Artículo de método

Un modelo de nefrectomía de ratón 5/6th que induce miocardiopatía urémica Experimental

DOI:

10.3791/55825

⸱

7 de noviembre de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Marshall Institute for Interdisciplinary Research (MIIR), Marshall University, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University Joan C. Edwards School of Medicine

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este manuscrito ofrece un procedimiento quirúrgico de dos pasos detallados para realizar nefrectomía parcial deth de ratón 5/6 (PNx) con la ligadura del polo. Cuatro semanas después de la cirugía, en comparación con ratones sham-funcionado, los ratones PNx desarrollaron fibrosis cardiaca, hipertrofia cardiaca, deterioro de la función renal, anemia y disminución de la función sistólica y diastólica de corazón.

Resumen

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Enfermedad renal crónica (ERC) es un gran factor de riesgo para eventos cardiovasculares y mortalidad y se desarrolla progresivamente al fenotipo clínico llamado "Cardiomiopatía urémica". Aquí describimos un modelo experimental de ratón CKD, denominado 5/6th nefrectomía parcial (PNx) con la ligadura del polo, que desarrolló cardiomiopatía urémica en la cirugía después de cuatro semanas. Este modelo PNx realizó una cirugía de dos etapas. En cirugía del paso uno, se unen ambos polos del riñón izquierdo. En la cirugía de paso y dos, que se realizó 7 días después de la cirugía de un paso, el riñón derecho fue quitado. Para la cirugía simulada, se realizaron los mismos procedimientos de la cirugía pero sin poste ligadura del riñón izquierdo o extirpación del riñón derecho. Los procedimientos quirúrgicos son más fácil y menos desperdiciadora de tiempo, en comparación con otros métodos. Sin embargo, el remanente de la masa renal funcional no se controla tan fácilmente como la ligadura de la arteria renal. Cuatro semanas después de la cirugía, en comparación con los ratones sham-funcionado, los ratones PNx desarrollaron fibrosis cardiaca, hipertrofia cardiaca, deterioro de la función renal, anemia y disminución de la función sistólica y diastólica de corazón.

Introducción

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CKD, también conocida como insuficiencia renal crónica, es una pérdida progresiva de la función renal con el tiempo que eventualmente se convierte en insuficiencia renal permanente. CKD, de Estados tempranos de enfermedad renal de la etapa de insuficiencia renal terminal (ESRD), es un gran factor de riesgo para eventos cardiovasculares y mortalidad y se desarrolla progresivamente al fenotipo clínico llamado "Cardiomiopatía urémica"1, 2,3. La miocardiopatía urémica en pacientes con ERC o ESRD se asocia con anormalidades cardiovasculares, principalmente causadas por sobrecarga de presión ventricular izquierdo de (LV) o volumen, conduce a la hipertrofia del LV (HVI), dilatación del LV y disfunción sistólica del LV4 ,5,6. La fibrosis cardiaca es otro proceso patológico común de cardiomiopatía urémica que reduce la compliance cardiaca resultando en disfunción diastólica ventricular. Fibrosis cardiaca severa puede conducir a la muerte súbita incluso en aquellos sin síntomas cardiacos7.

El 5/6th PNx es un modelo de animal CKD comúnmente utilizado para los estudios en animales con insuficiencia renal, miocardiopatía urémica y la hipertensión. PNx se logra la ablación de parénquima renal 5/6. El modelo de la rata fue desarrollado inicialmente con los dos más comunes protocolos emplean siendo la resección quirúrgica o el infarto. El modelo PNx de rata es un modelo muy útil para el estudio de la miocardiopatía urémica con sustanciales elevaciones en la presión arterial, hipertrofia cardiaca y deterioro de la función diastólico. Más tarde, se desarrollaron modelos de PNx ratón, operados con las técnicas similares como el modelo de la rata, debido a la amplia disponibilidad y la facilidad de hacer manipulaciones genéticas en el sistema de ratón.

Está bien documentado que el estrés oxidante sistémica es una constante de ambos de8,y miocardiopatía urémica9. Además, el estrés oxidante contribuye al síndrome urémico10y juega un papel fundamental en la patogenia de las anormalidades cardíacas en cardiomiopatía urémica11,12,13. A este punto, hemos demostrado que el roedor 5/6th modelo PNx causas características fisiológicas, morfológicas y bioquímicas de la miocardiopatía urémica14,15,16, 17. en el ratón PNx modelo aquí descrito, ratones PNx funciona desarrollaron estrés oxidativo significativo, al menos parcialmente mediado por la Na/K-ATPasa, señalando la función, que es crítica en la miocardiopatía urémica experimental PNx-mediada. Atenuación de la señalización de Na/K-ATPasa no sólo reduce la amplificación oxidativa, sino que también mejora los cambios fenotípicas en cardiomiopatía urémica experimental mediada PNx18.

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Protocolo

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todos los cuidado de los animales y los experimentos fueron aprobados por el cuidado institucional de la Universidad Marshall los animales y el Comité uso (IACUC) según la guía de institutos nacionales de salud (NIH) para el cuidado y uso de animales de laboratorio. Ratones C57BL/6 machos (10-12 semanas) fueron alojados en un centro animal libre de patógeno en designadas habitaciones equipadas con jaulas que suministran aire purificado en un ciclo de 12 h luz/oscuridad. Alimentos y agua fueron suministrados ad libitum.

1. preparación de cirugía

Nota: los instrumentos quirúrgicos y materiales se obtienen de diferentes fuentes que no son específicas a las operaciones de cirugía. Instrumentos y materiales de otras fuentes pueden utilizarse también para el mismo propósito. Ver la Tabla de materiales para obtener una lista de instrumentos quirúrgicos.

Tabla
  1. preparación para la cirugía de
    1. lugar esta al alcance de la operación: calentamiento pad, lámpara halógena, tanque de oxígeno y tanque de isoflurano, vaporizador de isoflurano, podadoras de pelo, crema del retiro del pelo, escalas, esterilizados funcionamiento conjunto, lino quirúrgico esterilizado, torundas de algodón, alcohol al 70%, solución de polyhydroxydine (que contiene yodo al 1%), solución de NaCl al 0.9%, 1 mL jeringas y agujas (30 G), 3-0 y 4-0 suturas seda, buprenorfina y penicilina, ungüento antibiótico, y ungüento oftálmico lubricante.
    2. Limpiar una jaula y coloque una almohadilla de calor debajo de la ropa de cama para ratones de vivienda después de la cirugía.

2. Paso una cirugía: ligadura de poste de la izquierda riñón

Nota: mantener las condiciones estériles durante la cirugía. Cubrir los instrumentos quirúrgicos autoclave con un paño estéril. Tener más de un conjunto de instrumentos quirúrgicos en la mano para que más de una cirugía evitar la contaminación cruzada durante la cirugía. Si los instrumentos deben ser utilizados de nuevo, en el caso de múltiples cirugías, desinfectar los instrumentos con solución de betadine y etanol al 70% y luego esterilizar en un esterilizador de bolas de vidrio germinator para desinfectar la zona de corte con etanol al 70% de 5 minutos. Una bata, mascarilla (a cubierta de la nariz y la boca), cap (para cubrir la cabeza) y un par de guantes estériles. Cambiar los guantes después de cada cirugía.

  1. Lavar y desinfectar las manos y usar guantes quirúrgicos estériles. Use un cabezal y una máscara de.
  2. Desinfectar la mesa con alcohol al 70%. Aplicar ungüento oftálmico lubricante en ambos ojos del ratón para evitar la sequedad del ojo bajo anestesia.
  3. Colocar el ratón en una cámara de inducción de un sistema de vaporizador de isoflurano e inducir la anestesia con una mezcla de 2.5% isoflurano con oxígeno al 100% (0.8 - 1.2 L/min) durante 1-2 minutos
    Nota: La eficacia de la anestesia fue determinada por la ausencia del reflejo de dolor provocada por pellizcar la cola, así como por la ausencia de reflejo palpebral por tocar el párpado de.
  4. Inyectar penicilina (40.000 unidad/kg de peso corporal, IM) y la buprenorfina (0,02 mg/kg de peso, SC) para prevenir la infección y el dolor durante la cirugía.
  5. Coloque el ratón sobre una almohadilla de calentamiento (establecido inicialmente a 42 ° C) con un termómetro rectal para mantener y controlar la temperatura del cuerpo alrededor de 37 ° C durante el procedimiento. Coloque la punta del ratón en el cono de nariz y ventilar con una mezcla de 0.8-1.2% isoflurano con oxígeno al 100% (0.8-1.2 L/min) durante la cirugía.
  6. Colocar el ratón en el lado derecho. Afeitar el pelo del área quirúrgica con una recortadora de pelo y luego quitar con la crema depilatoria. Desinfectar el sitio con solución de polyhydroxydine (que contiene yodo al 1%) seguido de etanol al 70%. Alinee el lino quirúrgico esterilizado en el área quirúrgico.
  7. Hacer una incisión lumbar ~1.0 cm y separar el músculo y la fascia para exponer el riñón izquierdo usando el bisturí y pinzas ( Figura 1a).
  8. Sacar el riñón izquierdo muy suavemente tirando de la grasa perirrenal con pinzas embotadas pequeñas. En el proceso, para no disturbar la glándula suprarrenal, mueva la glándula suprarrenal hacia arriba del riñón con fórceps.
  9. Usando fórceps romos, tease suavemente el tejido conectivo y las glándulas suprarrenales del extremo superior del riñón hacia el píloro central del riñón donde los vasos sanguíneos para entrar y salir. Identificar y aislar el uréter.
    Nota: El uréter se encuentra alrededor de la mitad inferior del riñón incrustado en el tejido conectivo y claramente visible bajo luz.
  10. Suavemente el tejido conectivo del gancho agarrador y separar el tejido del riñón para asegurarse de que el uréter está ligado no.
  11. Antes de trompas polar, utilice una regla estéril para identificar la parte 1/3 superior e inferior del riñón. El riñón de ratón es generalmente alrededor de 1,25 a 1,5 cm largo
  12. Ligan con una seda 3-0 cadena de sutura y con propia fuerza, aproximadamente 0.4 cm de la parte superior hacia la mitad del píloro y del mismo modo, 0.4 cm de la parte inferior hacia el píloro ( Figura 1a, punteada líneas).
  13. Después de la ligadura de ambos polos ( Figura 1b), permite un tiempo de 2 min de observación para asegurarse de que no hay ningún sangrado.
    Nota: En el proceso, es muy importante evitar la ligadura de la glándula suprarrenal, arteria renal y el uréter. Si el uréter izquierdo es ligado, el ratón morirá después del retiro del riñón derecho en el paso dos de la cirugía. La fuerza de ligadura puede restringir el flujo sanguíneo a los polacos sin causar sangrado intra renal. Dentro de 1-2 min después de la ligadura, los polos están descoloridos debido al límite del flujo de sangre a los postes.
  14. Rechazar el riñón izquierdo al lugar original. Cerrar el músculo y la piel con hilos de sutura de seda 4-0 y 3-0, respectivamente. Aplique ungüento antibiótico al área quirúrgico para mejorar la recuperación y desinfección.
  15. Después de la ligadura, la casa del ratón por separado en una jaula con una lámpara de calor sobre la jaula para que el área de ropa de cama está cerca de 37 ° C (controlar con un termómetro), antes de colocar los animales en jaulas individuales.
    Nota: Controlar el ratón hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal.
  16. Permite fácil acceso a agua y alimento durante la recuperación. Administrar penicilina y buprenorfina cada 12 h durante los primeros 3 días después de la cirugía prevenir la infección y dolor.
    Nota: El ratón debe recuperarse del trauma de la cirugía en 2-3 días y debe volver a comer normal, beber y moverse. En este momento, la casa el ratón individualmente para su recuperación completa. Deberá vigilarse lo siguiente: beber, comer, caminar patrones, marcha torpe, espalda jorobada, descarga ocular o nasal y comportamiento agresivo. Eutanasia el ratón si muestra signos de convulsiones, coma, infección intratable, dificultad para caminar, pérdida de la marcha, no se puede comer y beber y pérdida de más del 15% antes de la operación peso.

3. Paso dos cirugía: extirpación del riñón derecho

  1. siete días más tarde, exponga el riñón derecho como se describe para el riñón izquierdo en pasos 2.1 a 2.10, excepto Coloque el ratón a su izquierda.
  2. Poner el riñón derecho en la ropa y eliminar grasa y tejido conectivo circundantes con fórceps romos.
  3. Identificar la arteria renal y la vena y luego colocar dos ligaduras (seda 3-0) cada uno con un solo nudo suelto alrededor de los vasos. Tease suavemente el tejido conjuntivo y suprarrenales glándula del extremo superior del riñón hacia el píloro central del riñón usando fórceps romos. Desplazar el uréter desde el extremo inferior y atar todos los vasos juntos (seda 3-0) sin causar hemorragia.
  4. Mover los dos nudos de ligadura suelta a lo largo de los vasos. Uno hacia el lado de la aorta abdominal y el otro hacia el lado del riñón.
  5. Ate el nudo ligadura (hacia el lado de la aorta abdominal) primero con dobles nudos, un nudo sólido va a cambiar el color del riñón derecho. Ate el nudo ligadura (hacia el lado del riñón) con nudos dobles. Deje suficiente espacio entre estos dos nudos dobles para cortar los vasos entre los dos nudos sin cortar los nudos de la ligadura.
  6. Cortar los vasos renales entre los dos nudos y quitar el riñón derecho. Compruebe la posible sangrado de los vasos renales.
  7. Secar el riñón derecho con una gasa estéril y pesan lo
  8. Cerrar la incisión del músculo con la secuencia de sutura de seda 4-0 y cerrar la incisión de piel con cadena de sutura de seda 3-0.
  9. Casa el ratón por separado en una jaula limpia solitaria con una lámpara de calor sobre la jaula (paso 2.15) con fácil acceso a agua y alimento durante al menos 24 h de recuperación. Administrar penicilina y buprenorfina cada 12 h durante 3 días prevenir la infección y dolor.
    Nota: El ratón debe recuperarse del trauma de la cirugía en 2-3 días y debe volver a comer normal, beber y moverse.
  10. Después de la cirugía, seguimiento de los ratones dos veces al día durante tres días y luego una vez al día durante la duración del experimento. Siga los procedimientos de supervisión y tratamiento postquirúrgicos se describe en el paso 2.16.

4. Farsa de cirugía

  1. para la cirugía del impostor, realizar los mismos procedimientos de la cirugía, incluida la exposición del riñón, disección de tejido y el cierre de la herida, pero sin la ligadura del polo del riñón izquierdo o extirpación de riñón derecho.

5. evaluación de la miocardiopatía urémica Experimental

  1. un día antes del sacrificio, realizar una ecocardiografía transtorácica y capturar imágenes 18.
    Nota: Aquí, la ecocardiografía transtorácica se realizó con un ratón manejo de mesa y el termómetro rectal. Las imágenes ecocardiográficas fueron capturadas utilizando un MHz de 18-38 transductor de frecuencia de funcionamiento conectado a un sistema de proyección de imagen. Espesor relativo (RWT), índice de rendimiento miocárdico (MPI) e índice de la masa de ventrículo izquierdo (IMVI) se calcularon como descrito 18.
  2. En el momento del sacrificio, medir el peso del cuerpo. Miden el hematocrito (HCT) con una centrifugadora HCT según fabricante ' instrucciones. Preparar las muestras de plasma mediante la centrifugación de las muestras de sangre 10 min a 1.500 x g a 4 ° C en una centrífuga refrigerada de mesa de tubos recubiertos de heparina. Medir cistatina C y creatinina BUN usando kits siguiendo el fabricante ' instrucciones. Realizar las mediciones por duplicado.
  3. Al final del experimento, anestesiar los ratones con ketamina (90 mg/kg, IP) y xylaxine (10 mg/kg, IP) y el sacrificio por toracotomía. Medir el peso del corazón después de haber quitado del pecho. Preparar cardiaco (LV) y homogenados de riñón, así como determinación de colágeno tipo 1 (COL-1), la fosforilación de c-Src y proteína Carbonilación, como se describe antes 18 , 19.

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Resultados

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Los datos indican que este modificado 5/6th modelo PNx por la ligadura del polo es un modelo sencillo y eficaz para investigar la miocardiopatía urémica. En la cirugía después de cuatro semanas, este PNx modelo presenta había deteriorada la función renal, anemia, hipertrofia cardíaca, fibrosis cardíaca y disminución de la función sistólica y diastólica de corazón. A continuación se resumen los resultados.

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Discusión

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La rata 5/6th modelo PNx ha sido ampliamente utilizado para el estudio de CKD. Debido al mucho más pequeño riñón tamaño en ratón, la ligadura de la arteria clásica y resección de Polo son muy desafiantes en modelos de ratón con posibles altas tasas de mortalidad y pérdida de sangre, sangrado inesperado.

Adoptamos un modelo de ratón PNx con la ligadura del polo a superar la pérdida de sangre hemorragia. Este modelo PNx toma menos tiempo con la tasa de supervivencia mejorada y alta re...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por NIH R15 1R15DK106666-01A1 (a J. Liu) y NIH to1 HL071556 (a J.I. Shapiro).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tijeras de iris, 11,5 cm, rectasWorld Precision Instruments501758
Pinzas suizas WPI #5 11 cm, 0,1x0,06 mm PuntasWorld Precision Instruments504506
Joyeros #5 Pinzas, 11cm, rectas, titanioWorld Precision Instruments555227F
Pinzas de Iris, 10cm, rectas, dentadasWorld Precision Instruments15914
Pinzas #3, 11cm, puntas de 0,2x0,4mmWorld Precision Instruments501976
tijeras curvas Medesy Iris de 4,5", acero inoxidableNet233512www.Net32.com
Dr. Slick Tijeras Iris; 3.5"Avid Max220-1-965-IrisScsrs-P www. Avid Max.com
Miltex Tijeras de iris 4 1/8" curvo4mdmedicalV95-306www.4mdmedical.com
5" Aplauso hemostático, mandíbula curvaPJTool4355www.pjtool.com
sklar Tijeras de iris Knapp, rectas y afiladas/romasDepósito de dispositivos médicos64-3430
Pinzas hemostáticas www.medicaldevicedepot.com Kelly rectas 5.5"PilgtimmedicalFA710-50www.pilgtimmedical.com
C57BL/6 ratonesHilltop Lab Animals Inc.
  Mesa de manipulación de ratón y termómetro rectalVisualsonics
 Vevo 1100MS400
Vevo 1100 Sistema de imágenes FUJIFILM VisualSonics Inc.
Kit de ELISA de cistatina C y kit de creatinina de ratón Crystal Chem. Inc.
Kit ELISA de moño de ratón MyBioSource Inc 
de 4" Transductor MicroScan de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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