Se presenta un ensayo de bioluminiscencia en vitro para determinar del ritmo circadiano celular en células epiteliales mamarias. Este método utiliza plásmidos de reportero de células de mamífero expresando desestabilizada luciferasa bajo el control del promotor del gen de periodo 2 . Puede ser adaptado a otros tipos de células para evaluar efectos de órgano-específicas en el ritmo circadiano.
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Artículo de método
In Vitro Ensayo de bioluminiscencia para la caracterización del ritmo circadiano en células epiteliales mamarias
En este artículo
Resumen
Resumen
El ritmo circadiano es un proceso fisiológico fundamental presente en todos los organismos que regula los procesos biológicos que van desde la expresión del gen a dormir comportamiento. En los vertebrados, el ritmo circadiano es controlado por un oscilador molecular que funciona en el núcleo supraquiasmático (SCN; marcapasos central) y las células individuales que comprende los tejidos más periféricos. Lo más importante, alteración del ritmo circadiano por la exposición a la luz en la noche, estresores ambientales o sustancias tóxicas es asociado con mayor riesgo de enfermedades crónicas y el envejecimiento. La capacidad para identificar agentes que pueden perturbar Relojes biológicos central o periféricas y que pueden prevenir o mitigar los efectos de la disrupción circadiana, tiene implicaciones importantes para la prevención de enfermedades crónicas. Aunque modelos de roedores se pueden utilizar para identificar riesgos y agentes que inducen o evitarán/mitigación la disrupción circadiana, estos experimentos requieren de grandes cantidades de animales. Estudios in vivo también requieren infraestructura y recursos importantes y requieren los investigadores trabajar toda la noche. Así, hay una necesidad urgente de un tipo de células apropiadas en vitro sistema a pantalla para ambientales disruptores circadianos y potenciadores en tipos de células de diferentes órganos y enfermedades. Construimos un vector que impulsa a transcripción de la luciferase desestabilizada en células eucarióticas bajo el control del promotor humano del gene de periodo 2 . Esta construcción circadiano reportero fue estable transfected en las células epiteliales mamarias humanas y células circadiano sensible reportero fueron seleccionadas para desarrollar el ensayo de bioluminiscencia en vitro . Aquí, presentamos un protocolo detallado para establecer y validar el análisis. Ofrecemos más información para la prueba de los experimentos de concepto que demuestra la capacidad de nuestro análisis en vitro para recapitular los efectos en vivo de diversos productos químicos en el reloj biológico celular. Los resultados indican que el ensayo puede ser adaptado a una variedad de tipos de células para detectar disruptores ambientales y chemopreventive potenciadores de los relojes circadianos.
Introducción
El reloj circadiano regula una amplia gama de procesos biológicos de diurna expresión de los genes dormir comportamiento a un ritmo predecible con una periodicidad de aproximadamente 24 h. epidemiológica estudios sugieren fuertemente que alteración crónica de los ritmo aumenta el riesgo de cáncer de mama y próstata en los trabajadores por turnos, incluyendo enfermeras y equipos de vuelo de1,2,3. Estas conclusiones son corroboradas por estudios de roedores, demostrando que la exposición a los ciclos de luz en la noche, o de la luz la luz constante, que imitan la incidencia de ....
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Protocolo
1. construcción del PER2 promotor conducido desestabilizado Luciferase Reporter Vector
- comprar un modificado para requisitos particulares, pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vector que contiene el cDNA que codifican rLuc y humanos Fragmento de promotor PER2 (hPER2P, 941 bp) en el sitio entre Sac I y Hind III en la región clonación múltiple 17.
- Cortar el fragmento de promotor PER2 humano (hPER2P, 941 bp) por el vector no.
Buffer de enzima de la restricción
- añadir 2.5 μl, 10 μl (180 ng) pLS [hPER2P / rLuc / Puro] vecto....
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Resultados
Vector de reportero de bioluminiscencia circadiano: PER2 humano impulsado por el promotor la expresión de variante de luciferase desestabilizada
La secuencia de ADN que comprende un fragmento de bp 941 deriva el promotor humano de PER2 utilizado para construir el vector reportero circadiano, pGL [hPer2P/Luc2P/Neo, primero se analizó la presencia de elementos reguladores que regulan expresión de g.......
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Discusión
En células de mamífero, periodicidad del reloj circadiano está regulada por retroalimentación transcripcional/traslacional interconectados. Heterodímeros de Bmal1 y reloj o Npas2 regular circadiano transcripción de unión a elementos de E-box en los promotores de núcleo CGs, incluyendo Per2 y gritoy numerosos CCGs4. Medida que se acumulan en la célula, heterodímeros de por: Cry postraduccional se modifican y transportados al núcleo para reprimir la actividad transcripcional de Clo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la sociedad de Toxicología de 2012 (SOT)-Colgate Palmolive Grant de investigación alterativa (M. Fang) y la investigación de colaboración internacional fondo de Animal y de la Agencia de cuarentena de planta, República de Corea (M. Fang), y conceder el NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Nos gustaría agradecer al Dr. Zheng Chen (McGovern Facultad de medicina de la Universidad de Texas Health Science Center Houston) para su discusión útil, el Sr. Juan Shao-An por su ayuda experimental y la Sra. Kimi Nakata para su lectura de prueba.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| vector pLS[hPER2P/rLuc/Puro] | SwitchGear Genomics | S700000 | vector personalizado |
| vector pGL4.18[Luc2P/Neo] | Promega | 9PIE673 | vector de expresión de luciferasa desestabilizado |
| T4 ADN ligasa | Invitrogen | 15224041 | para la subclonación |
| Kit de clonación TOPO TA | Invitrogen | K4500-02 | con One Shot TOP10 E. coli químicamente competente |
| Saco I | New England BioLabs | R0156S | Enzima de restricción |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Enzima de restricción |
| Tampón CutSmart | New England BioLabs | B7204S | Tampón enzimático de restricción |
| extracción de gel de ADN | Qiagen | 28704 | Purificar fragmentos de ADN de gel de agarosa |
| Kit de purificación de PCR | Qiagen | 28104 | Limpieza de ADN |
| Modificación de LB Miller | TEKNOVA | L8600 | Para el cultivo de E. coli transformado |
| Placa de agar LB | TEKNOVA | L1902 | Para la selección blanco/azul |
| QIAprep spin miniprep | Kit Qiagen | 27104 | Para la extracción de plasma de ADN |
| EndoFree plásmido maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | Para la extracción de ADN plasmídico |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Reactivo de transfección |
| Opti-MEM medio sérico reducido | Invitrogen | 31985-062 | Para la transfección |
| Línea celular MCF10A | Colección de cultivo tipo americano | CRL-10317 | Células epiteliales mamarias |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Medio de crecimiento epitelial mamario |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Epitelial Mamario Medio Basal MEGM |
| SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suplementos & Factores de crecimiento |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reactivo para subcultivo |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Lavar células en placas de cultivo |
| Agua destilada ultrapura | Invitrogen | 10977 | Diluido 10X D-PBS Plato de cultivo de |
| tejidos (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | plato de cultivo celular adecuado para LumiCycle |
| Grasa de silicona | Fisher | NC9044707 | Para sellar platos con medio de grabación |
| Cubreobjetos redondos | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | Para sellar platos con medio de registro |
| Toxina del cólera | Sigma | C8052 | Suplemento para medio de crecimiento |
| Sulfato G418 (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiótico para la selección de células transfectadas estables |
| Ampicilina | Sigma | A9393 | Para la selección de colonias |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Agente de sincronización |
| Melatonina | Sigma | M5250 | Agente de sincronización |
| Dexametasona | Sigma | D4902 | Agente de sincronización |
| Suero de caballo | Sigma | H1138 | Agente de sincronización |
| d-Luciferina, sal de sodio | Invitrogen | L2912 | Sustrato de luciferasa |
| IC261 | Sigma | 10658 | Control positivo para el disruptor circadiano |
| Metilnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Carcinógeno mamario específico |
| Metilselenocisteína (MSC) | Sigma | M6680 | Selenio orgánico (agente quimiopreventivo) |
| EX527 | Sigma | E7034 | Inhibidor específico de SIRT1 |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & Inhibidor de SIRT2 |
| Espectrofotómetro NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Cuantificar nucleótidos |
| GeneAmp Sistema de PCR 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | Para experimento de biología molecular |
| Incubadora de CO2 | NAPCO | Serie 8000 DH | Para cultivo celular al 5% CO2 a 37 & deg; C |
| Centrífuga de sobremesa con refrigerador | Eppendorf | 5430R | Para experimento de biología molecular |
| Centrífuga con cuchara oscilante | Eppendorf | 5810 R | Para cultivo celular |
| Microscopio invertido | Nikon | 80124 | Contraste de fase opcional |
| Campana de cultivo de tejidos | Labconco | Clase II A2 | BSL-2 certificado |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | No disponible | Detector de luminoscencia |
Referencias
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127(2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012)....
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Reimpresiones y permisos
