Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

Resumen

Los protocolos presentados describen cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe de las muestras de suero de los receptores de la vacuna de influenza. El primer ensayo determina las concentraciones óptimas de antígeno viral por hemaglutinación. El segundo ensayo cuantifica los títulos de anticuerpos específicos de la gripe por inhibición de la hemaglutinación.

Resumen

Títulos de anticuerpos se utilizan como marcadores sustitutos para protección serológica contra la gripe y otros gérmenes patógenos. Conocimiento detallado de la producción de anticuerpos pre y post vacunación es necesaria para comprender la inmunidad inducida por la vacuna. Este artículo describe un protocolo confiable de punto por punto para determinar títulos de anticuerpos específicos de la gripe. El primer protocolo describe un método para especificar la cantidad de antígeno necesaria para hemaglutinación, que normaliza las concentraciones para su uso posterior en el segundo protocolo (análisis de hemoaglutinación, prueba HA). El segundo protocolo describe la cuantificación de los títulos de anticuerpos específicos de la gripe frente a diferentes cepas virales mediante el uso de una dilución seriada de humano del suero o la célula cultura sobrenadantes (ensayo de inhibición de hemaglutinación, ensayo de HI).

Aplicada por ejemplo, se muestra la respuesta de anticuerpos de un grupo sano, que recibió una vacuna antigripal inactivada trivalente. Además, se muestra la reactividad cruzada entre el virus de la gripe diferentes y se explican métodos para minimizar la reactividad cruzada usando diferentes tipos de animales células de sangre rojas (RBCs). La discusión destaca ventajas y desventajas de los ensayos presentados y cómo la determinación de títulos de anticuerpos específicos de la gripe puede mejorar la comprensión de la inmunidad relacionada con la vacuna.

Introducción

Infección con el virus de la influenza se asocia con considerable morbilidad, mortalidad y altos costos de cuidado de la salud^1,2,3,4. En particular, ancianos, recién nacidos, mujeres embarazadas y pacientes con enfermedad crónica están en riesgo para los resultados clínicos más severos. Por lo tanto, la vacunación contra cepas de virus de gripe que circula es la medida principal para reducir la carga de enfermedad en estas poblaciones de alto riesgo. El aumento de la respuesta inmune individual después de la vacunación, por ejemplo....

Protocolo

Los protocolos de estudio fueron aprobados por la Junta de revisión ética local (www.EKNZ.ch) y se obtuvo consentimiento informado de todos los participantes.

1. suero colección

1. Recoger las muestras de suero de seres humanos en momentos de interés. Para este estudio, se colectaron sueros a los días 0 (tiempo de vacunación contra la influenza), + 7, + 30, + 60 y + 180 después de la vacunación.
2. Para obtener el suero, centrifugar los tubos de muestra a 1.200 x g durante 10 min a temperatura ambiente (20-25 ° C).
   Nota: Las muestras de sangre centrifugada no deben almacenarse a 4 ° C y durante no más de 24 h.
3. Alí....

Resultados

Respuesta de anticuerpos inducido pre- y post-vacunación contra la Influenza A H3N2
La respuesta de anticuerpos inducida por la vacuna se evaluó en 26 voluntarios sanos que recibieron una vacuna contra la gripe trivalente inactivada de la subunidad que contiene gripe A/H1N1/California/2009, A/H3N2/Texas/2012 y B/Massachusetts/02/2012 antes del 2014 / temporada de influenza de 2015. La figura 6 muestra un ejemplo representativo de los recep.......

Discusión

Cuantificación de los títulos de anticuerpos específicos pre y post vacunación influenza virus es una importante herramienta necesaria para los estudios de la vacuna. Basado en las medidas de sustituto de la protección contra la infección por virus, tales como de seroprotección (> 1:40) o seroconversión (aumento de 4 veces del título), la vacunación pueden ser estrategias optimizadas⁹. Utilizando los protocolos proporcionados puede determinar: (i) el potencial de hemaglutinación de un virus en par.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Depósitos de pipetas multicanal desechables de 25 ml	Integra	4312
Tubos de PCR de 8 pocillos	Marca GMBH	781332	Para alícuotas séricas
Placa de microtitulación de 96 pocillos, en forma de U	TPP	92097	Para el ensayo de IH cuando se utilizan glóbulos rojos de
mamíferos Placa de microtitulación de 96 pocillos, en forma de V	Corning Costar	3897	Para el ensayo de HI cuando se utilizan glóbulos rojos aviares
Aqua ad iniect. Steril	Bichsel AG	1000004	Para la preparación de soluciones de filtrado de antígenos de gripe y cólera
RBC de pollo (10%)	Cedralán	CLC8800	10% de suspensión de glóbulos rojos de pollo en solución de Alsever
Filtrado de cólera	Sigma-Aldrich	C8772	Utilizado como enzima destructora de receptores (RDE)
PBS de Dulbecco	Sigma-Aldrich	D8537	Para diluir las muestras de suero, glóbulos rojos y antígenos
Eppendorf Pipeta multicanal, 12 canales, 10-100 y micro; l	Sigma-Aldrich	Z683949
Eppendorf Pipeta multicanal, 8 canales, 10-100 y micro; l	Sigma-Aldrich	Z683930
cobayo RBC (10%)	Cedarlán	CLC1800	10% de suspensión de glóbulos rojos de conejillo de indias en la solución de Alsever
Influenza Anti-A/California/7/09 HA suero	NIBSC	14/134	Se utiliza como control positivo en el ensayo HI
Suero de HA similar a Influenza Anti-A/Suiza/9715293/2013	NIBSC	14/272	Utilizado como control positivo en el ensayo HI
Influenza Anti-A/Texas/50/2012-Like HA Serum	NIBSC	13/178	Utilizado como control positivo en el ensayo HI
Influenza Anti-B/Brisbane/60/2008-HA serum	NIBSC	13/254	Se utiliza como control positivo en el ensayo HI
Influenza Anti-B/Massachusetts/02/2012 suero de HA	NIBSC	13/182	Utilizado como control positivo en el ensayo HI
Antígeno de influenza A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)	NIBSC	12/168	Inactivado, parcialmente purificado A/California/7/09 (H1N1)(NYMC-X181)  virus (ca. 46µ gHA/ml)
Antígeno de la gripe A/Suiza/9715293/2013 (NIB88)	NIBSC	14/254	Virus inactivado, parcialmente purificado A/Suiza/9715293/2013 (NIB88) (ca. 55µ gHA/ml)
Antígeno de influenza A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223)	NIBSC	13/112	Virus Inactivado, parcialmente purificado A/Texas/50/2012 (H3N2)(NYMCX-223) (ca. 74µ gHA/ml)
Antígeno de la gripe B/Brisbane/60/2008	NIBSC	13/234	Virus B/Brisbane/60/2008 inactivado y parcialmente purificado (ca. 42µ gHA/ml)
Antígeno de la influenza B/Massachusetts/02/2012	NIBSC	13/134	Virus inactivado, parcialmente purificado B/Massachusetts/02/2012 (ca. 35µ gHA/ml)
Tubos de suero	S-Monovette, Sardstedt	01.1601.100	Para la extracción de suero con activador de la coagulación
Glóbulos rojos humanos de donante único, tipo 0	Investigación innovadora	IPLA-WB3	Suspensión de glóbulos rojos humanos de un solo donante en solución de Alsever (aprox. 26%)
RBC de pavo (10%)	Cedarlán	CLC1180	10% de suspensión de glóbulos rojos de pavo en solución
salina tamponada con fosfato (PBS)	Gibco