Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca 2+ Sensor de Captura

Resumen

Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER ⁺ para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K _d .

Resumen

Los transitorios intracelulares de calcio (Ca2 ⁺ ) evocados por estímulos extracelulares inician una multitud de procesos biológicos en organismos vivos. En el centro de la liberación de calcio intracelular se encuentran los principales organelos de almacenamiento de calcio intracelular, el retículo endoplasmático (RE) y el retículo sarcoplasmático (SR) más especializado en las células musculares. La liberación dinámica de estos orgánulos está mediada por el receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), con relleno que ocurre a través de la bomba sarco / retina de calcio cálcica (SERCA). Se creó un sensor de calcio codificado genéticamente (GECI) llamado CatchER para monitorizar la liberación rápida de calcio de la ER / SR. En este caso, los protocolos detallados para la transfección y expresión de la mejorada, ER / SR-GECI objetivo CatchER ⁺ en células HEK293 y C2C12 y su aplicación en la monitorización de IP3 R, RyR, y SERCA mediada por la bomba de calcio transitoriaS en células HEK293 usando microscopía de fluorescencia. El agonista o inhibidor receptor de elección se dispersa en la solución de cámara y los cambios de intensidad se registran en tiempo real. Con este método, se observa una disminución del calcio ER con activación de RyR con 4-cloro-m-cresol (4 cmc), la activación indirecta de IP3R con adenosina trifosfato (ATP) e inhibición de la bomba SERCA con ciclopiazónicos Ácido (CPA). También discutimos protocolos para determinar el K _d in situ y la cuantificación basal [Ca ^{2 +} ] en C2C12 células. En resumen, estos protocolos, utilizados junto con CatchER ⁺ , pueden provocar la liberación de calcio mediada por receptores de la ER con aplicación futura en el estudio ER / SR relacionadas con calcio patologías.

Introducción

Los atributos espacio-temporales de los transitorios intracelulares de calcio (Ca ²⁺ ) activan diversas funciones biológicas ¹ . Estos eventos de señalización de Ca2 ⁺ son desencadenados extracelularmente a través de diferentes estímulos y controlados intracelularmente por el principal organelo de almacenamiento de Ca2 ⁺ y por numerosas bombas de Ca2 ⁺ , canales y proteínas de unión a Ca2 ⁺ . Ca ^{2 +} transitorios pueden ser significativamente alterado como resultado de los defectos con la modulación de la señal, dando lugar a diferentes enfermedades [ ^2] . Debido a la velocidad y complejidad del sistema de señalización de Ca ^{2 +} , con el retículo endo- (ER) y sarcoplásmico (SR) en el centro, las sondas de Ca ²⁺ genéticamente codificadas que se han optimizado para la expresión de mamíferos con cinética rápida son necesarias Para observar global y local Ca ^{2 +} cambios en diferentes células [ ^3] .

El ER y el SR, Su contrapartida en las células musculares, son los principales organelos de almacenamiento intracelular de Ca ²⁺ y actúan como sumideros de Ca ²⁺ que ayudan a amplificar la señal de Ca ^{2 + 4} . El ER / SR es una parte integral de Ca ^{2 +} señalización con funciones duales como un transmisor y receptor de señales [ ^5] . El receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R) son receptores de liberación de Ca2 ⁺ localizados en las membranas de la ER / SR reguladas por Ca2 ^{+ 6} . Otros agentes estimulan directa o indirectamente la función de estos receptores. El 4-cloro-m-cresol (4 cmc) es un potente agonista del RyR, que tiene una sensibilidad 10 veces mayor que la cafeína para inducir la liberación de SR Ca ²⁺ , donde ambos se emplean regularmente para estudiar la liberación de Ca ²⁺ mediada por RyR en Sanas y enfermas ⁷ . ATP aumenta el Ca ²⁺ mediado por IP ₃Arrendamiento a través del IP ₃ R ⁸ . El ATP se une al receptor purinérgico P2YR, un receptor acoplado a proteína G (GPCR), desencadenando la producción de IP3 que se une al IP3R para liberar Ca2 ⁺ del ER 9,10. La bomba de ATPasa de calcio reticular sarco-endoplasmático (SERCA) es una bomba ATPasa de tipo P, también localizada en la membrana ER / SR que reduce el Ca ²⁺ citosólico y rellena el ER / SR bombeando activamente el ion en el lumen ER / SR ¹¹ . Los inhibidores específicos de la bomba SERCA incluyen tapsigargina, de Thapsia garganica y ácido ciclopiazónico (CPA), de Aspergillus y Penicillium . CPA tiene una afinidad baja para la bomba y bloquea de forma reversible el punto de acceso Ca ^{2 + 12} . La tapsigargina, por otra parte, se une irreversiblemente a la bomba libre de Ca2 ⁺ en el residuo F256 en la hélice M3 con nanomolAr afinidad ¹¹ . El análisis y la cuantificación de los cambios implicados en los eventos estimulados con Ca ²⁺ ha sido y sigue siendo un desafío. Dado que la ER / SR es el principal subcelular Ca ^{2 +} conteniendo el compartimiento con una función central en la propagación de la señal de Ca ^{2 +} , mucho trabajo se ha centrado en la comprensión de ER / SR Ca ^{2 +} señalización [ ^5] .

La creación de colorantes sintéticos de Ca ^{2 +} ayudó a avanzar el campo y la práctica de la formación de imágenes de Ca ²⁺ . Aunque los colorantes, como Mag-Fura-2, han sido ampliamente utilizados para medir Ca ^{2 +} compartimentado en diferentes células, ^{13 , 14 , 15} tienen limitaciones tales como carga de colorante desigual, fotoblanqueo y la incapacidad para ser dirigidos a organelos específicos . El descubrimiento de la proteína verde fluorescente (GFP) y el avance de la proteína fluorescente-Basado Ca ^{2 +} sondas ha propulsado el campo de Ca ^{2 +} imágenes hacia adelante ¹⁶ . Algunos de los GECI existentes son los pares de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) que implican la proteína fluorescente amarilla (YFP), la proteína fluorescente cian (CFP), la calmodulina y el péptido de unión a M13 ^{17 , 18} . Los GECI basados ​​en la troponina C también están disponibles como pares FRET de CFP y citrina y como sondas únicas de fluoróforo ^{19 , 20 , 21} . Otros, como GCaMP2 y R-GECO son sensores de fluoróforos individuales que implican calmodulina ^{22 , 23} . Para superar las limitaciones de la afinación estrecha de K _d 's y la unión cooperativa asociada con múltiples Ca ^{2 +} vinculante sitios encontrados en su Ca ^{2 +} vinculante dominios [ ^24] , una nueva clase de calcio senSors se creó mediante el diseño de un sitio de unión Ca ^{2 +} en la superficie del barril beta en un cromóforo sensible ubicación de la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) [ ^{25 , 26]} . Este sensor altamente aclamado, llamado CatchER, tiene un Kd de ~ 0.18 mM, ak _en cerca del límite de difusión, y ak _off de 700 s ^-1 . CatchER se ha utilizado para monitorear receptor mediada ER / SR liberación de calcio en diferentes líneas de células de mamíferos como HeLa, HEK293 y C2C12 [ ^25] . Debido a su rápida cinética, CatchER se utilizó en flexor digitorum brevis (FDB) las fibras musculares de los jóvenes y los viejos amigos Virus B NIH Jackson (FVB) ratones para revelar que más Ca ^{2 +} permanece en el SR después de 2 s de despolarización en el FDB Fibras de los ratones de edad en comparación con la de los ratones jóvenes [ ^27] . Para superar su baja fluorescencia a 37 ° C, lo que dificulta sus aplicaciones en imágenes de calcio de mamíferos, Hemos desarrollado una versión mejorada de CatchER llamada CatchER ⁺ . CatchER ⁺ muestra una fluorescencia mejorada a 37ºC para una mejor aplicación en células de mamífero. Se incorporaron mutaciones adicionales en CatchER para mejorar la termoestabilidad y la fluorescencia a 37 ° C ^{28 , 29} , para crear CatchER ⁺ . CatchER ⁺ exhibe un aumento de seis veces en su relación señal / ruido (SNR) sobre CatchER ³⁰ .

Aquí se presentan los protocolos para el cultivo y transfección de células HEK293 y C2C12 con CatchER ⁺ y su aplicación para la monitorización de transitorios mediados por receptores ER / SR. Se muestran resultados representativos para CatchER ⁺ expresado en células HEK293 tratadas con 4 cmc, CPA y ATP. También proporcionamos un protocolo para determinar el K _d in situ de CatchER ⁺ en células de mioblastos C2C12 y quaNación de [Ca ²⁺ ] basal.

Protocolo

1. Preparación de la diapositiva

1. Coloque láminas de microscopio de vidrio de 22 mm x 40 mm en placas de cultivo celular de 6 cm, 1 diapositiva por plato.
2. Exponga cada lado de cada diapositiva, así como el plato de 6 cm a la luz ultravioleta (UV) durante 15-20 minutos para esterilizar en una campana estéril.
3. Cubra los platos con los portaobjetos dentro con parafilm y guarde a 4 ° C hasta que esté listo para usar.

2. Preparación de medios, tampones, soluciones y reactivos

1. Preparar 1 L de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en agua desionizada y añadir HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM y EGTA 1 mM. Ajustar a pH 7,2-7,3 con NaOH. Filtrar el tampón con un filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada en autoclave.
2. Prepare 900 ml de medio de Eagle modificado por Dulbecco de alta glucosa (DMEM) h en agua desionizada. Se añadió NaHCO _ { ₃ } 44 mM y se ajustó el pH a 7,2 - 7,3 con HCl. Filtrar el medio con un filtro de 0,22 μm en una botella esterilizada en autoclave. Añadir 100 ml de bovino fetal(FBS) al medio para hacer la concentración de FBS al 10%. Almacenar a 4 ° C.
3. Preparar 1 l de tampón intracelular (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, CaCl2 0,2 ​​mM, EGTA 0,5 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,25. El [Ca ²⁺ ] final será ~ 100 nM. Antes del uso, añadir ATP 0,5 mM. Almacenar a temperatura ambiente.
4. Preparar 1 l de tampón Ringer (NaCl 121 mM, K2HPO4 2,4 mM, KH2PO4 0,4 ​​mM, HEPES 10 mM y MgCl2 1,2 mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,2. Almacenar a temperatura ambiente. Para usar, alícute 50 ml en un tubo de 50 ml y añade Ca ²⁺ 1,8 mM y glucosa 10 mM.
5. Preparar 1 L de solución de enjuague de KCl (KCl 125 mM, NaCl 25 mM, HEPES 10 mM, MgCl2 0,2 ​​mM) en agua desionizada y ajustar el pH a 7,25.
6. Disolver 5 mg de ionomicina en 1 ml de dimetilsulfóxido (DMSO). Alícuota de 30 μL en microtubos y almacenar a -20ºC.6; C.
7. Preparar el stock de ácido ciclopiazónico (CPA) disolviendo CPA en DMSO. Asegúrese de que el porcentaje final de DMSO es ≤ 1% para el CPA añadido a las células para prevenir la apoptosis. Preparar 4-cloro-m-cresol 20 mM (4 cmc) disolviéndose en H ₂ O filtrado y dejar que se disuelva durante la noche agitando a 37 ° C. Preparar el stock de ATP disolviéndose en H ₂ O filtrado a 100 mM.
8. Para determinar el K _d in situ , preparar 15 ml de cada uno de EGTA 1 mM, 0,2 mM, 0,6 mM, 2 mM, 5 mM, 10 mM, 20 mM, 50 mM y 100 mM de Ca $ ₂ $ ⁺ en tampón KCl usando un 100 MM de EGTA y una reserva de CaCl2 1 M disuelta en agua desionizada.

3. Cultivo celular

1. Cultivo de células C2C12 de mioblasto y HEK293 de acuerdo con los protocolos ATCC para cada una utilizando platos de cultivo celular de 10 cm en una cubierta UV estéril.
   NOTA: No se debe permitir que las células C2C12 crezcan más de ~ 70% de confluencia ya que los mioblastos comenzarán a diferenciarseTe en myotubes. Las células HEK293 y C2C12 crecen fácilmente y no se debe permitir que crezcan más allá del 100% de confluencia para mantener la integridad celular. Además, las células no deben pasarse más de 10 veces antes de usarlas para un experimento para preservar la salud celular.

4. Transfección de células HEK293

1. Sequen las células HEK293 en portaobjetos de vidrio esterilizados de 22 mm x 40 mm en placas de 6 cm para que sean confluentes al 70% el día de la transfección.
2. Al día siguiente, siga el protocolo del fabricante para el reactivo de transfección para transfectar las células utilizando 2 μg de ADNc de CatchER ⁺ y una proporción de reactivo de transfección de 1: 3 (peso / volumen) en el medio de suero reducido ( por ejemplo, Opti-MEM).
3. Vacíe el medio DMEM del plato y agregue 3 mL de medio de suero reducido. Añadir ADN: mezcla de reactivo de transfección a la cápsula e incubar durante 4-6 h a 37ºC.
4. Después de la incubación, lavar las células con 5-6 ml de HBSS. Deseche el HBSS fRom el plato y reemplazar con 3 mL de DMEM fresco e incubar a 37 ° C durante 48 h para permitir la expresión de la GECI.
5. Transfección de células mioblásticas C2C12
   1. Para las células de mioblasto C2C12, trypsinize células por la adición de suficiente tripsina para cubrir el fondo del plato (1-2 mL). Coloque el plato en una incubadora a 37 ° C durante 2-6 minutos para permitir que la tripsina para aflojar las células de la parte inferior de la fuente.
   2. Una vez finalizada la incubación, retirar la tripsina y aspirar las células en 8 ml de DMEM. Pipetear bien las células con el DMEM para dispersar uniformemente y volver a suspender las células y sembrarlas en cubreobjetos estériles en placas de cultivo celular de 6 cm que contengan 3 mL de DMEM de manera que la confluencia final sea del 60%.
   3. Transfectar las células el mismo día que se describe en el paso 4.2-4.3. Incubar durante 24 h a 37 ° C.
   4. Repita el paso 4.4.

5. Preparación del microscopio de diapositivas y fluorescencia

1. Encender mIcroscopio y fuente de luz, abra el programa Simple PCI. Deje que el microscopio se caliente durante 15-20 minutos o hasta que la cámara del dispositivo de carga acoplada (CCD) se enfríe a -65 ° C. Prepare la cámara y deslice con las células mientras espera.
2. Cubra la parte inferior de la cámara de imagen de baño de diamante abierto de perfil bajo con una fina capa de sellador, usando un hisopo de algodón.
3. Tome la diapositiva que contiene las células transfectadas de la incubadora y enjuague suavemente tres veces con 1 mL de tampón de Ringer con glucosa 10 mM y Ca2 ⁺ 1,8 mM precalentado a 37 ° C.
4. Deje 1 mL de tampón de Ringer en el plato, para evitar que las células se sequen, y use una pinza para sacar el portaobjetos del plato. Permita que el exceso de solución se absorba en un tejido de laboratorio tocando el borde de la diapositiva a un tejido de laboratorio. A continuación, coloque en el lado de la cámara que contiene la grasa con las células hacia arriba hacia la grasa y asegurar la cámara en el montaje de la etapa con un destornillador.
5. Añadir 1Ml de tampón de Ringer a la cámara para evitar que las células se sequen mientras se monta la cámara en el escenario y se completa el resto de la configuración del microscopio. Una vez que la manguera de aspiración de vacío está unida a la cámara, el volumen final de la cámara se mantiene es ~ 450 μL.
6. Cambie el objetivo del microscopio al objetivo de inmersión de aceite 40X.
7. Utilice papel de lentes y solución de limpieza de lentes para limpiar y secar el objetivo. No frotar el objetivo. Aplique suavemente hasta que la superficie esté limpia.
8. Añadir una gota del aceite de inmersión al objetivo.
9. Coloque la montura en la platina del microscopio y agregue la punta de vacío a la cámara. Una vez que la manguera de aspiración de vacío está unida a la cámara y encendida, el volumen final de la cámara es de ~ 450 μL. Este volumen final está nivelado con los lados de la cámara. Es imperativo que la solución de cámara esté nivelada, durante el experimento, para evitar que la solución se derrame hacia abajo en el objetivo debido al sobrellenado.
10. Eleve el objetivo y utilice el ajuste grueso hasta que el aceite del objetivo toque la parte inferior de la diapositiva.
11. Usando el modo de campo brillante, ajuste la ganancia a 175 y el tiempo de exposición a 0,03 s para enfocar las celdas.
12. Una vez que las células están enfocadas, cambie al modo de fluorescencia usando excitación de 488 nm. Cambie el tiempo de exposición a 0.07 s. Localizar un campo de visión que tiene suficientes células que son saludables con fluorescencia adecuada a la imagen.
13. Una vez que se ha elegido un campo de visión, tome imágenes en fluorescencia y modo de campo brillante.
14. Encierre en un círculo una región de interés (ROI) en las celdas o rodee la celda entera para registrar la intensidad del área elegida.

6. Transitorios de Ca ²⁺ inducidos por imágenes y Calibración In Situ K _d

1. Inicie la medición de intensidad con la velocidad de fotogramas ajustada en una cada 5 s.
2. Deje que la intensidad de la línea base se estabilice durante 20-30 fotogramas (100-150 s). Si es necesario, disminuya el frAmes / s durante este paso para evitar el fotoblanqueo.
3. Calcular la cantidad de 4 cmc necesaria de una reserva de 20 mM basada en el volumen final de la cámara de ~ 450 μL para obtener una concentración final de 200 μM. Realizar las diluciones del material según sea necesario.
4. Tomar cuidadosamente 60 μl de tampón Ringer de la cámara y colocarlo en un tubo de microcentrífuga. Diluir la cantidad calculada de 4 cmc con esta solución y agregar de nuevo a la cámara para evocar la respuesta deseada de las células que se están formando imágenes.
5. Añadir la cantidad calculada de 4 cmc al tubo de microcentrífuga y mezclar por pipeteo.
6. Añada suavemente la solución en el campo de visión mientras agrega simultáneamente el marcador de evento en la medición de intensidad.
7. Dejar tiempo para que el fármaco se una al receptor y disminuir la señal subsiguiente, a continuación, lavar con 3-6 ml de tampón de Ringer con Ca ²⁺ 1,8 mM y glucosa 10 mM mientras se añade simultáneamente el marcador de evento. Puesto que el volumen de la cámara es 450 &# 181; L y está conectado a un vacío, la adición de 3-6 ml de tampón asegura que la primera solución que contiene el fármaco se haya eliminado por lavado y se haya reemplazado con la solución recién añadida.
8. Repetir 6.1-6.7 para ATP 100 μM y CPA 15 μM, usando una nueva diapositiva de células transfectadas para cada ensayo.
9. Una vez finalizada la medición, finalizar la recolección de datos en la ventana de medición de intensidad en el programa Simple PCI.
10. Tome imágenes fluorescentes y de campo claro de las células.
11. Abra el archivo de datos para el experimento. Aquí, vuelva a circular las células o regiones de interés para volver a calcular los valores de intensidad, si es necesario.
12. Para determinar el K _d in situ en las células de mioblastos C2C12, siga el protocolo descrito en la sección 4.2 y la sección 5 y coloque 1 mL de tampón Ca ²⁺ Ringer 0 mM en la cámara.
    1. Permeabilizar las células con 0,002-0,005% de saponina en tampón intracelular durante 15-30 s para vaciar las células de cualquierCatchER ⁺ que puede estar en el citosol. Lavar las células con 3-6 mL de 1 mL de EGTA en tampón KCl con 10 μM de ionomicina. Deje que la intensidad disminuya hasta alcanzar una meseta.
    2. Enjuague con 3-6 ml de tampón KCl con ionomicina 10 μM y permita que la intensidad se estabilice, luego añada cada solución de Ca ^{2 +} detallada en el paso 2.7. Permita que la intensidad alcance una meseta entre cada adición.
13. Para calibrar el sensor para la cuantificación basal [Ca2 ⁺ ], siga el paso 6.12. Utilice el EGTA y el tampón Ca2 ⁺ 100 mM de la etapa 2.7 para obtener la intensidad de fluorescencia mínima y máxima.

7. Procesamiento de datos

1. Descargue el archivo de la hoja de cálculo de los datos de medición de intensidad.
2. Normalizar los datos para cada celda a la intensidad de línea de base (F / F ₀ ). Trace los datos normalizados en función del tiempo en cualquier programa gráfico.
3. Para calcular el% de cambio, restar el pico normalizado valUe de 1 y multiplicar por 100. Calcular el promedio y la desviación estándar si se visualizaron múltiples células.
4. Para calcular la relación señal / ruido, SNR, abra el archivo de imagen guardado desde el experimento en un software de procesamiento de imágenes, como ImageJ, y luego mida la señal, las células transfectadas y el ruido, fondo. Calcule la SNR usando la ecuación SNR = señal / ruido.
5. Para calcular el K _d in situ a partir de los datos de imagen de fluorescencia recogidos, se miden los datos de intensidad, que comprenden las mesetas, después de la adición de cada concentración de Ca2 ⁺ y EGTA (Ca2 ⁺ 0 mM). Calcular la saturación fraccional (intensidad relativa) usando θ = (F - F _min ) / (Fmax - F _min ), donde θ es la intensidad relativa, F es la fluorescencia en cualquier punto, F _min es la intensidad de fluorescencia mínima y F _max es la máxima intensidad de fluorescencia, para ver el cambio en la intensidad de tSonda con la adición de Ca ^{2 +} en comparación con la intensidad mínima. Trazar los datos de intensidad relativa contra el [Ca ^{2 +} ] en cualquier gráfico y programa de ajuste de curvas. Utilice la ecuación de unión de 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) traducida para cualquier programa gráfico y de ajuste de curva para calcular la K _d . M _T es la concentración total de metal.
6. Para cuantificar el calcio basal de la calibración delineada en 6.13, promediar los datos de intensidad, que comprenden las mesetas, después de la adición de EGTA 1 mM (F _min ) y 100 mM Ca ²⁺ (F _max ). Utilice la ecuación de calibración [Ca ^{2 +} ] = K _d ([F - F _min ) / (F _max - F)] para calcular el calcio basal.

Resultados

Esta sección ilustrará los resultados que se lograron usando los métodos previamente descritos usando el GECI CatchER ⁺ optimizado para monitorizar los cambios en ER / SR Ca ^{2 +} a través de diferentes vías mediadas por receptores.

La Figura 1 ilustra el vaciado de ER a través del RyR estimulado con 200 μM de 4 cmc. 4-cmc es un agonista del RyR. La adición del fármaco induce u...

Discusión

Vivir de una sola célula de imágenes de sondas fluorescentes, como CatchER ⁺ , es una técnica eficaz para analizar intrincados ER / SR Ca ^{2 +} procesos de señalización en cada célula en respuesta a los receptores agonistas o antagonistas. Esta técnica también es útil para la obtención de imágenes utilizando múltiples longitudes de onda simultáneamente, como las necesarias para Fura-2 o para capturar imágenes de CatchER ⁺ y Rhod-2 conjuntamente para monitorear tanto los cambios de ER como ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
4-Cloro-3-metilfenol (4-CmC)	Sigma-Aldrich	C55402
515DCXR espejo dicroico	Chroma Technology Corp.
Adenosina 5′-trifosfato sódico sódico hidrato	Sigma-Aldrich	A26209
Cloruro de calcio dihidratado	EMD Millipore	102382
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos Corning (100 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430167
Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos Corning (60 mm)	Sigma-Aldrich	CLS430166
Ácido ciclopiazónico (CPA)	EMD Millipore	239805
D(+)-Glucosa	ACROS Organics	41095-0010
Dow Corning 111 Lubricante para válvulas & Sellador	Warner Instruments	64-0275
Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)	Sigma-Aldrich	D7777
Etilenebis (oxietilennitrilo) ácido tetraacético (EGTA)	ACROS Organics	409911000
Suero fetal bovino (FBS)	ThermoFisher	26140087
Fisherbrand Cubreobjetos 22x40 mm	Fisher Scientific	12-544B
Hanks' Sales equilibradas (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES, Ácido Libre, Grado de Biología Molecular	EMD Millipore	391340
Aceite de inmersión sin autofluorescencia	Leica	11513859
Ionomicina, Ácido Libre	Fisher Scientific	50-230-5804
Microscopio invertido Leica DM6100B con cámara EM-CCD refrigerada	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección	ThermoFisher	L3000015
de bajo perfil Cámara de baño de diamante abierto	Instruments	RC-26GLP
Cloruro de magnesio Hexahidrato Fisher	Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
Cloruro de potasio	EMD Millipore	PX1405
Fosfato de potasio, Dibasic	EMD Millipore	PX1570
Fosfato de potasio, monobásico	EMD Millipore	PX1565
Saponina	Sigma-Aldrich	47036
SimplePCI Software de análisis de imágenes	Hamamatsu	N/A
Bicarbonato de sodio	Fisher Scientific	S233-3
Cloruro de sodio	Fisher Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 µ m filtro	EMD Millipore	SVGVB1010
Till Lámpara de xenón policromada V Till	Photonics	N/A
Tripsina (2,5%), rojo sin fenol (10x)	ThermoFisher	15090046