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Un método de aislamiento de grado clínico novedoso para Stromal células de riñón humano perivasculares

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DOI:

10.3791/55841

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7 de agosto de 2017

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1Department of Internal Medicine, Leiden University Medical Centre

En este artículo

Resumen

Aquí presentamos un método de aislamiento y de la cultura de grado clínico novela para riñón células estromales perivasculares (kPSCs) basado en perfusión de órgano entero con enzimas digestivas y células NG2 enriquecimiento. Con este método, es posible adquirir un número suficiente de células para terapia celular.

Resumen

Las células estromales mesenquimales (MSCs) son homeostáticos e inmune modulador las células del tejido que han mostrado efectos beneficiosos en enfermedades de riñón y trasplante. Células del estroma perivascular (PSCs) comparten características con médula MSCs (bmMSCs). Sin embargo, también poseen, probablemente debido a la impresión local, propiedades específicas de tejidos y juegan un papel en la homeostasis del tejido local. Esta especificidad de tejido puede resultar en la reparación de tejidos específicos, también en el riñón humano. Previamente demostramos que PSC de riñón humano (kPSCs) ha mejorado la riñón epitelial de cicatrización mientras que bmMSCs no tenía este potencial. Además, kPSCs puede mejorar lesiones de riñón en vivo. Por lo tanto, kPSCs constituyen una interesante fuente para terapia celular, particularmente para enfermedades renales y trasplante renal. A continuación os mostramos el método de aislamiento y cultura detallado para kPSCs de trasplante grado de riñones humanos basados en perfusión de órgano conjunto de enzimas digestivas a través de la arteria renal y el enriquecimiento para el marcador perivascular NG2. De esta manera, se pueden obtener cantidades grandes de la célula que son adecuados para la terapia celular.

Introducción

Las células estromales mesenquimales (MSCs) son células inmunes moduladores que fueron originalmente aisladas de la médula ósea. Se caracterizan por su eje en forma de morfología, capacidad de diferenciarse en grasa, hueso y cartílago y adhesión de plástico. MSCs expresan los marcadores estromales CD73, CD90, CD105 siendo negativa para los marcadores CD31 y CD451,2,3. MSCs están un candidato prometedor para la terapia celular debido a su tejido homeostático y capacidad inmunomoduladora. bmMSCs actualmente se están estudiando en ensayos clínicos para varias enfermedades, incluyendo enfermedades de riñón y trasplante de riñón como revisado en otra parte4.

Previamente fue demostrado que perivascular de las células de diferentes órganos sólidos, incluyendo el tejido adiposo, placenta y músculo esquelético comparten características con MSCs9. Sin embargo, estas células también presentan funciones específicas de tejidos que pueden resultar en organotypic reparación10. Las células perivasculares miocardio humano, por ejemplo, estimulan respuestas angiogénicos después de hipoxia y diferenciado en cardiomiocitos, mientras que las células perivasculares aisladas de otros tejidos no mostró estos potenciales11.

Las células del estroma perivascular también pueden ser aisladas del ratón12,13,14 y15,de riñón humano16. Ampliamente había caracterizado kPSCs y comparó a bmMSCs. Se encontró que kPSCs similares a bmMSCs, tienen capacidades inmunosupresoras y puede apoyar la formación del plexo vascular. Sin embargo, hay tejido las diferencias específicas entre los tipos de células, como demostrada una firma de expresión transcripcional organotypic, incluyendo los factores de transcripción nefrógeno HoxD10 y HoxD11 kPSCs. kPSCs, en contraste con bmMSCs, no se someten a transformación de miofibroblastos después del estímulo con TGF-β y eran incapaces de diferenciarse a adipocitos. Además, kPSCs había acelerado integridad epitelial en un ensayo cero riñón herida epitelial tubular, un fenómeno que no se observó con bmMSCs. Esta herida mayor reparación fue mediada a través de la liberación de factor de crecimiento hepatocito. Por otra parte, kPSCs mejoró la lesión renal en un modelo murino de lesión renal aguda15. Por lo tanto, kPSCs parecen tener capacidades de reparación renal superior y son una interesante fuente nueva para terapia celular en enfermedades renales.

Para poder utilizar kPSCs para fines de terapia celular, kPSCs deben aislarse de manera grado clínico con enzimas de grado clínico y protocolos. Por otra parte, para ser capaces de tratar a varios pacientes con kPSCs de 1 donante, debe obtenerse un número suficiente de células. A continuación os mostramos en detalle, el procedimiento de aislamiento de grado clínico de kPSCs de los riñones de trasplante de todo grado, produciendo un número suficiente de células para ser utilizado por clínica terapia celular.

Protocolo

El comité de ética médica local y el consejo asesor de ética del consorcio europeo (STELLAR) aprobaron la investigación y la recolección de riñones de grado de trasplante humano descartados principalmente por razones quirúrgicas. Se dio el consentimiento para la investigación de todos los riñones.

1. Preparaciones para el cultivo celular

  1. Prepara un pool de lisados de plaquetas.
    1. Almacene las plaquetas que hayan caducado durante menos de 2 días a -80 °C hasta su uso (durante un máximo de 1 año).
      NOTA: Las plaquetas se obtuvieron originalmente de un proveedor comercial. Se obtuvo material excedente hospitalario distribuido por el banco de sangre local.
    2. Descongelar las plaquetas de al menos 5 donantes (preferiblemente 10) O/N a 4 °C.
    3. Agrupe las plaquetas en un frasco estéril grande, transfiéralas a tubos de centrífuga cónicos y centrifuga durante 10 min a 1.960 x g a 4 °C.
      NOTA: El volumen de plaquetas depende del número de donantes y de la cantidad de material excedente hospitalario por donante.
    4. Pipetear el sobrenadante en bolsas de sangre (50 mL/bolsa) a través del cilindro de una jeringa de 50 mL. Conservar a -80 °C.
  2. Preparación del medio de cultivo celular.
    1. Descongelar una bolsa de lisados de plaquetas en un baño de agua a 37 °C.
    2. Agregue 1 L (es decir, 2 botellas) de Medio Esencial Mínimo - Modificación alfa (alphaMEM), 5 mL de 200 mM de glutamina y 20 mL de penicilina (5,000 U/mL)/estreptomicina (5,000 μg/mL) (pluma/estreptococo) a la bolsa.
    3. Incubar durante 3 h a 37 °C.
    4. Agite la bolsa para desgelificarla golpeando suavemente la bolsa cuando la bolsa esté apoyada sobre una superficie plana.
    5. Filtre el medio de lisado de plaquetas al 5% tirando de los lisados a través del filtro del sistema de transfusión con una jeringa estéril de 50 mL.
    6. Alicube el medio en tubos de 50 mL y almacene a -80 °C hasta su uso.
      NOTA: Cada nuevo lote de lisados de plaquetas se prueba en cultivo celular y se compara con el lote anterior mediante el crecimiento de células de interés (bmMSCs o kPSCs) hasta la confluencia en ambos lotes. En cuanto al número de células y la viabilidad, las kPSCs o bmMCs cultivadas en el nuevo lote no deben diferir más del 10%, y la expresión de marcadores de CD73, CD90, CD105 y CD31, CD34 y CD45 analizada por citometría de flujo no debe diferir. Los métodos de cultivo celular se describen en la sección 6 del protocolo (Cultivo de kPSC).

2. Preparativos para la recolección de células

  1. Preparación de soluciones.
    1. Prepare el medio simple agregando 10 mL de pluma/estreptococo a 500 mL (1 botella) de Medio Esencial Mínimo (DMEM)-F12 de Dulbecco.
    2. Prepare el medio de lavado añadiendo 50 mL de Suero Humano Normal (NHS) y 10 mL de pluma/estreptococo a 1 frasco de DMEM-F12.
    3. Prepare el tampón enzimático añadiendo 2,9 mL 1 M de ácido 4-(2-hidroxietil)-1-piperazinenetanosulfónico (HEPES), 1,2 mL de NaHCO3 2,5% [p/v] y 160 μL de CaCl2 (1 M) a 160 mL de solución de la Universidad de Wisconsin.
    4. Prepare la solución de colagenasa añadiendo lentamente 20 mL de tampón de reserva enzimática al frasco de colagenasa de grado GMP que contiene >2,000 U/botella de colagenasa. Disolver a 4 °C durante aproximadamente 40 min. Agite suavemente varias veces durante el período de disolución.
    5. Prepare el medio de congelación agregando 5 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) a 45 mL de NHS.
  2. Preparación de la bandeja de perfusión (Figura 1A).
    1. Limpie la cabina de flujo y cúbrala con paños quirúrgicos. Calentar un baño de agua a aproximadamente 40 - 45 °C para calentar la bandeja de perfusión a 37 °C. Póngase batas quirúrgicas y guantes quirúrgicos.
    2. Conecte una bandeja de perfusión esterilizada al baño de agua para precalentar la bandeja de perfusión con agua tibia. Asegúrese de que no haya aire en la bandeja de perfusión comenzando con la bandeja de perfusión en posición vertical. Si es necesario, agregue más agua al baño de agua para evitar la infusión de aire en la bandeja de perfusión.
    3. Coloque el tubo LS25 en la bomba. Deje ambos extremos estériles del tubo en la cabina de flujo. Coloque una pinza de Kocher en un extremo del tubo y déjela reposar en la parte inferior de la bandeja de perfusión. Coloque una gasa estéril en la parte superior del tubo para evitar la obstrucción. Conecte un conector Luer en el otro extremo del tubo.
    4. Agregue aproximadamente 100 mL de medio simple en la bandeja de perfusión y comience a lavar el tubo a una velocidad de bombeo de 100 mL/min.

3. Aislamiento de células renales

  1. Preparación del riñón.
    1. Retire el riñón de las bolsas estériles dobles y colóquelo en la bandeja de perfusión estéril (Figura 1B). Retire el tejido adiposo perirrenal y la cápsula renal con unas tijeras y un lagrimeo suave (Figura 1C) e identifique la arteria renal en el parche aórtico como se muestra en Figura 1D.
    2. Cánula la arteria renal con la espiga accesoria, fíjela con un tirante esterilizado y conéctela al extremo del tubo de la bomba con el conector Luer mientras la bomba está encendida. Si los tubos no están completamente llenos, primero agregue más medio a la bandeja y enjuague los tubos encendiendo la bomba (Figura 1E - F). Enjuague el riñón con medio corriente a través de la bomba con un flujo de 100 mL/min.
  2. Tratamiento con colagenasa y aislamiento de células renales.
    1. Añadir colagenasa (20 mL, >2.000 U) y DNasa (2,5 mL, 1 mg/mL) a la bandeja de perfusión (Figura 1G). Gire el riñón de vez en cuando suavemente con la mano. Espere hasta que el riñón se ablande y el líquido de perfusión se vuelva menos transparente (aproximadamente 30 a 40 min).
    2. Masajear suavemente el riñón (Figura 1H) hasta obtener una suspensión celular (Figura 1I). Eliminar el material no digerido y la espiga en la arteria renal.
  3. Lavado y recolección de células renales.
    1. Agregue 50 mL del NHS a la suspensión celular. Drene la suspensión celular de la bandeja de perfusión colocando la bomba a bajo caudal y colocando el tubo conectado primero al riñón por encima de los tubos de 50 mL (Figura 1J).
    2. Centrifugar a 300 x g durante 7 min a 4 °C y retirar el sobrenadante. Lave los pellets con un medio de lavado que contenga un 10% de NHS y vuelva a centrifugar a 300 x g durante 7 min. Repita el lavado una vez más. Mida el volumen de los gránulos celulares y agregue un volumen igual de medio de cultivo celular.
    3. O bien criopreservar las células desde aquí añadiendo medio de congelación 1:1 a la suspensión celular y almacenarlas en viales criogénicos de acuerdo con los protocolos estándar, o bien continuar cultivando las células (sección 4).
      NOTA: La suspensión celular contiene grupos celulares y requiere pasos adicionales para obtener células individuales, lo que resulta en un aumento en la muerte celular. Por lo tanto, las células se mantienen en suspensión y no se cuentan en esta etapa.

4. Cultivo celular de células renales crudas

  1. Añadir aproximadamente 1 mL de la suspensión celular a 24 mL de lisados de plaquetas alphaMEM al 5% (medio de cultivo celular) en un matraz de cultivo celular T175 (Figura 1K) y cultivar a 37 °C, 5% CO2. Retire el medio y los restos celulares después de 2 días de las células adherentes y refresque el medio con 25 mL de medio de cultivo celular.
  2. Refresque el medio de cultivo dos veces por semana retirando la mitad del medio (12,5 mL) y añadiendo medio fresco (12,5 mL) utilizando técnicas asépticas.
  3. Cultivo hasta que confluente (generalmente 5 - 7 d) (Figura 1L). Retirar el medio, lavar dos veces con PBS y tripsinizar las células añadiendo 5 mL de tripsina a cada matraz T175 durante 5 min a 37 °C. Lavar en medio de cultivo y centrifugar a 490 x g durante 5 min y retirar el sobrenadante.

5. Enriquecimiento celular para NG2 por separación magnética de células (Figura 1M)

  1. Prepare el tampón de separación de celdas de acuerdo con el protocolo del fabricante.
  2. Vuelva a suspender las kPSC tripsinizadas en un tampón de separación celular de 10 mL. Centrifugar a 490 x g durante 5 min, desechar el sobrenadante y volver a suspender las células en un tampón de separación celular de 300 μL.
  3. Añadir 100 μL de regeneración bloqueante de FcR/5 x 107 células, añadir 100 μL de gránulos anti-melanoma (NG2) por cada 5 x 107 células, e incubar durante 30 min a 4 °C. Separar la fracción NG2-positiva según el protocolo del fabricante. Añadir 10 mL de medio y centrifugar las celdas durante 5 min a 490 x g.
  4. Cuente las células utilizando una cámara de recuento Bürker de acuerdo con el protocolo del fabricante. Siembre las células en un matraz de cultivo (aproximadamente 4 x 103 células/cm2) e incube.
    NOTA: Siembre las células en las siguientes concentraciones: <250.000 en un matraz T25, 250.000 - 500.000 en un matraz T75 y 700.000 - 800.000 en un matraz T175. Después del enriquecimiento de células magnéticas, se aísla una fracción positiva de aproximadamente 1 - 2%. Sin embargo, como este paso es el enriquecimiento celular y no la clasificación celular, otros tipos de células estarán presentes en el cultivo (Figura 1N). Después de varios pasos (generalmente alrededor de 4 - 5), solo está presente una población homogénea de kPSC (Figura 1P).

6. Cultura de las kPSCs

  1. Refresque el medio dos veces por semana retirando la mitad del medio y reemplácelo con medio de cultivo recién descongelado (Figura 1N).
    NOTA: Las kPSCs tienden a ser más viables y proliferativas cuando solo se refresca la mitad del medio.
  2. Paso de kPSCs.
    NOTA: Pase las kPSCs a una confluencia del 90 al 100%, o cuando aparezcan estructuras 3D (ver Figura 1O), o cuando no haya habido crecimiento celular durante más de una semana. Los dos últimos, en particular, podrían ocurrir en los primeros pasajes después del enriquecimiento celular. En este caso, después del paso, las células generalmente comenzarán a crecer nuevamente en cultivo monocapa (Figura 1P).
    1. Retire el medio de las células confluentes del 90 al 100% (guarde el medio para su uso posterior). Lave el matraz dos veces con PBS (1 mL en T25, 5 mL en T75, 10 mL en T175). Añadir tripsina (0,5 mL en T25, 2 mL en T75, 5 mL en T175) e incubar durante 5 min a 37 °C. Añadir el medio viejo al matraz y volver a suspender suavemente.
    2. Transfiera a un tubo de 15 o 50 ml (dependiendo del volumen) y centrifugue a 490 x g durante 5 min. Cuente las células viables y la placa <250.000 en un T25, 250.000 - 500.000 en un T75, o 700.000 - 800.000 en un T175 (aproximadamente 4 x 103 células/cm2).
  3. Pruebe las kPSC en el pasaje 5 o 6 (p. ej., ensayo de rasguño, sección 7).
    NOTA: Caracterice las células propagadas por citometría de flujo utilizando protocolos estándar. La expresión de marcadores de NG2, PDGFR-β, CD146, CD73, CD90, CD105, HLA-ABC deben ser todos positivos y CD31, CD34, CD45 y HLA-DR deben ser negativos. Prueba de micoplasma, bacterias y hongos en el medio de cultivo de acuerdo con los protocolos estándar del laboratorio de microbiología clínica. Pruebe las kPSC funcionalmente en un ensayo de raspado de herida epitelial renal. Los experimentos se realizan generalmente con poblaciones de kPSC homogéneas estériles, confirmadas por citometría de flujo, con capacidad de cicatrización de heridas entre el pasaje 6-8.
  4. Criopreservar las kPSCs mediante la adición de 0,5 mL de medio de criopreservación a 0,5 mL de suspensión celular (2 millones de células por mL de medio de cultivo) utilizando protocolos estándar.
    NOTA: Después de descongelar, siembre las kPSC a una densidad más alta (106 celdas en un T175).

7. Prueba funcional de kPSCs: Ensayo de rasguño de herida epitelial renal

  1. Cultive las kPSC en una placa de 6 pocillos a una densidad de 200.000 células/pocillo en un medio de cultivo de 2 mL. Después de 48 h de cultivo a 37 °C, 5% de CO2, recoger el sobrenadante. Este es el medio condicionado.
  2. Siembre el HK-2 (células epiteliales tubulares proximales)17 en 2 mL de medio de células epiteliales tubulares proximales (PTEC) que consiste en una proporción 1:1 de DMEM-F12 suplementado con insulina (5 mg/mL), transferrina (5 mg/mL), selenio (5 ng/mL), hidrocortisona (36 ng/mL), triyodotironina (40 pg/mL), factor de crecimiento epidérmico (10 ng/mL) y pen/estreptococo, en una densidad de 500.000 células por pocillo en una placa de cultivo celular de 6 pocillos.
  3. Cultivo durante 48 h a 37 °C, 5% CO2. Retire el medio de cultivo celular de los HK-2 y cree una herida por rasguño en la monocapa de los HK-2 haciendo un rasguño con la punta de una pipeta amarilla desde la parte superior hasta la parte inferior del pocillo. Lave los HK-2 con PBS y agregue el medio acondicionado de los kPSC o medio de control. Marque en la parte inferior de la placa el área que se va a fotografiar.
    NOTA: Los HK-2 deben ser confluentes. Imagine dos áreas por pozo.
  4. Visualice el arañazo a las 4, 8, 12 y 24 h en la misma posición marcada con un microscopio de campo claro invertido.
  5. Mida el área de rayado en la imagen J utilizando la herramienta de selección de polígonos para determinar el porcentaje de cierre.

Resultados

El método de aislamiento de kPSCs de grado clínico se resume en la figura 1. Las células del riñón crudo están aisladas de trasplante humano riñones de grado por perfusión de colagenasa. La suspensión resultante se cultiva hasta confluentes en los lysates de plaquetas de 5%. Entonces la fracción de células estromales perivasculares aislada basados en la expresión de NG2.

kPSCs plástico adherente en forma de huso de las células (figura 2A) y son positivos para los marcadores estromales marcadores CD73, CD90, CD105 y perivascular NG2, PDGFR-B y CD146, mientras que la negativa para CD31 y CD34, CD45, HLA-DR (figura 2B). Por lo general, una población homogénea de kPSCs puede ser alcanzada en el paso 4 y kPSCs llegar a la Senectud en el paso 9 y 10 (figura 2C). Por lo tanto aconsejamos realizar experimentos entre el pasaje 5-8.

Para evaluar la capacidad funcional de la kPSCs aisladas, realizamos un en vitro riñón epitelial de la herida rasguño ensayo en cada lote nuevo de kPSCs, como hemos demostrado anteriormente que el medio condicionado de kPSCs puede acelerar la cicatrización epitelial en este ensayo scratch15. El medio condicionado kPSC realiza cultivo kPSCs durante 48 h en alphaMEM 5% plaquetas lisados y recoger el sobrenadante. A continuación, el riñón humano inmortalizado proximal túbulo células epiteliales (HK-2)17 se cultivan hasta confluentes y entonces se hace una herida arañazo. Ya sea el medio condicionado de medio kPSCs o control se agrega a los pozos y se mide la velocidad de cicatrización de la herida. Cuando se agrega el medio condicionado de kPSCs, la herida cierra mucho más rápido (figura 2D).

figure-results-1
Figura 1 : KPSCs grado clínico de la método de aislamiento humano. Trasplante de riñones de grado son canulados y perfundidos con colagenasa vía la arteria renal (A - G) y la suspensión resultante se lava y ya sea congelados o poner en cultura (H - K). Después las células llegar a confluencia (L), NG2 enriquecimiento celular es realizar (M). Las células se tripsinizaron cuando cualquiera son confluente, han dejado de proliferar o cuando las estructuras 3D aparecen (N - P). Los criterios de liberación de kPSCs son la esterilidad, de expresión de marcador y la capacidad para mejorar la cicatrización de la herida epitelial tubular (Q). Flecha: arteria renal. Barra de escala = 200 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

figure-results-2
Figura 2: kPSCs caracterización de humanos. Un) kPSCs son células fusiformes, plástico adherentes. B) kPSCs son positivas para marcadores mesenquimales CD73, CD90, CD105, marcadores perivascular NG2, PDGFR-β y CD146, mientras que la negativa para CD31, CD34 y CD45. kPSCs expresar MHC clase I (HLA-ABC), pero no clase II (HLA-DR). C) características de crecimiento de tres donantes diferentes kPSC de citometría de flujo confirmaron homogénea NG2 positivo las poblaciones (paso 4). kPSCs llega a la senescencia en el paso 9 y 10. KPSCs D) son capaces de mejorar la reparación epitelial de riñón en un ensayo de rayado de herida. Imágenes representativas del medio de control y kPSC acondicionado medio en t = 0, 4, 8 y 12 h. Barra de escala en la A) = 200 μm, D) = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

Células perivasculares se han aislado de muchas diferentes sólidos los órganos humanos, como páncreas, grasa, cartílago y el riñón9,15,16. Mayoría de los métodos, sin embargo, se basa en pequeñas muestras de tejido, que son disecados y luego tratados con enzimas digestivas. Por otra parte, esto generalmente no se realiza con productos de grado clínico. Esto hace que estas estrategias menos conveniente para la traducción clínica directa donde son necesarias grandes cantidades de células de tipo clínico.

A continuación os mostramos un método de aislamiento novela de kPSCs humano de órganos enteros basados en perfusión con enzimas de grado clínico y materiales. El protocolo se adapta el protocolo de aislamiento clínico islotes de Langerhans actualmente en uso para su aplicación clínica en nuestro centro18.

Este es el primer grado clínico donde grandes cantidades de kPSCs pueden ser alcanzadas. La variabilidad en el rendimiento de la célula es en gran parte dependientes de donantes. Sin embargo, cuando el rendimiento celular que actualmente obtenemos de una fracción de la suspensión celular crudo de tres diferentes donantes se extrapola, en teoría, podría lograrse un rendimiento promedio de 2.7 x 1012 kPSCs por donante. Como terapia MSC consiste en típicamente 2 infusiones de células con 1-2 x 106 células/kg peso corporal4, estos números de celular son suficientes para alógeno tratamiento de varios pacientes.

Un paso crítico en el procedimiento de aislamiento es la duración de la digestión de la colagenasa. Cuando el período de digestión es demasiado corto, se mantendrá grumos grandes de tejido, que será más difícil a la cultura. Cuando el período de perfusión es demasiado largo, se puede observar la muerte creciente de la célula. Por lo tanto, tan pronto como el riñón empieza a ser suave y los fluidos menos transparentes, el riñón se debe masajear suavemente y debe suspenderse el tratamiento de la colagenasa.

Otro paso fundamental es el cultivo de las células después de enriquecimiento de células NG2. A veces tras el enriquecimiento de células NG2, las células perivasculares no empiece a proliferar o comienzan a crecer en las estructuras 3D. En este caso, cuando las células se tripsinizaron y resembraron, las células generalmente comenzará a crecer en cultivo monocapa.

Como material de partida, se utilizaron riñones de grado humano trasplante descartados por razones quirúrgicas. Estos son órganos funcionales sin fibrosis importante. Reconocemos que esto puede ser una limitación ya que este es un relativamente raro y difícil de obtener fuente de órganos. Los riñones explanted podrían ser otra fuente; sin embargo, dependiendo de la razón de la explantación de riñón, estos riñones pueden contener más fibrosis y miofibroblastos, y por lo tanto debe tenerse cuidado puesto que myofibroblasts podría aislado y cultivado en vez de células perivasculares.

El kPSCs aislado con este espectáculo de protocolo propiedades organo-typic con riñón epitelial habían herida curación capacidades15, terapia celular con kPSCs en enfermedades del riñón y trasplante sería una aplicación interesante en el futuro. Para ello, existen varias estrategias de entrega del producto celular de la célula. La primera estrategia es la infusión IV de kPSCs, como se utiliza actualmente en los estudios clínicos de bmMSC. Otra aplicación interesante es el uso de kPSCs o factores kPSC excreta en perfusión máquina antes del trasplante. De esta manera, podría mejorar la calidad del riñón explanted que podría conducir a función renal mejorada después del trasplante. Ambas estrategias de kPSCs son una fuente interesante de celular nuevo para explorar más a fondo para los propósitos clínicos.

Divulgaciones

D.G.L., M.A.E., y T.J.R. se asocian con una solicitud de patente con respecto a esta investigación. Otros autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación ha recibido financiación de séptimo programa de la Comunidad Europea marco (FP7/2007-2013) bajo la concesión número de acuerdo 305436 estelar.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bolsas BaxterFenwalR4R-7004
Plaquetas humanasSanquinmaterial excedente hospitalario caducado por menos de 2 d se utiliza
lisadohecho a medida
Frascos estériles desechablesCorning09-761-11
500 mL Tubos de centrífuga PPCorning431123
a-MEM medianoLonzaBE12-169F
glutamaxthermo fisher35050038
pluma/estreptococo de 15070063
Codan455609
DMEM-F12tecnologías de la vida11320-074
Suero humano normal (NHS)Sanquin
Hepes 1 MLonzaBE-17-737E
NaHCO3 7.5%LonzaBE17-613E
CaCl< sub>2 1 MSigma-Aldrich10043-52-4
UWPuente a la vida32911
HeparinaLeo Pharma
colagenasa NB1 Grado GMPSERVA17455.03
DMSOSigma AldrichD2650-100ml
paños quirúrgicos3M NederlandDH999969404
bomba de perfusiónMetrohmX007528300
cabezal de bombaMetrohmX077202600
bandejamedida
LS25 Tubos Masterflex MasterflexHV-96410-25
espiga accesoriaGambro DASCO 6038020
pulmozymeMatraces de cultivo Roche
25 cm2Greiner690175
matraz de cultivo 75 cm2greiner658170
matraz de cultivo 175 cm2greiner661160
TripsinaSigmaT4174
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA2153
EDTASigma-AldrichE5134-500g
FcR reactivo bloqueantemiltenyi130-059-901
perlas anti melanoma (NG2)miltenyi130-090-452
filtro de células 70 y micro; mCorning352350
LS columnasMiltenyi130-042-401
MACS imánmiltenyi130-090-976
CD34 FITCBD 
CD45 APCBD 
CD146 PEBD 
NG2 APCR& DFAB2585A
CD90 PEBD 
HLA ABC APCBD 
CD105 FITCAncell326-040
HLA DR APCBD 
CD56 PEBD 
CD73 PEBD 
CD31 FITCBD 
CD133 PEmiltenyi130-090-853
PDGF-r R& Dmab 1263
ratón IgG1 FITCBD 
ratón IgG1 PEBD 
ratón IgG1 APCBD 
IgG2b PEBD 
cabra anti ratón PEDakoR0480
azida sódicaMerck822335
DMEM Jamón' s F12Gibco31331-028
ITS (insulina, transferrina, selenio)SigmaI1884
hidrocortisonaSigmaH0135
triyodotirinaSigmaT5516
Factor de crecimiento epidérmico (EGF)sigmaE9644
PTEC renal humano inmortalizado (HK2)cortesía de M. Ryan, Colegio universitario de Dublín
de plaquetas Sistema de transfusión Invitrogen de perfusión a 555821555485550315555596555555559866555516550257555445345815345816345818555743

Referencias

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