado puede almacenarse indefinidamente a -20 ° C. El aislamiento de ADN cromosómico utilizando kits comercialmente disponibles tarda generalmente aproximadamente 4 h.
    4. Utilice un espectrofotómetro de micro-volumen para asegurar que la muestra de ADN cromosómico sea de alta calidad (A 260/280 > 1,8).
    5. Para cada aislamiento de ADN cromosómico, preparar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en hielo en tubo (s) de PCR de 200 μl estéril y amplificar regiones de ctxB y tcpA usando componentes de PCR estándar: Taq polimerasa y buFfer (o equivalentes), solución de dNTP, y cebadores directos / inversos. Utilizar parámetros estándar de PCR (~ 3 h). Por ejemplo, utilice el siguiente protocolo:
      1. Desnaturalización inicial a 95 ° C durante 120 s.
      2. Desnaturalización a 95 ° C durante 60 s.
      3. Primers de recocido a 60 ° C durante 45 s.
      4. Extender a 72 ° C durante 90 s.
      5. Repita los pasos 3.1.5.2 a 3.1.5.4 durante 34 ciclos.
      6. Extensión final 72 ° C durante 600 s.
      7. Mantenimiento infinito a 4 ° C.
    6. Se tiñe 5 μl de producto (s) de PCR respectivo utilizando un colorante de carga de gel de ADN 6x estándar y se carga aproximadamente 10 μl de escalera de 1 kb y 10 μl de producto de PCR en un gel de agarosa al 1% en 1x Tris-Borato-EDTA buffer.
    7. Ejecutar electroforesis en gel a 130 V hasta que el colorante del frente llegue al final, pero no fuera, del gel (aproximadamente 90 minutos). Se recomienda una supervisión constante ya que el voltaje y los tiempos de funcionamiento pueden variar dependiendo del equipo.
    8. Tras la verificación deCon una amplificación de PCR exitosa en el tamaño esperado, purificar los 45 μl de producto (s) PCR restantes utilizando un kit de limpieza y concentrado de ADN comercialmente disponible.
    9. Secuencia de producto (s) de PCR limpiado utilizando los mismos cebadores utilizados para la amplificación por PCR, y preparar por directrices de instalación de secuenciación local.
    10. Compare el formato FASTA de secuencias de genes de cada uno de los aislados a la secuencia publicada disponible en el sitio web de NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), buscando los siguientes números de acceso en el cuadro de búsqueda.
    11. CtxB : región (clásica) entre VC0395_A1059 a VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456
    12. TcpA : (clásica) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828
  2. Ensayos fenotípicos para la clasificación del biotipo mediante Spotting
    1. Preparar el cultivo durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2.
    2. Lave el (los) sedimento (s) de células tal como se especifica en el protocolo 2.6.
    3. Utilice una pipeta paraColocar 1 μl de cultivo lavado en el respectivo medio. Para las especificaciones de selección e incubación medianas, consulte la Tabla 2.
  3. Ensayo de Motilidad
    1. Preparar el (los) cultivo (s) durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2.
    2. Lave el (los) sedimento (s) de células tal como se especifica en el protocolo 2.6.
    3. Inocular las placas de agar de motilidad insertando el punzón de inoculación en el cultivo líquido lavado y "apuñalar" verticalmente en el medio. Entre cada inoculación, esterilice la punzón de alambre con un quemador de Bunsen, y al apuñalar el agar, asegúrese de que la punzada de inoculación no se doble, ya que esto puede alterar los resultados.
    4. Incubar las placas con la tapa hacia arriba durante 14 a 24 h a 37 ° C. Después de 14 h, monitorear las placas de motilidad de cerca para evitar el crecimiento excesivo de los cultivos.
  4. Ensayo Voges-Proskauer (VP)
    1. Preparar el (los) cultivo (s) durante la noche en caldo LB líquido como se indicó anteriormente en el protocolo 2.2.
    2. Inocular 4Ml de Voges-Proskauer rojo de metilo, o caldo MR-VP, pipeteando 10 μl de cultivo de noche previamente preparado en 4 mL de caldo MR-VP en un tubo de cultivo estéril e incuba con aireación en un incubador agitador a 225 rpm durante 12 a 16 H a 37ºC.
    3. Añadir 150 μl de α-naftol al 5% (p / v) y 50 μl de KOH al 40% (p / v) a 1 ml de alícuotas de MR-VP durante la noche en tubos de cultivo estéril, respectivamente.
    4. Agitar brevemente y dejar reposar a temperatura ambiente durante un máximo de 4 h hasta que se produzca un cambio de color.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para el mantenimiento adecuado y el uso de cualquier cepa bacteriana, se recomienda conocer el tiempo de duplicación de la cepa (s) de interés. En este caso, las tasas de crecimiento variables de V comúnmente utilizado . Cholerae se demostraron a través de una curva de crecimiento, y los tiempos aproximados de duplicación se calcularon mediante regresión lineal. WT El Tor N16961 y El Tor variante MQ1795 demostraron tiempos de duplicación más cortos (~ 1 h y ~ 1...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De los más de 200 identificados V. Cholerae , sólo O1 y O139 tienen potencial epidémico. El serogrupo O1 se puede dividir en dos biotipos: clásicos y El Tor. Sin embargo, han surgido cepas híbridas, denominadas variantes El Tor 13 , 17 , que poseen el fondo del biotopo El Tor, y tienen características clásicas 8 , 9 , 10 , ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Investigación apoyada por New Hampshire-INBRE a través de un Premio de Desarrollo Institucional (IDeA), P20GM103506, del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales del NIH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1 kb Escalera de ADNNew England BiolabsN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
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AgarosaPeqlab732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+
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Placas de agar sanguíneoRemelR01200Tienda a 4 & grados; C;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
Ácido BóricoFisher ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
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Ácido cítrico · H2OFisher ScientificS72836-3
https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 Kit de solución de desoxinucleótidos (dNTP)New England BiolabsN0446STienda a -20 & grados; C;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
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Cloruro de trifeniltetrazolioAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
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α-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189

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