Se describe un protocolo abreviado de fraccionamiento para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano Postmortem
En este artículo
Resumen
Resumen
En este estudio, se describe un protocolo abreviado fraccionamiento solo paso para el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de cerebro humano postmortem. El detergente iónico N-lauril-sarcosina (sarkosyl) efectivamente solubiliza proteínas forma nativa plegadas en el tejido cerebral que permite el enriquecimiento de los agregados de proteína insoluble en detergente de una amplia gama de proteinopatías neurodegenerativas, tales como Enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson y esclerosis lateral amiotrófica y enfermedades priónicas. Control humano y los tejidos del cerebro post mortem AD fueron homogeneizadas y sedimentados por ultracentrifugación en presencia sarkosyl enriquecer agregados de proteína insoluble en detergente incluyendo patológica tau fosforilada, el componente principal de ovillos enredos en AD. Western Blot demostró la solubilidad diferencial de agregados tau fosforilado y la proteína soluble en detergente, temprano Endosome antígeno 1 (EEA1) en control y el cerebro de AD. Análisis proteómico también revelaron enriquecimiento de β-amiloide (Aβ), tau, snRNP70 (U1 - 70 K) y apolipoproteína E (APOE) en las fracciones insolubles en sarkosyl de AD cerebral comparados con los de control, consistente con anteriores estrategias de fraccionamiento de tejido . Así, este Protocolo simple enriquecimiento es ideal para una amplia gama de aplicaciones experimentales que van desde borrar occidental y funcional de la proteína ensayos de agregación Co proteómica basada en espectrometría de masa.
Introducción
Enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer (EA), enfermedad de Parkinson (EP), enfermedad de Huntington (EH), esclerosis lateral amiotrófica (ELA) y las enfermedades de prión estrechamente relacionados son proteinopatías caracterizada por la acumulación gradual de agregados de proteína insoluble en detergente en el cerebro con el acompañamiento cognitivo disminución. 1 , 2 esta característica patológica común se cree que desempeñan un papel central en la etiología y la patofisiología de estas enfermedades neurodegenerativas. 2 estos agregados consisten en típicament....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
declaración de ética: todos los tejidos del cerebro fueron obtenidos de la Emory de Alzheimer ' s enfermedad investigación centro (ADRC) Banco de cerebros. Tejidos humanos post mortem fueron adquiridos bajo adecuados protocolos de la Junta de revisión institucional (IRB).
1. homogeneización y fraccionamiento
- selección de tejido
Nota: congelados de tejido post mortem corteza frontal de control sano (Ctl) y patológico casos confirmados de AD fueron seleccionados de la Emory Banco de cerebros ADRC (n = 2). Evaluación neuropathological post mortem de la distribución de la placa amiloide fue realiz....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El protocolo abreviado solo paso sarkosyl-fraccionamiento fue utilizado para enriquecer a agregados de proteína insoluble en detergente de control y cerebro post mortem AD (figura 1). Proteínas de fracciones TH S, S1, S2 y P2 fueron resueltas por SDS-PAGE, de 15 min en Coomassie azul fijador tampón seguido de tinción suave con tampón de tinción G-250 azul brillante de Coomassie. El paso de resuspensión es opcional puesto que había niveles indetectables de pro.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
En este documento presentamos y discutir un protocolo abreviado de detergente-fraccionamiento de solo paso que es aplicable a una amplia variedad de aplicaciones experimentales que van desde análisis de proteómica basada en espectrometría de masa al mal plegamiento de análisis funcional de la proteína y western blot. 5 , 6 , 7 , 10 esta metodología es más eficaz cuando se utiliza para el estudi.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a los Drs. Jim Lah y Allan Levey, Departamento de Neurología de Emory, para sugerencias y comentarios. Este trabajo fue financiado en parte por la Asociación de medicina acelerar concesión (U01AG046161-02), el Emory Alzheimer centro de investigación de la enfermedad (P50AG025688) y un Instituto Nacional del envejecimiento conceden (R01AG053960-01) a N.T.S. Esta investigación también fue apoyada en parte por el núcleo de la neuropatología de la donacion de Emory Neurociencia NINDS base instalaciones, P30NS055077.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa, sin EDTA (100X) | Thermo Fisher | 78441 | cóctel de inhibidores de proteasa y fosfatasa |
| Sistema de desmembración sónica (ultrasonidos) | Fisher Scientific | FB505110 | ultrasonido de micropunta |
| Ultracentrífuga Optimax TLX | Beckman Coulter | 361545 | ultracentrífuga refrigerada |
| Rotor TLA120.1 | Rotor de ultracentrífuga | Beckman Coulter | 362224 |
| 500 ul (8 x 34 mm) tubos de policarbonato, pared gruesa | Beckman Coulter | 343776 | para rotor TLA120.1 |
| Tampón de muestra 4X SDS | N/A | SDS-PAGE | |
| TCEP, pH neutro | Thermo Fisher | 77720 | agente reductor |
| (TBS) tampón de bloqueo | Thermo Fisher | 37542 | tampón de bloqueo |
| (TBS) tampón de bloqueo + 0,05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | tampón de bloqueo y diluyente |
| de anticuerpos 4-12% Bolt Bis-Tris Plus geles, 10 pocillos | Thermo Fisher | NW04120BOX | geles prefabricados SDS-PAGE |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE |
| sal sódica de N-laurolilsarcosina (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | Detergente |
| Anticuerpo anti-Tau-2 (pan tau) | Anticuerpos Chemicon | MAB375 | |
| Anticuerpo antifosfo-treonina 231 Tau | Anticuerpos Millipore | MAB5450 | |
| Antifosfo-seroína 202 y treonina 205 Anticuerpo Tau (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | |
| anticuerpos Anticuerpo anti-antígeno endosoma precoz 1 (EEA1) | abcam | Anticuerpos ab2900 | |
| Alexa Fluor 680 anticuerpo secundario IgG (H+L) anticuerpo secundario anti-ratón de cabra | Thermo Fisher | A21058 | |
| Alexa Fluor 790 anti-conejo anti-conejo anticuerpo secundario IgG (H+L) | Thermo Fisher | A11374 | |
| anticuerpos iBlot2 Sistema de transferencia en seco | Thermo Fisher | IB21001 | Transferencia |
| iBlot2 Pilas de transferencia, nitrocelulosa, mini | Transferencia de | IB23002 | Thermo Fisher Gel |
Referencias
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991(1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
