Presentamos protocolos para la aplicación de nuestro indicador de calcio codificado genéticamente (GECI) CatchER + para el monitoreo de transitorios rápidos de calcio en el retículo endoplasmático / sarcoplasmático (ER / SR) de HEK293 y células C2C12 de músculo esquelético usando microscopía de fluorescencia en tiempo real. También se discute un protocolo para la medición y calibración in situ K d .
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Artículo de método
Seguimiento de la liberación de calcio ER / SR con el Ca
En este artículo
Resumen
Resumen
Los transitorios intracelulares de calcio (Ca2 + ) evocados por estímulos extracelulares inician una multitud de procesos biológicos en organismos vivos. En el centro de la liberación de calcio intracelular se encuentran los principales organelos de almacenamiento de calcio intracelular, el retículo endoplasmático (RE) y el retículo sarcoplasmático (SR) más especializado en las células musculares. La liberación dinámica de estos orgánulos está mediada por el receptor de ryanodina (RyR) y el receptor de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), con relleno que ocurre a través de la bomba sarco / retina de calcio cálcica (SERCA). Se creó un sensor de calcio codificado genéticamente (GECI) llamado CatchER para monitorizar la liberación rápida de calcio de la ER / SR. En este caso, los protocolos detallados para la transfección y expresión de la mejorada, ER / SR-GECI objetivo CatchER + en células HEK293 y C2C12 y su aplicación en la monitorización de IP3 R, RyR, y SERCA mediada por la bomba de calcio transitoriaS en células HEK293 usando microscopía de fluorescencia. El agonista o inhibidor receptor de elección se dispersa en la solución de cámara y los cambios de intensidad se registran en tiempo real. Con este método, se observa una disminución del calcio ER con activación de RyR con 4-cloro-m-cresol (4 cmc), la activación indirecta de IP3R con adenosina trifosfato (ATP) e inhibición de la bomba SERCA con ciclopiazónicos Ácido (CPA). También discutimos protocolos para determinar el K d in situ y la cuantificación basal [Ca 2 + ] en C2C12 células. En resumen, estos protocolos, utilizados junto con CatchER + , pueden provocar la liberación de calcio mediada por receptores de la ER con aplicación futura en el estudio ER / SR relacionadas con calcio patologías.
Introducción
Los atributos espacio-temporales de los transitorios intracelulares de calcio (Ca 2+ ) activan diversas funciones biológicas 1 . Estos eventos de señalización de Ca2 + son desencadenados extracelularmente a través de diferentes estímulos y controlados intracelularmente por el principal organelo de almacenamiento de Ca2 + y por numerosas bombas de Ca2 + , canales y proteínas de unión a Ca2 + . Ca 2 + transitorios pueden ser significativamente alterado como resultado de los defectos con la modulación de la señal, dando lugar a diferentes enfermedades [ 2] .....
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Protocolo
1. Preparación de la diapositiva
- Coloque láminas de microscopio de vidrio de 22 mm x 40 mm en placas de cultivo celular de 6 cm, 1 diapositiva por plato.
- Exponga cada lado de cada diapositiva, así como el plato de 6 cm a la luz ultravioleta (UV) durante 15-20 minutos para esterilizar en una campana estéril.
- Cubra los platos con los portaobjetos dentro con parafilm y guarde a 4 ° C hasta que esté listo para usar.
2. Preparación de medios, tampones, soluciones y reactivos
- Preparar 1 L de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) en agua desionizada y añadir HEPES 10 mM, NaHCO3 5 mM y EGTA 1 m....
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Resultados
Esta sección ilustrará los resultados que se lograron usando los métodos previamente descritos usando el GECI CatchER + optimizado para monitorizar los cambios en ER / SR Ca 2 + a través de diferentes vías mediadas por receptores.
La Figura 1 ilustra el vaciado de ER a través del RyR estimulado con 200 μM de 4 cmc. 4-cmc es un agonista del RyR. La adición del fármaco induce u.......
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Discusión
Vivir de una sola célula de imágenes de sondas fluorescentes, como CatchER + , es una técnica eficaz para analizar intrincados ER / SR Ca 2 + procesos de señalización en cada célula en respuesta a los receptores agonistas o antagonistas. Esta técnica también es útil para la obtención de imágenes utilizando múltiples longitudes de onda simultáneamente, como las necesarias para Fura-2 o para capturar imágenes de CatchER + y Rhod-2 conjuntamente para monitorear tanto los cambios de ER como .......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue financiado por NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant, y una subvención suplementaria NIH FR, BB beca a CM, CDT beca a RG.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 4-Cloro-3-metilfenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 | |
| 515DCXR espejo dicroico | Chroma Technology Corp. | ||
| Adenosina 5′-trifosfato sódico sódico hidrato | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Cloruro de calcio dihidratado | EMD Millipore | 102382 | |
| Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos Corning (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Placas de cultivo tratadas con cultivo de tejidos Corning (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 | |
| Ácido ciclopiazónico (CPA) | EMD Millipore | 239805 | |
| D(+)-Glucosa | ACROS Organics | 41095-0010 | |
| Dow Corning 111 Lubricante para válvulas & Sellador | Warner Instruments | 64-0275 | |
| Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 | |
| Etilenebis (oxietilennitrilo) ácido tetraacético (EGTA) | ACROS Organics | 409911000 | |
| Suero fetal bovino (FBS) | ThermoFisher | 26140087 | |
| Fisherbrand Cubreobjetos 22x40 mm | Fisher Scientific | 12-544B | |
| Hanks' Sales equilibradas (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 | |
| HEPES, Ácido Libre, Grado de Biología Molecular | EMD Millipore | 391340 | |
| Aceite de inmersión sin autofluorescencia | Leica | 11513859 | |
| Ionomicina, Ácido Libre | Fisher Scientific | 50-230-5804 | |
| Microscopio invertido Leica DM6100B con cámara EM-CCD refrigerada | Hamamatsu | C9100-13 | |
| Lipofectamine 2000 Reactivo de transfección | ThermoFisher | 11668019 | |
| Lipofectamine 3000 Reactivo de transfección | ThermoFisher | L3000015 | |
| de bajo perfil Cámara de baño de diamante abierto | Instruments | RC-26GLP | |
| Cloruro de magnesio Hexahidrato Fisher | Scientific | M33-500 | |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 | |
| Cloruro de potasio | EMD Millipore | PX1405 | |
| Fosfato de potasio, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 | |
| Fosfato de potasio, monobásico | EMD Millipore | PX1565 | |
| Saponina | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| SimplePCI Software de análisis de imágenes | Hamamatsu | N/A | |
| Bicarbonato de sodio | Fisher Scientific | S233-3 | |
| Cloruro de sodio | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sterivex-GV 0.22 µ m filtro | EMD Millipore | SVGVB1010 | |
| Till Lámpara de xenón policromada V Till | Photonics | N/A | |
| Tripsina (2,5%), rojo sin fenol (10x) | ThermoFisher | 15090046 |
Referencias
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish....
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Reimpresiones y permisos
