Determinar la frecuencia inhibidora óptima para las células cancerosas Usando Tumor Tratamiento Fields (TTFields)

Los campos tratamiento de tumores (TTFields) son una modalidad anti-mitótico para el tratamiento de glioblastoma multiforme y potencialmente otros tipos de cáncer. Los campos se entregan a través de la aplicación continua de baja intensidad (1-3 V / cm), de frecuencia intermedia (100-500 kHz), campos eléctricos alternos a la región del tumor ^{1, 2.} Aplicación TTFields in vitro e in vivo ha demostrado inhibir tanto el crecimiento de diversas líneas de células cancerosas y la progresión de los tumores en varios modelos animales de tumores ^{1, 2, 3, 4, 5, 6, 7.} ensayos clínicos piloto y estudios aleatorios más grandes en pacientes con tumores sólidos, incluyendo glioblastoma y el cáncer de pulmón de células no pequeñas, tienen demonstCalificó la seguridad y la eficacia de la aplicación TTFields continua ^{8 , 9 , 10} . Se encontró que la eficacia de los TTFields era: (1) dependiente de la frecuencia, con frecuencias óptimas específicas que conducían a la reducción más alta en los recuentos celulares de líneas celulares de diferentes orígenes ^{1 , 2 , 4 , 5 , 6 , 7} ; (2) dependiente de la intensidad del campo eléctrico, con un umbral mínimo de actividad de alrededor de 1 V / cm y intensidades más potentes ^{1 , 2 , 7 , 11} ; (3) aumentado cuando la duración del tratamiento era más larga ⁵ ; Y (4) mayor cuando se aplicaron 2 TTFields direccionales perpendicularmente a cada unoEr, en comparación con los campos eléctricos aplicados desde una sola dirección ¹ . Basado en los hallazgos anteriores, los TTFields pueden aplicarse a pacientes durante largos períodos de tiempo utilizando 2 conjuntos de conjuntos de transductores localizados en la piel de los pacientes para maximizar las intensidades del campo eléctrico en el lecho tumoral ^{12 , 13} .

El estudio de los efectos de TTFields sobre células cancerosas in vitro proporciona actualmente la única manera de determinar la frecuencia óptima para aplicar a un tipo de tumor específico. La prueba de la frecuencia óptima requiere un dispositivo que permita la aplicación de diferentes frecuencias en el rango de 100-500 kHz ya intensidades de hasta 3 V / cm de raíz media cuadrada (RMS) al cultivo celular. Como la aplicación de TTFields produce calor, el sistema de aplicación requiere la capacidad de disipar el calor excesivo manteniendo un control estricto sobre la temperatura.

Varios dispositivos fuerone desarrollado a lo largo de los años para permitir la aplicación TTFields a cultivos de células ^{1, 2, 5, 14, 15, 16.} En todos estos dispositivos, los electrodos utilizados fueron aisladas con el fin de evitar las salvedades implicados con el uso de electrodos conductores, como el intercambio de electrones en la superficie del electrodo y la liberación de iones metálicos tóxicos en el medio ^1. La principal diferencia entre los diversos sistemas de aplicación TTFields evaluados es el tipo de aislamiento electrodo utilizado, ya sea con electrodos hechos de hilos metálicos aislados con una película delgada de aislante ^{2, 14, 15, 16} o con un material de alta constante dieléctrica (por ejemplo, magnesio plomo titanat niobato de plomoe (PMN-PT)) ^6. Mientras que los electrodos de alambre aislado ofrecen una solución relativamente simple y rentable para la aplicación TTFields, a menudo son limitados por el alto voltaje requerido para conseguir intensidades de campo eléctrico efectivo por encima del umbral 1 V / cm y por la superficie disponible para el chapado de células, como la distancia entre los electrodos es relativamente pequeño. Los sistemas basados ​​en electrodos aislados utilizando un material de alta constante dieléctrica requieren capacidades de diseño y fabricación especiales, sin embargo, que no requieren alta tensión y pueden ofrecer un área más grande para el crecimiento celular entre los electrodos.

El sistema de aplicación TTFields in vitro utilizado en este trabajo pertenece a la última clase de sistemas, con la unidad de base que es una placa de Petri (plato TTFields, véase la Figura 1) compuesto de alta constante dieléctrica de cerámica (es decir, PMN-PT). Dos pares de electrodos se imprimen perpendicularmente sobre la Wal exteriorls de un plato TTFields para permitir la aplicación de campos eléctricos de 2 direcciones. Los electrodos están conectados a un generador de forma de onda sinusoidal y un amplificador, que permiten la aplicación TTFields en la gama de frecuencias de 50-500 kHz. Con el fin de disipar el exceso de calor, los platos TTFields se mantienen dentro de un incubador refrigerado, con el medio de control de temperatura realizó utilizando la vigilancia constante de la temperatura del plato y ajustes a la tensión aplicada por el sistema. En la práctica, el establecimiento de la incubadora a una temperatura más baja daría lugar a intensidades de campo eléctrico más altos, ya que el sistema aumenta la tensión hasta que se alcanza la temperatura objetivo dentro del plato. La diferencia entre la temperatura dentro del plato y la temperatura de la incubadora puede conducir a una cierta evaporación, en función de los gradientes de temperatura; Por lo tanto, el medio de cultivo tiene que ser reemplazado cada 24 h para mantener condiciones de crecimiento adecuadas.

El protocolo a continuacióndescribe el procedimiento experimental para optimizar la aplicación de las frecuencias TTFields a las células cancerosas de manera que una reducción máxima de recuento de células y una reducción en el potencial de las células supervivientes para formar colonias se consiguen.

1. TTFields Sistema de Aplicación In Vitro - Placa Base y Mantenimiento del Plato

1. Enjuague los platos y las cubiertas del plato con agua corriente del grifo. A continuación, enjuagar con agua desionizada y secar al aire con la cara hacia abajo.
2. Si se ha añadido un agente quimioterapéutico / fármaco a los platos en un experimento anterior, se llena cada plato con una solución de detergente ligero al 5% y se deja durante la noche.
   1. Enjuague bien los platos con agua corriente del grifo para evitar cualquier rastro de detergente dentro del plato. Enjuague los platos y las cubiertas del plato con agua desionizada y enfríe con el aire hacia abajo.
3. Inserte los platos limpios y secos con sus cubiertas en bolsas de esterilización. Sellar y colocar las bolsas en un autoclave, con los platos boca abajo. Autoclave durante 30 minutos a no más de 121 ° C.
4. Ajustar el autoclave en un programa seco, abrir parcialmente la puerta del autoclave y secar los platos durante 30 min.
5. Limpie la placa base con un paño ligeramente humedecido con etanol al 70%.
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Configuración 2. Experimento

Nota: Todos los equipos y materiales utilizados en este protocolo se describen en la Lista de materiales. Todos los pasos siguientes se deben realizar dentro de una cabina de flujo laminar, mientras que se mantienen las condiciones estériles.

1. Preparar TTFields limpios y estériles platos y cubiertas, como se describe en la sección 1. limpie la placa de base con un paño ligeramente humedecido con 70% de etanol.
2. Instalar los platos TTFields con las cubiertas sobre la placa base presionando suavemente hacia abajo en el plato y girando en sentido horario en alrededor de 5 mm hasta el borde de las cerraduras de plato en los tres pasadores en la placa base. Colocar un cubreobjetos de 22 mm estéril (plástico o vidrio tratado) en la parte inferior de cada plato.
3. Preparar la suspensión de células en medio de crecimiento completo (medio de Eagle modificado de Dulbecco para U-87 MG y F98; RPMI para A2780 y OVCAR-3; suplementado como se describe en Lista de materiales).
   NOTA: La CEconcentraciones ll dependen de la duración tipos de células y experimento, el crecimiento celular confluente -90% 80% no debe ser superado por el final del experimento.
   PRECAUCIÓN: Las líneas celulares humanas pueden representar un riesgo biológico y deben ser manejados con las medidas de seguridad apropiadas.
4. Coloque 200 l de suspensión de células (por lo general 5,000-20,000 células en 200 l para un experimento de 72-h, dependiendo del tiempo de duplicación) como una gota en el centro de cada cubreobjetos y cubrir con las tapas de los recipientes.
5. Incubar a 37 ° C en una incubadora de CO ₂ hasta que las células se adhieren; una noche de incubación es posible en esta etapa.
6. Aspirar los fluidos de la gota utilizando una pipeta de 200 o 1000-l.
7. pipetear suavemente 2 ml de medio de crecimiento completo para llenar cada plato. Utilice una punta estéril para pipeta y suavemente toque en los bordes cubreobjetos para liberar las burbujas de aire atrapadas de vez en cuando bajo la diapositiva.
8. Cubra los platos con sus tapas y los colocan inside un incubador de _CO2 a 37 ° C hasta el inicio del tratamiento TTFields.

3. Aplicación TTFields

1. Transferir las placas de base con los platos TTFields unidos a un refrigerado CO ₂ incubadora.
   NOTA: In vitro aplicación TTFields generará calor; Por lo tanto, se requiere una incubadora refrigerada para compensar el calentamiento de los platos. Más altas intensidades TTFields producirán más calor y requieren temperaturas ambiente inferior incubadora (véase la Tabla 1). Clínicamente TTFields pertinentes intensidades se consiguen cuando la temperatura de la incubadora para su aplicación TTFields está en el intervalo de 18-30 ° C.
2. Conectar el conector del cable de la hembra plana a la placa base. Conmutar el generador de campos TTF sucesivamente.
3. Iniciar los campos TTF en el software de sistema de aplicación in vitro y seleccionar la configuración del experimento.
   1. Definir un nuevo experimento. Escriba el nombre de la experiment y el propietario experimento en la interfaz de usuario del software en la pantalla del ordenador. Ajustar la frecuencia y la temperatura objetivo para cada placa plato o base.
4. Iniciar la aplicación TTFields uso del software.
5. Verificar que todos los platos están conectados correctamente y aparecen de color azul claro en el monitor. Si un plato es un círculo con un marco rojo (lo que significa que no está conectado correctamente), presione suavemente hacia abajo y gire lentamente hacia atrás y adelante hasta que los contactos se restauran y el plato aparece de color azul claro.
6. Dejar los TTFields en el sistema de aplicación vitro que se ejecutan durante un máximo de 24 h.
7. Si el experimento llega a su punto final, detener el experimento haciendo clic en el botón FIN Experimento en el software y vaya al paso 5. En caso contrario, haga clic en el experimento PAUSA.
8. Desconectar el conector del cable plano de la placa base. Retire la placa base con los platos de la incubadora en una cabina de flujo laminar.
9. Vuelva a colocar el medio en todo el platoes cada 24 h y devolver la placa de base a la incubadora refrigerada. Conectar la placa base al generador usando el cable plano. Continuar con el experimento haciendo clic en el botón CONTINUAR.

4. Muestras de Control

Nota: Se cultivan las células de control en condiciones similares a las células tratadas con TTFields, con exclusión de aplicación TTFields.

1. muestras de control de placa con la misma suspensión y en una superficie similar utilizado para el recubrimiento de muestras tratadas con TTFields.
2. Coloque platos de control en un incubador de _CO2 a 37 ° C.
3. Reemplazar el medio en los platos cada 24 h para que coincida con las condiciones de medio plato tratados con TTFields.

Fin 5. Experimento

1. Después de hacer clic en Experimento FIN, esperar a que el software para recuperar todos los registros del sistema y para guardar los registros en la computadora.
2. Utilice el botón Reports para revisar la temperatura, corriente y resistencia registro files de cada placa de base para comprobar que todos los platos fueron tratados de acuerdo con el plan experimental.
   NOTA: Todos los informes y registros se guardan en el equipo después del final del experimento y pueden ser revisados en cualquier momento.
3. Desconectar el generador de campos TTF.
4. Desconectar el cable plano de la placa base y retirar de la incubadora.
5. Para quitar un plato de cerámica, presione hacia abajo y girar el plato en sentido antihorario para desbloquearlo de la placa base.
6. Tomar los platos en una cabina de flujo laminar y asépticamente retirar los cubreobjetos. Transferirlos a estériles placas de Petri que contienen solución salina medio fresco o tamponada con fosfato (PBS) para continuar la inspección y evaluación.

6. Evaluación del efecto de los campos TTF

NOTA: efectos TTFields' se pueden determinar de varias maneras. Utilice uno o más de los métodos siguientes para comparar las células tratadas con las células control no tratadas:

1. Conteo de células
   1. Eliminar el medio / PBS de cada plato que contiene cubreobjetos.
   2. Añadir 0,5 ml de 0,25% de tripsina / EDTA a cada placa y se incuba durante un máximo de 10 min (es decir, hasta que las células comienzan a desprenderse de la superficie de cubreobjetos) a 37 ° C en una incubadora de CO _2.
   3. Añadir 0,5 ml de medio de crecimiento completo para neutralizar la tripsina y volver a suspender las células pipeteando suavemente arriba y abajo.
   4. Contar las células utilizando cualquier técnica de recuento de células estándar que es compatible con contando concentraciones de células bajos (es decir, alrededor de 20 000 células / ml).
2. ensayo clonogénico
   1. Placa de un número similar de células (100-500 células por placa) de cada plato en nuevos, placas de Petri estériles o placas de 6 pocillos que contenían 2 ml de medio de crecimiento completo fresco.
   2. Incubar en una incubadora de _CO2 a 37 ° C durante 1-3 semanas (dependiendo de las propiedades de cada línea celular) hasta que las colonias que constan de ~ 50 se forman células. Evaluar la célulanúmero por colonia por microscopía de luz.
   3. Retirar el medio y aclarar con PBS.
   4. Retire el PBS y añadir metanol enfriado con hielo (1 ml). Incubar a -20 ° C durante 10 min o más.
   5. Eliminar el metanol.
   6. Añadir solución de cristal violeta (0,1% w / v en 25% v / v de metanol en agua) y se incuba durante 20 min.
      PRECAUCIÓN: Cristal violeta es un carcinógeno potencial; utilizar guantes mientras se trabaja con cristal violeta.
   7. Retire el cristal violeta, se lava 3 veces con agua desionizada y se seca al aire.
   8. Contar las colonias formadas en cada plato.

Los resultados después de la aplicación de TTFields al escanear diferentes frecuencias pueden cuantificarse basándose en ensayos diferentes, tales como recuentos celulares, ensayos colorimétricos, ensayos clonogénicos y exámenes sobre los cambios en el número de células invasoras usando una cámara Boyden situada dentro de un TTFields especial de pared alta Plato de cultivo celular. Una planificación experimental cuidadosa basada en tiempos de duplicación de células predeterminados permitirá que las células alcancen el número máximo de eventos mitóticos durante la duración del tratamiento, maximizando así los resultados del tratamiento.

La Figura 2 ilustra un resultado de exploración de frecuencia típico para un recuento de células promedio ( es decir, el número de células) y el ensayo clonogénico de A2780 ( es decir, células de cáncer de ovario humano, Figura 2A ) 7 y F-98 ( es decir, células de glioma de rata;"> Figura 2B) 1 trata con dos TTFields direccionales (gama de frecuencia: 100-500 kHz, RMS: 1,7 V / cm, y temperatura de la incubadora:. 18 ° C) Los resultados demuestran una reducción significativa en los recuentos de células en todas las frecuencias aplica , con la reducción máxima a 200 kHz para todas las líneas celulares ensayadas (ANOVA de una vía con comparación múltiple). la frecuencia óptima conduce a la mayor reducción en el potencial clonogénico fue el mismo para ambas células A2780 y F98 (Figuras 2B y C) . el coeficiente de correlación de Pearson entre el número de células y el efecto clonogénico en cada frecuencia era 0,967 (p = 0,002) y 0,755 (p = 0,083) para A2780 y F98, respectivamente.

La Figura 3 demuestra un resultado de barrido de frecuencia para el conteo de células promedio para OVCAR-3 (es decir, células de cáncer de ovario humano; figura 3A) y U-87 MG (es decir, células de glioma humano; Figura 3B) células tratadas con dos direcciones de TTFields a diferentes intensidades (RMS: 1.7, 1.3, y 1.0 V / cm, respectivamente, y temperatura de la incubadora: 18 ° C, 24 ° C, y 28 ° C, respectivamente). Los resultados demuestran que mientras que todavía hay una reducción significativa en OVCAR-3 recuento de células después del tratamiento con TTFields 1,3-V / cm (temperatura de la incubadora: 24 ° C), el efecto es relativamente pequeño en comparación con los resultados obtenidos cuando las células fueron tratadas con 1,7 V / cm (temperatura de la incubadora: 18 ° C). las células U-87 MG tratados con TTFields 1,0-V / cm (temperatura de la incubadora: 28 ° C) también demuestran una tendencia similar en la reducción del número de células como cuando se tratan con 1,7 V / cm, sin embargo, el efecto no fue significativo a intensidades inferiores .

figurE 1 . Los platos TTFields se instalaron en una unidad de placa de base y se conectaron al cable de control TTFields plano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2 . Las exploraciones de frecuencia para la determinación de la frecuencia inhibitoria TTFields óptima para las células (A) A2780 y (B) F98. Las células se trataron durante 72 h con TTFields de diferentes frecuencias (1,7 V / cm y 100-500 kHz). El efecto del tratamiento con TTFields se estimó utilizando el recuento celular y los ensayos clonogénicos. La flecha indica la frecuencia óptima. Los resultados representan promedios ± DE basados ​​en al menos 6 repeticiones para cada frecuencia ensayada. ( C ) Imágenes representativas del clonogénico s urvival de células A2780 después del tratamiento TTFields a varias frecuencias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3. Exploraciones de frecuencia para la determinación de la frecuencia inhibidora TTFields óptimas para (A) OVCAR-3 y (b) U-87 células de Mg. Las células fueron tratadas durante 72 h con TTFields de diferentes frecuencias (100-500 kHz) e intensidades (OVCAR-3: 1,3 y 1,7 V / cm; U-87 MG: 1,0 y 1,7 V / cm). El efecto del tratamiento con campos TTF se estimó mediante el recuento de células. La flecha indica la frecuencia óptima. Los resultados representan las medias ± SD a base de al menos 6 repeticiones en cada frecuencia de prueba.pg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1. Incubadora temperatura ambiente y espera intensidades TTFields dentro del plato TTFields.

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna, Zeevi Einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa, Tal Orna, y D. Kirson Eilon D se pagan a los empleados Novocure Ltd, Israel. Weinberg Uri es un empleado pagado de Novocure GmbH, Luzern. Yoram Palti es accionista en Novocure Ltd, Nueva York.