Determinar la frecuencia inhibidora óptima para las células cancerosas Usando Tumor Tratamiento Fields (TTFields)

El objetivo general del sistema de aplicación in vitro TTFields es investigar su efecto sobre las células cancerosas de diferentes tipos de tumores, para guiar la administración clínica de TTFields y optimizar el resultado del tratamiento. Este método puede ayudar a definir el efecto de diferentes parámetros de TTField en las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que permite la identificación preclínica de la frecuencia TTField más efectiva que inhibe el crecimiento de una línea celular cancerosa específica, que finalmente podría aplicarse en humanos.

Mediante una ligera modificación de esta técnica, es posible probar la eficacia del tratamiento combinado de TTField y otras modalidades de tratamiento, como los agentes quimioterapéuticos y la radioterapia. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Yaara Porat, investigadora de nuestro equipo. Para comenzar, instale placas TTFields con cubiertas en una placa base y prepare ocho placas adicionales que se utilizarán para cultivar celdas de control.

Coloque un cubreobjetos estéril de dos milímetros en el fondo de cada plato. A continuación, suspenda cinco veces 10 a la cuarta pilas U-87 MG en un mililitro de medio DMEM. El número adecuado de células plateadas en cada placa depende de las propiedades de la línea celular en uso.

Es crucial calibrarlo antes del experimento para evitar el crecimiento excesivo de las células. Pipetear 200 microlitros de la suspensión de la célula en cada cubreobjetos de forma que se forme una gota en su superficie, y cubrir los platos con sus tapas. Incubar todos los platos a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono durante la noche para permitir que las células se adhieran.

Una vez que las células estén unidas, aspire el medio de los cubreobjetos con una pipeta de 200 microlitros, luego pipetee cuidadosamente dos mililitros de medio de crecimiento completo en cada placa. Golpee suavemente con una punta de pipeta estéril los bordes del cubreobjetos para liberar las burbujas de aire atrapadas debajo del portaobjetos. Después, incubar las células a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono hasta que comience el tratamiento TTFields.

Para comenzar el tratamiento con TTFields, retire la placa base de la incubadora a 37 grados centígrados y colóquela en una incubadora de dióxido de carbono refrigerada. La temperatura de la incubadora refrigerada determinará la intensidad del campo eléctrico. Es importante utilizar la intensidad adecuada, que depende de la sensibilidad de la célula a los TTFields.

A continuación, conecte un conector hembra de cable plano en la placa base y encienda el generador TTFields. Abra el software dedicado al sistema de aplicación in vitro TTFields. Después de definir un nuevo estudio introduciendo los nombres del experimento y del experimentador, ajuste la frecuencia y la temperatura objetivo de cada plato.

Haga clic en el botón de inicio para iniciar el tratamiento TTFields en el software y verifique si todos los platos aparecen en azul claro en el monitor, lo que confirma su conexión correcta. Para restablecer la conexión, presione suavemente la antena hacia abajo y gírela lentamente hacia adelante y hacia atrás hasta que la antena aparezca de color azul claro en la pantalla. Después de 24 horas del tratamiento, detenga el experimento en el software haciendo clic en pausa.

Desconecte el conector de cable plano de la placa base y luego coloque la placa base en la cabina de flujo laminar, luego retire la placa base con los platos y las celdas de control cultivadas en condiciones estándar de sus incubadoras. Reemplace el medio en todos los platos con un medio de crecimiento completo fresco, luego coloque las celdas de control en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius y devuelva la placa base a la incubadora refrigerada. Vuelva a conectar la placa base al generador.

Continúe el tratamiento haciendo clic en el botón continuar. Una vez completado el tratamiento, finalice el experimento haciendo clic en el botón finalizar experimento en el software, luego guarde los datos cargados desde el sistema. Después de apagar el generador TTFields, desconecte el cable plano de la placa base y retire el sistema de la incubadora.

Presione hacia abajo y gire el plato de cerámica en sentido contrario a las agujas del reloj para separarlo de la placa base. A continuación, transfiera asépticamente los cubreobjetos tratados y de control TTFields a placas de Petri estériles que contengan medio fresco para su posterior evaluación. Para evaluar el efecto del tratamiento con TTFields, retire el medio de cada placa que contenga cubreobjetos, luego agregue 0,5 mililitros de 0,25% de tripsina / EDTA e incube las placas a 37 grados Celsius, 5% de dióxido de carbono hasta que las células se desprendan de la superficie del cubreobjetos.

Neutralice la tripsina con 0,5 mililitros de medio de crecimiento completo y vuelva a suspender las células pipeteando suavemente la suspensión hacia arriba y hacia abajo. Por último, recuento de las células mediante citometría de flujo. Aquí se presentan los resultados del escaneo de frecuencia realizado en células A2780, revelando la influencia dependiente de la frecuencia de los TTFields en el crecimiento y la capacidad clonogénica de las células estudiadas.

La eficacia del tratamiento más destacada se observó cuando se aplicó una frecuencia de 200 kilohercios. Se investigó la eficacia del tratamiento con TTFields llevado a cabo a dos intensidades diferentes en células OVCAR-3. El estudio muestra una clara relación entre la intensidad aplicada y el resultado del tratamiento, con mayor actividad inhibitoria del crecimiento a mayor intensidad de campo.

Independientemente de la intensidad de campo aplicada, el efecto más fuerte del tratamiento TTFields se observó a una frecuencia de 200 kilohercios. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de 30 minutos al día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar el derrame de medios y mantener los platos equilibrados al transferirlos de la incubadora a la campana y viceversa.

Después de la aplicación de TTField, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo, el análisis de proteínas de alanina o la microscopía inmunofluorescente para investigar más a fondo el resultado del tratamiento y el mecanismo subyacente a la actividad observada. Esta técnica se utiliza para determinar las frecuencias óptimas de TTFields que se deben aplicar en el entorno clínico para diferentes tipos de cáncer. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo planificar y ejecutar experimentos in vitro de TTFields.

No olvide que trabajar con líneas celulares humanas puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como guantes y ropa protectora, al realizar este procedimiento.