Un sistema integrado para activar remotamente Transduction de la señal intracelular por fotoactivación de la cinasa mediada por nanopartículas de conversión ascendente

Resumen

En este protocolo, jaula de la proteína quinasa A (PKA), un bioeffector de transducción de señal celular, fue inmovilizada en una superficie de nanopartículas, microinyectado en el citosol y activado por producir UV luz de radiación de infrarrojo cercano (NIR), induciendo desintegración de la fibra de estrés aguas abajo en el citosol.

Resumen

Upconversion nanopartículas (UCNP)-mediada de la fotoactivación es un nuevo enfoque a distancia control bioeffectors con mucho menos fototoxicidad y con una penetración más profunda del tejido. Sin embargo, la instrumentación existente en el mercado no es fácilmente compatible con la aplicacion de upconversion. Por lo tanto, modificar el instrumento disponible en el mercado es esencial para esta investigación. En este artículo ilustramos primero las modificaciones de un Fluorímetro convencional y microscopio de fluorescencia para hacerlos compatibles para los experimentos de upconversion del fotón. A continuación se describe la síntesis de un infrarrojo cercano (NIR)-desencadenó la jaula de la proteína kinase A subunidad catalítica (PKA) inmovilizada en un complejo UCNP. Parámetros para la microinyección y NIR fotoactivación procedimientos también se divulgan. Después de la PKA-UCNP enjaulado es microinyectado en células de fibroblastos REF52, la irradiación NIR, que es significativamente superior a la irradiación UV convencional, eficientemente activa la vía de transducción de señal PKA en las células vivas. Además, experimentos de control positivos y negativos confirma que la vía inducida por la PKA llevando a la desintegración de las fibras de estrés se activa específicamente por la irradiación NIR. Así, el uso de proteína modificada UCNP proporciona un enfoque innovador para remotamente controlar experimentos celulares luz modulada, en la que debe evitarse la exposición directa a los rayos UV.

Introducción

Proteínas químicamente modificadas que pueden ser fotoactivado (por ejemplo, proteínas PKA enjaulado) se han desarrollado como un campo emergente en Biología química a manipular no invasiva los procesos bioquímicos intercelulares^{1,2 ,3}. Usando la luz como un estímulo ofrece excelente resolución espaciotemporal al activar estos enjaulado proteínas. Sin embargo, la luz UV puede causar no deseados cambios morfológicos, apoptosis y daño en el ADN a las células^4,5. Por lo tanto, los acontecimientos recientes en el diseño de grupos de photocaging se centran en que fotorrotura sobre excitación de longitud de onda más largas o dos fotones para reducir fototoxicidad, así como para aumentar la penetración de tejido profundo^6,7. Grupos de jaulas que responden a la longitud de onda más largo permitiendo elegir convenientes uncaging las longitudes de onda (es decir, canales) selectivamente activan bioeffectors cuando dos o más grupos de jaulas son presente⁷. Teniendo en cuenta estas características útiles, desarrollar nuevos grupos de photocaging de la luz roja es muy importante trabajo aguas arriba en fotoquímicas metodologías para estudios biológicos, que van desde los mecanismos de las reacciones para controlar las actividades celulares⁸de sondeo. Sin embargo, un grupo de jaulas de dos fotones es normalmente demasiado hidrofóbico debido a la estructura de anillo aromático fusionado, y un grupo de jaulas de luz visible es normalmente organometálicos con ligandos aromáticos. Esta propiedad hidrofóbica/aromático no es adecuada cuando la bioeffector es una proteína o enzima, ya que desnaturaliza el sitio de activación de la enzima/proteína y causa pérdida de la función, aunque la conjugación y fotólisis todavía trabajan en el nivel químico^{2 ,9}.

UCNPs son eficaces transductores que convierten la luz de excitación NIR a los rayos UV. Esta propiedad única y fascinante de UCNPs ha ofrecido resoluciones realistas para enfrentar los retos asociados con fotoactivación y desencadena la liberación controlada de moléculas pequeñas, incluyendo ácido fólico¹⁰, derivados del cisplatino¹¹ , ADN/siRNA¹²copolímero vesículas¹³y partículas huecos¹⁴. Sin embargo, a lo mejor de nuestro conocimiento, la fotoactivación UCNP asistida de enzimas o proteínas no ha sido probado hasta ahora. Porque no hay ningún caso exitoso de usar luz roja o NIR a fotoactivos enzima, nos impulsó a realizar la activación activa NIR de una construcción de la proteína/enzima compuesta por complejos de enzima enjaulado químicamente modificado con una cubierta de sílice, dopados con lantánidos UCNP¹⁵. En este estudio, el UCNP fue conjugado con una quinasa de transducción de señal rápidamente reaccionando en forma de PKA enjaulado. PKA controla la síntesis de glicógeno y citoesqueleto Reglamento que responde a los estímulos externos vía regulación del fosfato (campo) de adenosina cíclica en el citosol¹⁶. Se estudió la viabilidad de la activación de la enzima de formas temporales y espaciales en un experimento de celular después de la irradiación NIR. Esta plataforma asistida UCNP fotoactivación es una nueva metodología para Fotoactivar enzima usando NIR y evita la respuesta de transducción de señal no deseada de las células causadas por convencionales UV irradiación^2,4.

Es muy difícil que translocan grande bioeffectors (p. ej., proteínas) a través de la membrana de la célula para controlar la actividad celular. Aunque la proteína inmovilizada de partícula puede ser más fácil que translocan a través de endocitosis en el citosol, endocitosis pueden dañarse o degradarse vía endosomal atrapamiento y la consiguiente degradación lisosomal^2,4. Aunque la proteína enjaulada es todavía funcional después de translocación de membrana, las cantidades translocadas pueden no ser suficiente para desencadenar la respuesta celular^2,17. En contraste, microinyección es un acercamiento directo y cuantitativo para ofrecer grandes bioeffectors al citoplasma de la célula. Además, bioeffector inmovilizado UCNP requiere producir luz para activarse. Por lo tanto, la instrumentación óptica adicional requiere modificación para medir, visualizar y utilizar la luz de upconversion. En este trabajo, la entrega de un complejo de PKA UCNP enjaulado en una celda utilizando microinyección y las siguientes modificaciones esenciales, microscopia y espectroscopia de NIR fotoactivación se describen en detalle.

Protocolo

Nota: el protocolo describe una modificación de la instrumentación detallada de fotoactivación asistida de upconversion, un procedimiento sintético para generar enjaulado PKA-UCNP, microscopía electrónica de transmisión (TEM) de la UCNP recubierto de silicona y enjaulado PKA UCNP muestras, configuración de fotólisis UV y NIR, preparación celular, microinyección de PKA UCNP, un estudio de fotoactivación y la fibra de estrés tinción de células REF52.

1. configuración de Fluorímetro para la medición de espectro de Upconversion

1. instalar un objetivo X 4 junto al titular de la cubeta del espectrómetro de fluorescencia de modo que el láser se concentra en el centro de la cubeta.
2. Colocar un diodo láser sintonizable de 980 nm 0.5 - 8 W 90° contra el objetivo.
   PRECAUCIÓN: El operador debe tener conocimiento de seguridad láser y NIR láser gafas.
3. Instalar un espejo completo de la reflectancia en la intersección de la trayectoria de la luz de la lente del objetivo y láser. Colocar una placa de metal anodizada negro para bloquear la ventana de la excitación de la espectroscopia y a proteger las partes interiores.
4. Coloque la cubeta de sílice recubiertas solución UCNP (0.2 - 0.6 mg/mL) en el portacubetas para que un haz luminoso upconversion puede visualizarse y puede utilizarse para ajustar la mejor alineación de luz para la instalación de espejo.
5. Cambiar la espectroscopia al modo de luminiscencia con ajuste de voltaje más bajo de PMT (ajuste para un ajuste más alto si la señal es demasiado débil). Ajuste el espejo a la mejor alineación, donde la viga está en el centro de la cubeta y el PMT recoge la señal más fuerte.
6. Medir el espectro de conversión ascendente, después de la alineación, con la configuración deseada. Utilice un medidor de potencia térmica de la pila para construir una curva de calibración de potencia del láser contra la lectura corriente eléctrica en la alimentación del láser. Controlar constantemente el rendimiento del láser para asegurarse de que el rendimiento está dentro del rango calibrado.

2. Configuración del microscopio

Nota: la siguiente configuración funciona para microscopios equipados con un camino óptico de dos niveles. Si el usuario tiene la intención de instalar un interruptor de la fuente de luz de excitación en el puerto trasero para que el láser NIR y la lámpara de haluro de compartir el mismo puerto, el colimador en el puerto trasero significativamente bloqueará el NIR, porque está diseñado para reducir el calentamiento de la muestra. El usuario debe hacer una elección difícil: mantener el colimador y sufren de upconversion muy baja eficacia, o quitar el colimador y sacrificar la intensidad de la excitación de la epifluorescencia.

Nota: un diagrama de corte que muestra el esquema de la trayectoria de la luz para un spectrofluorometer modificado, la microscopia para luminiscencia upconversion y modo de fotólisis NIR y epifluorescencia y modo de fotólisis UV y la configuración experimental utilizado para este experimento se ilustra en la figura 2.

Guía

1. Equip el microscopio de fluorescencia con una luz de halogenuros metálicos, dirigido en la parte trasera Puerto
   Nota: en este camino de luz de nivel superior donde hay una torreta de cubo, una posición de cubo debe estar vacía para permitir NIR desde el reinado de luz de menor nivel
2. Instalar un diodo de láser sintonizable de 0.5 a 8.0 W 980 nm en el puerto del lado derecho, con el colimador de puerto lateral abierto.
   Nota: Esto aumenta el láser luz punto a alrededor de 500 μm de diámetro cuando se utiliza un objetivo de 10 X. Este colimador resulta en un punto ligero de la gama del micrómetro y hace impracticable la irradiación celular NIR. Este colimador es NIR transparente.
3. Instale un espejo dicroico (corto-pase de 850 nm) y un filtro de la excitación (paso largo 950 nm) en el reinado de luz de menor nivel
4. Use una solución UCNP para visualizar el punto de luz NIR. Ajuste la posición del láser el haz de luz NIR en el campo de visión para terminar la alineación del centro.

3. Preparación y caracterización de enjaulado PKA UCNP construcción de

1. PKA recombinante incubar (9 μm) con 0,5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) en jaulas de búfer (20 mM Tris-HCl, NaCl 100 mM y 10 mM de MgCl ₂, pH 8,5) durante 1-2 h a 25 ° C. Quench el NBB exceso con 10 mM dthiothreitol (DTT) y luego dializarse contra 4-(2-hidroxietil) buffer ácido piperazina-1-(n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido (HEPES) (10 mM, pH 7.5) para eliminar el exceso reactivos y sales.
   Nota: El pH de la solución de jaulas se baja de 8.5 a 7.5 durante diálisis con pH HEPES 7,5 para la reacción de inmovilización posterior.
2. Mix el lantánido Y(CH₃CO₂) sales ₃ hydrate (99.9%, g 0,4527, 1.38 mmol), Yb (CH ₃ CO ₂) ₃ hidrato (99.9%, g 0,2533, 0.60 mmol) y Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ hidrato (99.9%, g 0,0168, 0.02 mmol)-Octadeceno (30 mL) y ácido oleico (12 mL), la mezcla a 115 ° C durante 30 minutos y enfriar a 50 ° C. A continuación, disolver la mezcla de reacción en una solución metanólica (20 mL) con 0,2 g (5,0 mmol) de NaOH pellet y 0,2964 g (8 mmol) de fluoruro de amonio por sonicación durante 15 minutos subir la temperatura de reacción a 300 ° C para obtener la base UCNP (β-NaYF ₄ : 1.0% Tm ^{3 +} / 30% Yb ^{3 +}) nanopartículas.
3. Disolver las nanopartículas núcleo (25 mg) con CO-520 (0,5 mL) en ciclohexano (10 mL). Agregar amoníaco (wt 30% v/v, mL 0,08) y tetraethylorthosilicate (TEOS, 0,04 mL) y aplicar agitación constante durante 12 h a temperatura ambiente para obtener el β-NaYF recubierto de silicona ₄: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} base nanopartículas.
4. Incubar el PKA (6 nmol) o enjaulado PKA (6 nmol) con UCNP (1 mg) ¹⁵ en tampón HEPES (10 mM, pH 7,5) a 4 ° C por 3 h para inmovilizar la PKA en el revestimiento de sílice UCNP mediante interacciones electrostáticas.
5. Filtra la mezcla utilizando filtro de PVDF (0.45 μm), centrifugar a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y redisperse el pellet en estabilizador de proteínas 0,1% que contienen HEPES (50 μL, 10 mM, pH 7.5) para obtener el complejo PKA UCNP purificado. Centrifugue a 17.000 x g por 10 min a 4 ° C y recoger el sobrenadante para un ensayo de Bradford en un tubo de 1,5 mL.
6. Analizar la PKA ilimitada en sobrenadante salvado de paso 3.5 con un ensayo de Bradford para espalda-para calcular el nivel de sustitución de PKA en las partículas UCNP, que normalmente tienen un nivel de sustitución de ~ 4.5 nmol de PKA por mg de partículas.
   Nota: El ensayo de Bradford revela un fuerte color azul en las pelotillas, que sugiere una inmovilización de proteínas nivelada y estable sin la desorción, mientras que la fracción sobrenadante del enjaulado PKA UCNP solución muestra un color similar a () buffer HEPES figura 4 c-4e).

4. Caracterización

Nota: el ensayo de quinasa se utiliza para cuantificar la actividad específica de la cinasa del piruvato. En Resumen, la fosforilación del péptido, que se acopla a la piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa, resulta en la oxidación de NADH. Formación de este último se controla midiendo la disminución de absorbancia del NADH a 340 nm.

1. Determine la actividad de la PKA y PKA UCNP en un volumen total de 60 μL de mezcla de ensayo que contiene ácido 4-morpholinepropanesulfonic (MOPS, 100 mM, pH 7.5), KCl (100 mM), fosfoenolpiruvato (PEP, 1 mM), trifosfato de adenosina (ATP, 1 mM), β - nicotinamida adenina dinucleótido reducido forma (NADH, 0,8 mM), cloruro de magnesio (MgCl ₂, 1 mM), kémptido (0,4 mM) y una mezcla de deshidrogenasa de piruvato cinasa/lactato (30/40 unidades de PK/LDH).
2. Medir la disminución de absorbancia del NADH en el tiempo después de la adición de solución PKA (2 μL) a la mezcla de ensayo. Calcular la pendiente de la línea para reflejar directamente la actividad de la quinasa se mide.
3. Medir la actividad de PKA UCNP ¹⁵ y la actividad general, que debe combinarse bien con el producto de la multiplicación de la actividad de PKA-específicas nativa y la cantidad de superficie cubierta de PKA calculada.

5. Configuración de fotólisis

Meas

1. URE toda la energía de la luz fuentes usando un sensor termal de la pila y calcular densidades de potencia (PD = potencia (W) / área (cm ²)) ¹⁸ según la luz spot.
2. Realizar los experimentos en vitro UV fotólisis en un sistema comercial con 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵.
3. UV para la fotoactivación en la platina del microscopio, iluminar la solución UCNP PKA con la excitación de luz filtrada por un cubo comercial ¹⁵.
   Nota: La densidad de energía es ~ 15 mW/cm ², sin objetivo concentrarse.
4. Para en vitro fotoactivación NIR en la platina del microscopio, iluminar la solución de PKA UCNP utilizando láser 980 nm con la configuración de filtro/espejo upconversion personalizado instalado en el menor nivel de paso de luz, un espejo dicroico (850 nm corta pasa), y un filtro de la excitación (950 nm paso largo).
   Nota: La densidad de potencia de salida es 5 W/cm ² antes de 4 X objetivo enfocar. Se estima la densidad de energía ~ 68 W/cm ² 4 X objetivo enfoque.

6. Preparación de la muestra y microinyección de PKA UCNP complejos de la célula

1. prefiltro las muestras a través de un filtro de 0.45 μm después de la inmovilización de PKA (paso 3.5).
2. Incubar las células en 10% de suero bovino fetal (FBS) que contiene L-15 medio durante el período de microinyección para control del pH estable fuera de la incubadora.
   Nota: para confirmar la realización de la microinyección, conjuntamente inyectar el PKA-UCNP nativo enjaulado PKA-UCNP y PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) ¹⁵ 6 5-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) (10 μm) en células.
3. Ajustar la concentración de las partículas de PKA UCNP tal que, después de la microinyección, la concentración citosólica es 1-3 μM PKA - un rango de concentración fisiológica de PKA en una celda, con la suposición de que el volumen de inyección es 1/10 del volumen celular .
4. Realizar la microinyección en células (paso 6.2) usando un dispositivo microinyector acoplado con un micromanipulador hidráulico de un eje ( figura 3).
5. Usar un calibrador de presión digital para controlar la presión ejercida por la microinyectora es en el rango de operación (~ 50-200 hPa) y sello de la válvula de dispensador en una cámara ejerciendo presión sobre personalizada para proporcionar presión de compensación para la microinyección. Tire hacia atrás la aguja utilizando un extractor.
6. Mantener la presión de inyección entre 50 y 75 hPa, con un tiempo de inyección de 200-300 ms y la presión de compensación en 15 hPa para evitar el reflujo del medio de cultivo en aguja por acción capilar.
7. Examinar los orificios de la punta de las agujas para asegurar que tienen un diámetro exterior entre 1,3 y 1,5 μm, que puede confirmarse al tomar imágenes con una lente objetivo de 40 x.
8. Lavar las células con 2 mL de medio de L-15 que contiene 10% FBS después de la microinyección. Observar la proyección de imagen de fluorescencia celular desde 5 (6) - carboxytetramethyl - rodamina (TAMRA) para confirmar la realización de la microinyección.

7. Fotoactivación de enjaulado PKA UCNP usando UV o luz NIR en células viven

fotoactivación

1. de UV después de la microinyección de PKA UCNP, crecen las células REF52 en un plato de 3,5 μm, los coloca en la platina del microscopio e irradiar con luz ultravioleta filtrada por el cubo por 3 min sin objetivo concentrarse.
   Nota: REF52 células fueron mantenidas en DMEM con 10% SBF a 37 ° C en un incubador de 5% CO ₂ y las células fueron subcultivadas cuando la confluencia alcanza a un 90% cada 2-3 días.
2. NIR para la fotoactivación después de la microinyección de PKA UCNP, iluminar las células en un láser de 980 nm de configuración de filtro/espejo de menor nivel, como se describe en el paso 5.4.
   Nota: La potencia de la densidad es 5 W/cm ² antes de 10 X objetivo centrado y se estima que 300 W/cm ² después de 10 x objetivo centrado. Conversión ascendente es un proceso que requiere una densidad de fotones alta, especialmente cuando es necesario un cambio de anti-Stoke más grande. Por lo tanto, enfocarse es necesario durante la fotoactivación.
3. Cuando es necesario un punto de luz más grande (650 μm x 520 μm), irradiar estas células con NIR enfocado por una lente objetivo de 10 x con un colimador para permitir a 15 minutos para un intervalo oscuro de 5 min después de la irradiación de cada de 5 min para evitar el calentamiento.
   Nota: Cuando una alta resolución espacial (punto ligero subcelular) es necesario, utilizar el objetivo de 40 X con un agujero de alfiler instalado en el extremo de salida de la guía de luz para generar un punto de luz dimensión subcelular (5 μm x 4 μm). En este caso, 1 s de irradiación es suficiente para la fotoactivación NIR por el alto flujo de fotones.
4. Fotólisis UV después o NIR, permiten a las células a recuperar en una 5% CO ₂ incubadora a 37 ° C por 1 h en medio completo para generar respuestas celulares. Posteriormente, fijar en 1 mL de 4% paraformaldehido/fosfato-buffer salina (PBS) por 20 min antes de la tinción más.
   PRECAUCIÓN: Paraformaldehido es altamente tóxico; Evite el contacto con la piel, ojos o membranas mucosas. Evite respirar el polvo durante la preparación y medición.

8. Visualización de estrés fibra desintegración causada por fotoactivación de NIR

1. después de la fijación, utilizar Alexa 594-phalloidin (Añadir 5 μl de la solución madre de 6.6 μm a 200 μL de PBS para tinción, incubar durante 25 min a temperatura ambiente) a la mancha y visualizar las fibras de estrés. Visualizar las imágenes de Alexa 594-phalloidin (Ex 581 nm/Em 609 nm) usando un sistema de filtro.
2. Incubar las células por 5 min en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) a temperatura ambiente. Después de teñir, lavar las muestras con PBS y tomar por separado imágenes fluorescentes de las fibras de estrés y núcleos.

Resultados

El diseño de la construcción de la enzima-UCNP enjaulado se ilustra en la figura 1. La enzima PKA se reaccionó primero con 2-Nitrobencilo bromuro para generar un PKA inactiva enjaulado, y luego fue electrostático inmovilizada en la superficie de UCNP. UCNPs emitir la luz convertida y en consecuencia photolytically hienden los grupos Nitrobencilo o Cys 199 y Cys 343, generando la PKA activada. Imágenes TEM y el análisis de Bradford confirman que el PKA y el PK...

Discusión

Previamente, Hofmann y compañeros de trabajo encontraron que cambios morfológicos dramáticos fueron observados en células REF52 después de la microinyección de la PKA gratis¹⁹. En otro estudio, el grupo de Lawrence demostró que PKA enjaulado puede ser activado en vivo, lleva a cambios morfológicos y la desintegración de las fibras de estrés cuando es expuesto a UV fotólisis²⁰de. Anteriores informes sobre explotación de UV de producir luz por fotoactivación demostra...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
fuerte
Tris(hidroximetil)aminometano	Sigma	154563
Cloruro de magnesio hexahidratado	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Cloruro de sodio	Sigma	31434
Cloruro de potasio	Sigma	12636
Acetato de itrio  hidrato	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Acetato de tulio (III) hidrato	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 y middot; xH2O
Acetato de iterbio (III) tetrahidrato	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Ácido oleico	Sigma	364525
Metanol	macron	304168
Hidróxido de sodio	Sigma	30620
Fluoruro de amonio	J.T.Baker	69804
IGEPAL  CO-520	Sigma	238643
Ciclohexano	J.T.Baker	920601
Hidróxido de amonio (28% - 30%)	J.T.Baker	972101
Ortosilicato de tetraetilo	Sigma	8658
DL-Ditiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hidroximaleimida (NHM)	Sigma	226351	PKA reactivo bloqueante de actividad
Prionex solución estabilizadora de proteínas a partir de colágeno de cerdo	Sigma	81662	Solución estabilizadora
de proteínas 2-bromuro de nitrobencilo (NBB)	Sigma	107794	PKA reactivo para jaulas
8-(4-clorofeniltio)adenosina 3′,5′-monofosfato cíclico sal sódica	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Piruvato quinasa/deshidrogenasa láctica enzimas de músculo de conejo	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosina 5'-trifosfato disódico	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reducido de dipotasio	Sigma	N4505
Fosfoenolpiruvato	Sigma	P7127	PEP
Reactivo de ensayo de proteínas Coomassie, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford
Proteína quinasa dependiente de AMPc	Promega	V5161	Control de la actividad PKA
PET15b-PKACAT plásmido	Addgene	#14921
PKaede-MC1 plásmido	CoralHue	AM-V0012
Solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, glucosa alta, piruvato	Gibco	12800-017	Cell medio de cultivo
Leibovitz L-15 Medio	Biological Industries	01-115-1A	Medio de cultivo celular
Suero fetal bovino	Industrias Biológicas 04-001-1A
Paraformaldehído	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Colorante de tinción de núcleo
Alexa 594-phalloidina	Invitrogen	A12381	Colorante de tinción de F-actina
5(6)-Carboxitetrametilrodamina	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Kit de ensayo de proteínas	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubos/Clasificación nominal del filtro MWCO 12,000 - 14,000 Da Membrane	Filtration Products, Inc.	1430-33	Membrana de diálisis
Millex-HV Unidad de filtro de jeringa, 0,45 y micro; m, PVDF, 13 mm, EMD esterilizado por rayos gamma	Milipore	SLHVX13NL
EquipmentDispersión dinámica de
la luz/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Microscopio electrónico de transmisión	JEOL	JEM-1400
Espectrofotómetro de fluorescencia	Agilent Technologies 10075200		Cary Eclipse
Espectrofotómetro UV-Vis	Agilent Technologies 10068900		Cary 50
Microscopio de fluorescencia	Olympus	IX-71
950 nm filtro de paso largo	Thorlabs	FEL0950
espejo dicroico de 850 nm paso corto	Chroma	NC265609
RT3 color Sistema CCD	SPOT	RT2520
Iluminación de fluorescencia	PRIOR	Lumen 200
980 nm Láser de diodo infrarrojo	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Fuente de luz puntual	UVATA	UVATA-UPS412	Con un LED UPH-056-365 nm a 200 mW/cm2
Sensor térmico de pila	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Sistemas de dispensación de microinyección intracelular
PC-10 Tirador de aguja	Manómetro Narishige	PC-10
Manómetro digital	Lutron	PM-9100
Un eje Micromanipulador hidráulico de aceite	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrífuga, refrigerada	Thermo Scientific	75002421