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Artículo de método

In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias

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DOI:

10.3791/55832

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28 de septiembre de 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Environmental and Occupational Health, School of Public Health, NIEHS Center for Environmental Exposures and Disease, Environmental and Occupational Health Sciences Institute, Rutgers University, 2Veterinary Drugs & Biologics Division, Animal and Plant Quarantine Agency

En este artículo

Resumen

Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.

Resumen

El ritmo circadiano es un proceso fisiológico fundamental presente en todos los organismos que regula los procesos biológicos que van desde la expresión del gen a dormir comportamiento. En los vertebrados, el ritmo circadiano es controlado por un oscilador molecular que funciona en el núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasos central) y las células individuales que comprende los tejidos más periféricos. Lo más importante, alteración del ritmo circadiano por la exposición a la luz en la noche, estresores ambientales o sustancias tóxicas es asociado con mayor riesgo de enfermedades crónicas y el envejecimiento. La capacidad para identificar agentes que pueden perturbar Relojes biológicos central o periféricas y que pueden prevenir o mitigar los efectos de la disrupción circadiana, tiene implicaciones importantes para la prevención de enfermedades crónicas. Aunque modelos de roedores se pueden utilizar para identificar riesgos y agentes que inducen o evitarán/mitigación la disrupción circadiana, estos experimentos requieren de grandes cantidades de animales. Estudios in vivo también requieren infraestructura y recursos importantes y requieren los investigadores trabajar toda la noche. Así, hay una necesidad urgente de un tipo de células apropiadas en vitro sistema a pantalla para ambientales disruptores circadianos y potenciadores en tipos de células de diferentes órganos y enfermedades. Construimos un vector que impulsa a transcripción de la luciferase desestabilizada en células eucarióticas bajo el control del promotor humano del gene de periodo 2 . Esta construcción circadiano reportero fue estable transfected en las células epiteliales mamarias humanas y células circadiano sensible reportero fueron seleccionadas para desarrollar el ensayo de bioluminiscencia en vitro . Aquí, presentamos un protocolo detallado para establecer y validar el análisis. Ofrecemos más información para la prueba de los experimentos de concepto que demuestra la capacidad de nuestro análisis en vitro para recapitular los efectos en vivo de diversos productos químicos en el reloj biológico celular. Los resultados indican que el ensayo puede ser adaptado a una variedad de tipos de células para detectar disruptores ambientales y chemopreventive potenciadores de los relojes circadianos.

Introducción

El reloj circadiano regula una amplia gama de procesos biológicos de diurna expresión de los genes dormir comportamiento a un ritmo predecible con una periodicidad de aproximadamente 24 h. epidemiológica estudios sugieren fuertemente que alteración crónica de los ritmo aumenta el riesgo de cáncer de mama y próstata en los trabajadores por turnos, incluyendo enfermeras y equipos de vuelo de1,2,3. Estas conclusiones son corroboradas por estudios de roedores, demostrando que la exposición a los ciclos de luz en la noche, o de la luz la luz constante, que imitan la incidencia de tumor aumento de jet-lag y acelera el crecimiento de tumor4,5. Basado en datos de estudios humanos y roedores, la Agencia Internacional para investigación del cáncer clasifica turnos de trabajo como un probable carcinógeno humano (tipo 2A) en 20106.

Previamente, hemos demostrado que una sola dosis cancerígena de la carcinógeno específico de tumor mamario, N- nitroso-N- Metilurea (NMU), interrumpe la expresión circadiana de genes circadianos mayores (CGs) (p. ej., 2 periodo , Per2) y varios genes circadianos controlados (CCGs), incluyendo clave de respuesta del daño de la DNA y reparación de genes (DDRR) en la glándula mamaria de destino (pero no en el hígado). Por otra parte, para reiniciar la expresión circadiana de genes Per2 y desmovilización hacia la normal, un régimen quimiopreventivo dietético L-metil-selenocisteína (MSC) reduce la incidencia de tumores en un 63%. Estos hallazgos fueron los primeros en mostrar un enlace mecánico entre el ritmo circadiano, carcinogénesis química y quimioprevención7,8. Exposición a otros tóxicos medioambientales demostrados para interrumpir la expresión de genes circadianos en vivo también se asocian con mayor riesgo de enfermedades ambientales9,10. Comprensión de los mecanismos que vinculan la disrupción circadiana por tóxicos ambientales y patogenia puede llevar al mecánico los enfoques para la prevención de enfermedades. Sin embargo, estudios encaminados a definir las interacciones entre la exposición y del ritmo circadiano se realizan generalmente en vivo. Un típico en vivo experimento investiga que el impacto en el ritmo circadiano requiere grandes cantidades de animales, como controlan de los tejidos de al menos tres y tres animales expuestos deben ser recogidos cada 3-4 h durante 24 o 48 h. Desarrollo de un sistema validado en vitro que recapitula en vivo observaciones y mecanismos por lo tanto, no sólo reducir el número de animales requeridos, pero reducir dramáticamente los costos experimentales y el requisito de que los investigadores trabajan continuamente durante un período de 24-48 h. Por otra parte, un sistema validado en vitro podría utilizarse para el cribado de alto rendimiento de compuestos o alteración genética que afecta el ritmo circadiano, o su respuesta a estresores ambientales o sustancias tóxicas. Por lo tanto, la combinación estratégica de modelos in vitro e in vivo y los experimentos son necesarios para obtener diferentes perspectivas con enfoque diferente.

En los mamíferos, osciladores circadianos existen no sólo en neuronas especializadas de la escena, sino también en tipos de células más periféricos. Estos relojes moleculares son similares a ésos en líneas celulares de fibroblastos establecidos y en fibroblastos primarios de embriones o animales adultos; sin embargo, hay una necesidad de tejido tipo-específica de modelos celulares11. En consecuencia, estudio de la actividad locomotriz en vivo, SCN explantes ex vivo, y basado en la célula en vitro ensayos en células inmortalizadas fibroblastos son ampliamente utilizados para estudiar defectos circadianos celular autónoma. Sin embargo, no existe evidencia que indica que una en vitro fibroblastos celular ensayo puede recapitular mecanismos circadianos y respuestas presentan en células de otros órganos periféricos en vivo. Diferentes tipos de células pueden tener distintos patrones de expresión génica, metabolismo xenobiótico y desmovilización, y la relación entre toxicidad y expresión de genes circadianos puede ser tipo de la célula específica o modulado por diferentes parámetros fisiológicos. Además, osciladores circadianos en sistemas basados en fibroblastos no hayan sido completamente evaluados para respuestas a sustancias tóxicas ambientales, factores de estrés y agentes preventivos que vinculan la exposición a los mecanismos de prevención y desarrollo de la enfermedad. Por lo tanto, hay una necesidad de facile, validados-tipo de células específicas, en vitro ensayos de bioluminiscencia para estudiar disruptores circadiano ambientales específicas de órgano. Aunque una variedad de modelos de celular reloj (p. ej., en hígado, queratinocitos y células de grasa, así como una línea celular de osteosarcoma) han desarrollado en estos últimos años12,13,14, 15, el ensayo descrito aquí es el primer modelo de reloj celular en células epiteliales de mama y la primera demostración para recapitular en vivo respuesta a estresores ambientales, tóxicos, fármacos y agentes quimiopreventivos.

Renilla LUCIFERASA (rLuc) y luciferasa de la luciérnaga son proteínas monoméricas de 61 30 kDa que no requieren postraduccional de procesamiento para la actividad enzimática y pueden funcionar como un reportero genético inmediatamente después de la traducción. Una vez que el sustrato se asocia con la enzima luciferasa, la reacción bioquímica catalizada genera un destello de luz. Por lo tanto, construcciones de luciferase son ampliamente utilizadas como gene expresión reportero sistema en vitro y en vivo. Sin embargo, en estudios del ritmo circadiano, la utilidad del reportero de luciferasa está limitada por la vida media relativamente larga de la proteína luciferase (T1/2 = 3,68 h) en relación con el período (especialmente a corto plazo) cambios en el gen circadiano expresión; sin embargo, numerosos estudios sobre los años han utilizado con éxito el gen de luciferasa en el vector pGL3, indicando que el luciferase rápidamente degradable puede no ser necesario para denunciar los ritmos circadianos, especialmente para los ritmos con un período más largo, como 24 h. Por lo tanto, un plásmido reportero usando vector luciferase desestabilizada, pGL [Luc2P/Neo], que contiene hPEST (una secuencia de la desestabilización de la proteína) se ha desarrollado, lo que nos permite utilizarlo como un vector reportero circadiano para nuestro actual in vitro ensayo de bioluminiscencia. La proteína codificada por Luc2P tiene una mucho más corta vida media (T1/2 = 0,84 h) y por lo tanto, responde más rápidamente y con una magnitud mayor a los cambios en la actividad transcripcional de tipo silvestre,indicar que puede ser utilizado para monitorizar la expresión rítmica de luciferase regulado por el promotor PER2 exactamente en tiempo real16.

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Protocolo

1. construcción del PER2 promotor conducido desestabilizado Luciferase Reporter Vector

  1. comprar un modificado para requisitos particulares, pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contiene el cDNA que codifican rLuc y humanos Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) en el sitio entre Sac I y Hind III en la región clonación múltiple 17.
  2. Cortar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) por el vector no. Buffer de enzima de la restricción
    1. añadir 2.5 μl, 10 μl (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector y 1 μl de cada una de las enzimas de restricción, Sac I (unidad 10/μl) y Hind III (unidad 10/μl), en un DNA/RNA/nucleótido libre tubo de microcentrífuga. Añadir suavemente agua ultrapura (10.5 μl) hasta 25 μl y mezclar mediante pipeteo.
    2. Incubar a 37 ° C durante 90 minutos en un bloque calefactor.
    3. Ejecutar el volumen entero (25 μl) de la reacción de la enzima de la restricción en gel de agarosa de 0,7% que contiene 0,0001% bromuro de etidio (EtBr) para separar el vector de la hPER2P.
      Nota: EtBr, bromuro de 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridinium (número de registro CAS: 1239-45-8), es un líquido rojo de olor. Es un agente intercalante que es comúnmente usado como un fluorescente de etiqueta (tinción de ácidos nucleico) en electroforesis en gel de agarosa y visible como un color naranja bajo luz UV. Se han producido posibles riesgos irreversibles efectos mutagénicos en animales de experimentación, aunque ninguna de las agencias reguladoras había clasificado como un carcinógeno 18. Por lo tanto, se recogieron agarosa utilizado gel y electroforesis tampón que contiene EtBr como residuos de riesgo químico y pidió a Rutgers salud ambiental & seguridad (REHS) para recoger y eliminar con seguridad.
    4. Cortar un trozo de gel de agarosa que contiene una banda de fluorescencia de EtBr en 941 bp y purificar los hPER2P fragmentos del gel con un kit de extracción de ADN gel, seguido de la cuantificación en un espectrofotómetro midiendo densidad de absorción (OD) en longitud de onda de 260 nm.
  3. Alinear 1.0 μL (1 μg) del vector de expresión de luciferasa firefly desestabilizada, pGL [Luc2P / Neo] con el mismo método que se describe en pasos 1.2.1-1.2.2. Extraiga el vector con un kit de limpieza de ADN seguido de cuantificación descrita usando un espectrofotómetro.
  4. Ligar el hPER2P en el pGL vector linearizado [Luc2P / Neo].
    Nota: por el fabricante ' s instrucción, la relación molar ideal del inserto y el vector es 2:1. Vector de ng 50, se calcula la cantidad ideal de inserción como 23.6 ng con un fórmula, [(50 ng vector x 1.0 kb insert)/4.242 kb vector] x (2/1) = 23.6 ng insert]. Basado en las concentraciones de hPER2P (7,26 ng/μL) y pGL [Luc2P / Neo] (50 ng/μL), los volúmenes de 50 ng pGL [Luc2P / Neo] y 23.6 ng hPER2P se calcula como 1 μl y 3,26 μl, respectivamente.
    1. Añadir 2 μl T4 ADN ligasa reacción tampón (10 X) (50 mM Tris-HCl 10 mM MgCl 2, ATP de 1 mM y 10 mM DTT), 3,26 μl (23.6 ng) hPER2P, 1 μl (50 ng) pGL [Luc2P / Neo], y 13.74 μl hasta 20 μl de agua , mezclar suavemente.
    2. Agregar 1 μl T4 ADN ligasa (unidad de 400/μL), mezcle suavemente e incubar a 16 ° C durante la noche en un termociclador y luego enfriar el vector ligado en el hielo por el fabricante ' instrucción s.
  5. Transformar el pGL ligados vector [hPer2P / Luc2P / Neo] químicamente competentes de e. coli 19.
    1. Configurar el baño de agua a 42 ° C, caliente Super caldo óptimo medio de represión (novedosa) de catabolito (2% triptona, 0,5% extracto de levadura, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl 2, 10 mM MgSO 4 y 20 mM de glucosa) a temperatura ambiente , calentar la placa de agar Luria-Bertani (LB) (contiene ampicilina μg/mL 100, 80 μg/mL X-gal e IPTG de 0.5 μm) en incubadora de 37 ° C y descongelar el hielo un vial de competente e. coli las células para cada transformación.
    2. Añadir 6 μl (21 ng) ligarse vector o 1 μl (30 ng) Vacíe el vector (control negativo) a un tubo de químicamente competentes de e. coli (50 μL) y luego voltear suavemente el tubo para mezclar. Incubar en hielo durante 30 minutos
    3. Calor de choque en un baño de agua de 42 ° C durante 30 s sin agitar y luego volver a hielo.
  6. Seleccionar una colonia de e. coli transformada con un vector ligado con azul/blanco cribado.
    1. Añadir 250 μl de medio de novedosa en la transformada de e. coli del tubo e incubar durante 1 h a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
    2. Esparza uniformemente 10-50 μl de transformadas de e. coli en la superficie de la placa de agar LB. Colocar la placa invertida en incubadora de 37 ° C durante la noche.
      Nota: Una eficiente reacción de clonación debería producir varias cientos colonias. Dos volúmenes diferentes de la galjanoplastia se recomienda para asegurar que al menos una placa de color blanco o azul grande, clara y colonias bien espaciadas. Cuando las colonias son muy pequeñas y el color no es distinguible, es útil usar un microscopio (10 X ó 50 X).
    3. Pick 3-6 colonias blancas de las placas con palillos de diente esterilizado y suelte cada colonia en tubo de una cultura que contiene 4 mL de medio de cultivo LB con ampicilina 50 de μg/mL.
    4. Incubar los tubos a 37 ° C con agitación a 200 rpm durante la noche. Extraer el ADN usando 2 mL de 4 mL cultivadas e. coli con plásmidos DNA extracción mini prep kit por el fabricante ' instrucción s.
  7. Verificar y analizar la inserción (hPER2P, 941 bp)
    1. digerir el ADN del plásmido con enzimas de restricción y correr la electroforesis como se describe en pasos 1.2.1-1.2.3 para confirmar si hay una inserción.
      Nota: Control positivo (hPER2P purificada a paso 1.2.4) y control negativo (e. coli transformadas con un vector vacío) eran incluido.
    2. La secuencia de la DNA del plasmid seleccionado usando M13 adelante y M13 reverso cartillas para confirmar la orientación y la secuencia del inserto en el plásmido 19.
      Nota: Sólo una colonia que tenía un inserto con el tamaño correcto de hPER2P en la electroforesis y la orientación correcta y la secuencia en el resultado de la secuencia fue seleccionada.
    3. Analizar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) de la secuencia de los elementos reguladores circadianos, incluyendo motivo de E-box (sitio de la Unión de Bmal1, gato/CGTG), CCAATC, GC la caja y transcripción inicio del sitio (CAGCGG) 20.
  8. Amplificar el seleccionado e. coli mediante la adición de lo 2 mL restante cultivadas e. coli en medio de cultivo de 200 mL LB que contiene 50 ampicilina μg/mL y a continuación, incubar durante la noche a 37 ° C con agitación a 200 rpm.
  9. Extracto de ADN con un maxi de plásmido libre de endotoxina prep kit por el fabricante ' instrucciones de s y luego cuantificarlo mediante la medición de OD en longitud de onda de 260 nm con un espectrofotómetro. Alícuota y almacenar el ADN plásmido pGL [hPer2P/Luc2P/Neo], en el congelador de-80 ° C para su uso futuro.

2. Transitorios de la transfección

  1. compra y cultura MCF10A células Banco
    1. compra una inmortalizado, no transforma humanos mamaria epitelial línea celular normal (MCF10A) de un comercial, donde las células son citogenéticamente repetición en tándem corta prueba y autenticado con análisis antes de congelarlos. Descongelar y mantener cada frasco de las células en la cultura para un máximo de 8 semanas.
      Nota: A diferencia de otras células, estas células tienen inhibición de contacto una vez que llegan a la confluencia de ~ 70%. Requiere eso subcultivo se lleva a cabo en ~ 70%.
      2. Las células con medio de crecimiento de la célula epitelial mamaria (MEGM), que contiene la toxina del cólera en una incubadora de cultivo celular en 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2, medio basal epitelial mamaria (MEBM) y suplementos de crecimiento de la cultura de
    2. .
      Nota: Compra lista para usar factores de crecimiento proporcionados en SingleQuot (SQ) y obtener por separado la toxina del cólera. Concentraciones finales de crecimiento suplementos son 0.4% Extracto de pituitaria bovina, insulina 0.1%, hidrocortisona 0.1%, 0.1% factores de crecimiento epidérmico humano, toxina del cólera de 100 ng/mL y 0.05% de sulfato de gentamicina y 0.05% anfotericina B.
    3. Disociar las células de la placa de cultivo de 10 cm por la incubación con 10 mL de tripsina/EDTA para ~ 20 min y luego neutralizar la tripsina añadiendo tripsina 10 mL una solución que neutraliza. Recoge todas las células con HEPES tamponada con solución salina (HBSS).
    4. Contar las células con un hemocitómetro bajo un microscopio invertido y calcular la concentración de la suspensión de la célula y entonces la semilla un cierto número de células según sea necesario. Remolino de las placas a fin de obtener una distribución uniforme de las células en cada plato. Incubar las células en la incubadora de cultivo celular a 37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2.
      Nota: Comprar un paquete de reactivo de subcultura que contiene tripsina/EDTA, solución neutralizante tripsina y HBSS usar.
  2. Transitorios de la transfección de células con el vector circadiano construido.
    1. Semilla 2 x 10 5 MCF10A células uniformemente en la cultura de 35 mm plato con MEGM y crecen hasta 20-30% confluencia (día siguiente).
    2. Caliente hasta el reducido suero los medios de comunicación (por ejemplo, Opti-MEM) en 37 ° C agua baño y transfección reactivo a temperatura ambiente durante 30 min diluir el plásmido ADN construido (pGL [hPer2P / Luc2P / Neo]) a 30 ng/μl con endo toxina libre Tampón Tris-EDTA (TE) y mantener a temperatura ambiente.
    3. Preparar la mezcla de transfección de plásmidos en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL agregar 63,6 μl suero reducido caliente medios primero y luego añadir 33,4 los ADN de plásmido de (0.1 μg) μl y mezclar suavemente por pipeteo y luego por último agregar 3 μl de la transfección reactivo directamente en el centro del tubo sin tocar la pared. Después de mezclar suavemente mediante pipeteo, mantener a temperatura ambiente durante 30 min
    4. La mezcla de plásmido completo (100 μL) de la gota directamente sobre la superficie del centro del medio de la placa y luego mezclar suavemente agitando el plato. Las células en una incubadora de CO 2 para adicional 48-72 h. de la cultura
      Nota: Se prevé que sea la más alta eficiencia de transfección en confluencia de 40-70% de estas células debido a su inhibición de contacto en ~ 70%. Por lo tanto, la transfección trabaja mejor a partir de ~ 20% y parada en ~ 70% confluencia.

3. Establecimiento del ensayo In Vitro de bioluminiscencia en MCF10A transfectadas transitoriamente las células

  1. mueren de hambre las células cultivadas en confluencia de ~ 70% (después de transfección para 48-72 h) en MEBM sin factores de crecimiento para 24 h.
  2. Tratar las células con el agente de sincronización (por ejemplo, 50% de suero de caballo (TA)) en MEBM de 1,5 h en un incubador de CO 2.
    Nota: Para la selección de un agente de sincronización ideal, 10 μm forskoline, melatonina nM 1, dexametasona 0.1 μm, 50% HS y 100% SQ se compararon en términos de amplitud circadiana y período en las células de los vectores transfectadas. Las células vacías vector transfectada son tratadas con 100% SQ como control negativo.
  3. Medio de grabación de pre-prepare 20 mL (para 10 platos de 30-mm cultura) añadiendo 5 mL de MEGM, 15 mL de MEBM 150 bicarbonato de sodio μl, 200 μL de HEPES y luciferin 40 μl de stock (50 mM) de solución en un tubo de centrífuga de 50 mL esterilizado.
    Nota: Las concentraciones finales de cada componentes: 20% SQ y toxina del cólera de 20 ng/mL, bicarbonato de sodio 0.06%, 1% de penicilina/estreptomicina y 10 mM HEPES. Calentar previamente preparado medio de grabación y esterilizadas de 1 x PBS por 30 min en baño de agua de 37 ° C. Añadir 100 luciferin μm inmediatamente antes del uso.
  4. Lavar las células con caliente 1 x Dulbecco ' s Phosphate-Buffered salina (D-PBS) para 3 veces después de la incubación con el agente de sincronización y luego agregar 2 mL de medio de grabación.
  5. Selle el plato con una clase de esterilizada cubierta con grasa de silicona para evitar la evaporación y luego la etiqueta en el lado.
  6. Colocar el plato sellado en el asiento en el luminómetro y activar la opción para guardar la ubicación del archivo en la carpeta (para detalles, ver sección 6).

4. Selección de células Transfected estable

  1. optimizar una concentración ideal de G418 (800 μg/mL) con un análisis de curva de muerte según el fabricante ' instrucción de s para la selección de las células transfected estable.
  2. Después de transfección transitoria para 48 h o 72 h, subcultura y semillas las células con MEGM en platos más grandes en 5.000 células/plato (100 mm). Después de 24 h la cultura en la incubadora de cultivo celular (37 ° C, humedad de 95% y 5% CO 2), tratar las células con 800 μg/mL de G418 sustituyendo el medio viejo con el nuevo medio que contiene 800 μg/mL G418 cada 3-4 días durante 2 semanas.
  3. Subcultivo el sobrevivir estable transfected colonias para los pasos 1-3 con el MEGM que contiene 500µg/mL G418 para mantener la expresión estable de hPer2P/Luc2P y congelar en nitrógeno líquido para su uso futuro.
  4. Tratar 500µg/mL G418 después de subcultura general volver a seleccionar la población estable transfected las células, si la intensidad de la bioluminiscencia en el resultado del ensayo de bioluminiscencia en vitro se convierte progresivamente más baja después de su uso en muchos pasajes.

5. Tratamiento con productos químicos

  1. en 48 h o 72 h post-transfección, mueren de hambre las células de factores de crecimiento en MEBM de 24 h.
  2. Después de la sincronización con el 50% HS por 2 h, tratar las células con 0,25 o 0,5 mM nitrosomethylurea (NMU), 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm para 1 h en MEBM que contiene 20% sq
  3. Después de lavar 1 x D-PBS, añadir grabación medio μm 12,5 contiene MSC solos o en combinación con 20 nM EX527 o cambinol de 1 μm, las células. Monitoreo de la bioluminiscencia con el luminómetro.
  4. Tratar la MCF10A estable transfected / PER2-células dLuc con NMU en 0,5, 1 o 2 mM, EX527 a 40 nM, o Cambinol a 2.0 μm, durante 1 h después de la sincronización con el 50% HS y luego incubar las células en el registro medio que contiene 12,5 μm de MSC o (5, 10 y 20 μm) de diferentes dosis de n-acetilcisteína (NAC). Coloque las placas en el luminómetro, expediente y guardar la bioluminiscencia por luminómetro para 4-8 días, como se describe en la sección 3.6.
    Nota: NMU es una nitrosourea metilado compuesto con propiedades mutagénicos, carcinogénicos y teratogénicos. NMU es un agente alquilante de acción directa y tiene una corta vida media (T 1/2 = ~ 30 min). Es estable en condiciones ácidas (pH 4-5), pero inestable en condiciones alcalinas (pH 9-10) y a temperaturas más allá de 20 ° C. Por lo tanto, lejía al 10% puede utilizarse como un eficaz agente de desactivación para limpiar superficies de banco y laboratorio productos potencialmente contaminados por NMU len. Solución stock restos recogidos y eliminado con seguridad por REHS. Basado en el modo de acción de productos químicos, las células sincronizadas pueden tratarse para tiempos más cortos antes de cultivo en medio de la grabación. Las células también pueden ser tratadas en el medio de grabación por más tiempo (varios días).

6. Recolección de datos, análisis y presentación

Nota: viabilidad celular debe determinarse utilizando métodos estándar (por ejemplo, ensayo MTT) después del tratamiento de las células en las mismas concentraciones de la misma hora indicada. Todas las concentraciones de tratamiento utilizadas en el ensayo de bioluminiscencia en vitro fueron menores que la concentración letal del 30% (LC30). Todos los experimentos se realizaron por triplicado y se presentaron resultados representativos.

  1. Después de sellar el plato (paso 3.5), cargue los platos sobre los asientos en el luminómetro, que se mantiene dentro de una incubadora a 37 ° C sin H 2 O y CO 2 y conectado a un ordenador.
  2. Clic " guardar " y escriba los nombres de la carpeta y el archivo donde se guardará la señal de luminiscencia grabado de la fuente correspondiente.
    Nota: El sistema detecta la señal de luminiscencia en tiempo real de las células en el plato en posiciones individuales. Las señales son transferidas a la computadora a través de recuento de fotones de 4 tubos de fotomultiplicador, guardadas y aparece en la computadora por el software de colección de datos.
  3. Analizar las señales después de grabar de 4-7 días, que podría ser seguido por medio cambio y grabación continua por segunda semana si es necesario.
    Nota: Para obtener parámetros circadianos, incluyendo longitud de período, fase, amplitud del ritmo y amortiguación tipo, utilizamos el software de análisis de luminómetro para analizar los datos de bioluminescence.
  4. Detrend datos raw con un promedio de marcha y analizar el mejor se adapta a una onda sinusoidal, período, fase, amplitud y amortiguación tipo 21 , 22.
  5. Debido a la alta bioluminiscencia transitoria al tratamiento y el cambio de medio, excluir el primer ciclo de los datos de análisis.
  6. Para la presentación de los datos, trama de datos (bioluminiscencia, cuenta/s) contra el tiempo (hora o día). Cuando sea necesario, se pueden trazar la resta de línea de base de datos para comparar la amplitud y fase.

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Resultados

Vector de reportero de bioluminiscencia circadiano: PER2 humano impulsado por el promotor la expresión de variante de luciferase desestabilizada

La secuencia de ADN que comprende un fragmento de bp 941 deriva el promotor humano de PER2 utilizado para construir el vector reportero circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primero se analizó la presencia de elementos reguladores que regulan expresión de g...

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Discusión

En células de mamífero, periodicidad del reloj circadiano está regulada por retroalimentación transcripcional/traslacional interconectados. Heterodímeros de Bmal1 y reloj o Npas2 regular circadiano transcripción de unión a elementos de E-box en los promotores de núcleo CGs, incluyendo Per2 y gritoy numerosos CCGs4. Medida que se acumulan en la célula, heterodímeros de por: Cry postraduccional se modifican y transportados al núcleo para reprimir la actividad transcripcional de Clo...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por la sociedad de Toxicología de 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant de investigación alterativa (M. Fang) y la investigación de colaboración internacional fondo de Animal y de la Agencia de cuarentena de planta, República de Corea (M. Fang), y conceder el NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nos gustaría agradecer al Dr. Zheng Chen (McGovern Facultad de medicina de la Universidad de Texas Health Science Center Houston) para su discusión útil, el Sr. Juan Shao-An por su ayuda experimental y la Sra. Kimi Nakata para su lectura de prueba.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
vector pLS[hPER2P/rLuc/Puro]SwitchGear GenomicsS700000vector personalizado
vector pGL4.18[Luc2P/Neo]Promega9PIE673vector de expresión de luciferasa desestabilizado
T4 ADN ligasaInvitrogen15224041para la subclonación
Kit de clonación TOPO TAInvitrogenK4500-02con One Shot TOP10 E. coli químicamente competente
Saco INew England BioLabsR0156SEnzima de restricción
Hind III-HFNew England BioLabsR3104SEnzima de restricción
Tampón CutSmartNew England BioLabsB7204STampón enzimático de restricción
extracción de gel de ADNQiagen28704Purificar fragmentos de ADN de gel de agarosa
Kit de purificación de PCRQiagen28104Limpieza de ADN
Modificación de LB MillerTEKNOVAL8600Para el cultivo de E. coli transformado
Placa de agar LBTEKNOVAL1902Para la selección blanco/azul
QIAprep spin miniprepKit Qiagen27104Para la extracción de plasma de ADN
EndoFree plásmido maxi prep KitQiagen12362Para la extracción de ADN plasmídico
FuGene HDPromegaE2311Reactivo de transfección
Opti-MEM medio sérico reducidoInvitrogen31985-062Para la transfección
Línea celular MCF10AColección de cultivo tipo americanoCRL-10317Células epiteliales mamarias
MEGM BulletKitLonzaCC-3150Medio de crecimiento epitelial mamario
MEBMLonzaCC-3151Epitelial Mamario Medio Basal MEGM
SingleQuot KitLonzaCC-4136Suplementos & Factores de crecimiento
ReagentPackLonzaCC-5034Reactivo para subcultivo
D-PBS (10X)SigmaD1408Lavar células en placas de cultivo
Agua destilada ultrapuraInvitrogen10977Diluido 10X D-PBS Plato de cultivo de
tejidos (35 mm)BD/Falcon353001plato de cultivo celular adecuado para LumiCycle
Grasa de siliconaFisherNC9044707Para sellar platos con medio de grabación
Cubreobjetos redondosHarvard Bioscience64-1500 (CS-40R)Para sellar platos con medio de registro
Toxina del cóleraSigmaC8052Suplemento para medio de crecimiento
Sulfato G418 (Geniticin)Invitrogen10131035Antibiótico para la selección de células transfectadas estables
AmpicilinaSigmaA9393Para la selección de colonias
ForskolinSigmaF6886Agente de sincronización
MelatoninaSigmaM5250Agente de sincronización
DexametasonaSigmaD4902Agente de sincronización
Suero de caballoSigmaH1138Agente de sincronización
d-Luciferina, sal de sodioInvitrogenL2912Sustrato de luciferasa
IC261Sigma10658Control positivo para el disruptor circadiano
Metilnitrosourea (NMU)SigmaN1517Carcinógeno mamario específico
Metilselenocisteína (MSC)SigmaM6680Selenio orgánico (agente quimiopreventivo)
EX527SigmaE7034Inhibidor específico de SIRT1
CambinolSigmaC0494SIRT1 & Inhibidor de SIRT2
Espectrofotómetro NanoDropThermo ScientificNanoDrop 8000Cuantificar nucleótidos
GeneAmp Sistema de PCR 9700Applied BiosystemsN805-0200Para experimento de biología molecular
Incubadora de CO2NAPCOSerie 8000 DHPara cultivo celular al 5% CO2 a 37 & deg; C
Centrífuga de sobremesa con refrigeradorEppendorf5430RPara experimento de biología molecular
Centrífuga con cuchara oscilanteEppendorf5810 RPara cultivo celular
Microscopio invertidoNikon80124Contraste de fase opcional
Campana de cultivo de tejidosLabconcoClase II A2BSL-2 certificado
LumiCycle 32ActimetricsNo disponibleDetector de luminoscencia
kit de

Referencias

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